041] 分批培養(yǎng)中的指數(shù)牛長(zhǎng)
[0042] 本文中"代"的定義是酵母生物質(zhì)的加倍。生物質(zhì)的量的加倍可通過給定時(shí)間的 Cx (生物質(zhì)濃度）描述，Cx通過下述方程被給出：
[0043] Cx(t) = (方程 1)
[0044] 可以通過代入Cx(t) = 2*Cx(0)由所述方程得到加倍時(shí)間（Td，以小時(shí)計(jì)）或傳代 時(shí)間（Tg，以小時(shí)計(jì)）。
[0045] Td = LN (2) / y (hr)(方程 2)
[0046] 其中，y =以g生物質(zhì)/g生物質(zhì)/h或1/h為單位的比生長(zhǎng)速率。
[0047] 可通過多種手段測(cè)量生物質(zhì)生長(zhǎng)速率：可通過使用任何下述方法或合適的替代性 方法來測(cè)定每重量或體積單位的培養(yǎng)物的細(xì)胞量從而分析生物質(zhì)量的增加：
[0048] ?濁度
[0049] ?培養(yǎng)物在可見光譜（通常范圍：600nm-700nm)中的光密度
[0050] ?離心后的沉淀體積
[0051] ?在105°C下恒重干燥后的干重含量
[0052] ?每體積的細(xì)胞計(jì)數(shù)（通過顯微鏡）
[0053] ?涂布在固體瓊脂培養(yǎng)基上并在平板上從單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)成菌落后的菌落形成單位 (CFU/ml)
[0054] 或者，可以由從閉合反應(yīng)器體系中測(cè)量到的代謝活性來得到生物質(zhì)的量，例如：
[0055] ?二氧化碳產(chǎn)生速率（CPR二氧化碳產(chǎn)生速率或者CER二氧化碳釋放速率，通常被 表示為 mmol C02/L/hr)
[0056] ?氧消耗速率（OUR攝氧速率，mmol 02/L. hr)
[0057] ?底物攝取速率（rs =以g/L. hr計(jì)的底物攝取速率，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或氨 的攝取速率）
[0058] 當(dāng)在指數(shù)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（沒有營(yíng)養(yǎng)限制且沒有形成有毒產(chǎn)物）中相對(duì)于時(shí)間標(biāo)繪 Ln(Cx)或LN(CPR)、LN(0UR)或LN(rs)或時(shí)，獲得了斜率為比生長(zhǎng)速率y的直線。利用y 和方程2,能夠計(jì)算出加倍時(shí)間；利用生長(zhǎng)時(shí)間，能夠計(jì)算出加倍的量或代數(shù)。
[0059] 非指數(shù)牛長(zhǎng)
[0060] 在非指數(shù)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（例如恒定進(jìn)料的補(bǔ)料分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵）中，通過計(jì)算下 述來判斷代的量
[0061] Mx = Cx*體積（以g/L計(jì)的生物質(zhì)濃度*在gr生物質(zhì)中產(chǎn)生的培養(yǎng)液的升數(shù)） (方程3.)
[0062] 得到總CFU的g干重中酵母生物質(zhì)的總質(zhì)量（=CFU/ml*產(chǎn)生的培養(yǎng)物的ml數(shù)， 或者0D*vol)。
[0063] Mx的兩倍增加表示一代。
[0064] 非指數(shù)生長(zhǎng)的原理也可適用于上述指數(shù)生長(zhǎng)體系。
[0065]在步驟e)中，充分繁殖之后，酵母可從反應(yīng)器中分離或者作為全培養(yǎng)液供給乙醇 發(fā)酵反應(yīng)器。這些步驟可以以常規(guī)方式被執(zhí)行。在一種實(shí)施方式中，繁殖的酵母的一部分 被再循環(huán)至繁殖器中。
[0066] 酵母菌群
[0067] 初始酵母菌群應(yīng)該具有合適的大小，這取決于繁殖反應(yīng)器的大小和反應(yīng)器中可利 用的碳源的量。在一種實(shí)施方式中，初始酵母菌群可來源于合適酵母菌株的純凈培養(yǎng)管或 冷凍小瓶。純凈培養(yǎng)管或冷凍小瓶可被用作預(yù)-純凈培養(yǎng)罐（其中種子在嚴(yán)格無菌條件下 于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的小壓力容器）的接種物。生長(zhǎng)之后，將該容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至較大的純 凈培養(yǎng)反應(yīng)器中，在所述反應(yīng)器中通氣并再次在無菌條件下進(jìn)行繁殖。將長(zhǎng)成的細(xì)胞從純 凈培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移至一系列逐步增多的種子和半-種子繁殖器中。這些早期階段作為分批發(fā) 酵進(jìn)行。
[0068] 在一種實(shí)施方式中，酵母能夠代謝有機(jī)酸，優(yōu)選地代謝乙酸。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：酵母 (尤其是S.cerevisiae)能夠消耗乙酸和其它有機(jī)酸，如果它們以低濃度（例如5g/l或更 低，4g/l或更低，3g/l或更低，2g/l或更低，lg/1或更低，或0. 5g/l或更低）存在且僅當(dāng)糖 和其它碳源已被耗盡時(shí)。
[0069] 在繁殖方法中被用作初始酵母菌群的酵母可以是（基因工程）酵母?；蚬?程將在下文中更詳細(xì)描述。酵母在本文中被定義為：真核微生物，其包括主要以單細(xì)胞 形式生長(zhǎng)的 Eumycotina 亞門的所有物種（Alexopoulos, C. J.，1962, In: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc. , New York)
[0070] 酵母可通過單細(xì)胞菌體的出芽生長(zhǎng)或者可通過生物體的分裂生長(zhǎng)。作為酵母的優(yōu) 選酵母可屬于 Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、 Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces或Yarrowia屬。優(yōu)選地，酵母能夠厭氧發(fā)酵，更優(yōu) 選地能夠厭氧乙醇發(fā)酵。在一種實(shí)施方式中，酵母是Saccharomyces cerevisiae。
[0071] 在一種實(shí)施方式中，酵母是工業(yè)酵母。工業(yè)酵母細(xì)胞可被定義如下。工業(yè)方法中 酵母細(xì)胞的生存環(huán)境與實(shí)驗(yàn)室中的生存環(huán)境顯著不同。工業(yè)酵母細(xì)胞必須能夠在多種環(huán) 境條件下表現(xiàn)優(yōu)異，所述環(huán)境條件可在方法期間變化。所述變化包括營(yíng)養(yǎng)物來源、PH、乙醇 濃度、溫度、氧濃度等的改變，它們共同潛在影響Saccharomyces cerevisiae的細(xì)胞生長(zhǎng)和 乙醇生產(chǎn)。在不利的工業(yè)條件下，環(huán)境耐受菌株應(yīng)該允許強(qiáng)健的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。工業(yè)酵母菌 株通常對(duì)這些可出現(xiàn)在使用它們的應(yīng)用（例如烘烤工業(yè)、釀造工業(yè)、釀酒和乙醇工業(yè)）中 的環(huán)境條件變化更強(qiáng)健。工業(yè)酵母（S. cerevisiae)的實(shí)例是基因工程的Ethanol Red? (Fermentis) Fermio丨<X*SM)和Thermosacc? (Lallemand)。在一種實(shí)施方式中，酵母 有抑制劑耐受性?？赏ㄟ^篩選在含抑制劑的材料上生長(zhǎng)的菌株來選擇抑制劑耐受性酵母 細(xì)胞，例如 Kadar 等人，Appl. Biochem. Biotechnol. (2007)，136-140 卷，847-858 頁中所闡 釋，其中抑制劑耐受性S. cerevisiae菌株ATCC 26602被選擇。RN1016是來自DSM, Bergen op Zoom,荷蘭的發(fā)酵木糖和葡萄糖的S. cerevisiae菌株。
[0072] 在一種實(shí)施方式中，酵母能夠轉(zhuǎn)化己（C6)糖和戊（C5)糖。在一種實(shí)施方式中，酵 母能夠厭氧發(fā)酵至少一種C6糖和至少一種C5糖。例如，除了厭氧發(fā)酵葡萄糖之外，酵母 能夠利用L-阿拉伯糖和木糖。在一種實(shí)施方式中，酵母能夠?qū)-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-核 酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或轉(zhuǎn)化為期望的發(fā)酵產(chǎn)物，例如轉(zhuǎn)化為乙醇?？赏ㄟ^引入 來自合適來源的araA(L_阿拉伯糖異構(gòu)酶）、araB(L-ribuloglyoxalate)和araD(L_核酮 糖-5-P4-差向異構(gòu)酶）基因來修飾宿主酵母從而產(chǎn)生能夠從L-阿拉伯糖生產(chǎn)乙醇的生物 體（例如S. cerevisiae菌株）?？上蛩拗骷?xì)胞中引入所述基因以使它能夠利用阿拉伯糖。 W02003/095627中描述給出了這種方式。可以使用來自Lactobacillus plantarum的araA、 araB和araD基因，其被公開于W02008/041840中。可以使用來自Bacillus subtilis的 araA基因和來自Escherichia coli的araB和araD基因，其被公開于EP1499708中。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，如W02009011591中所公開，araA、araB和araD基因可來源于Clavibacter、 Arthrobacter 和 / 或 Gramella 屬中的至少一種，特別地 Clavibacter michiganensis、 Arthrobacter aurescens和/或Gramella forsetii中的至少一種。在一種實(shí)施方式中， 酵母還可包含木糖異構(gòu)酶基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝或木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶的一 個(gè)或多個(gè)拷貝。
[0073] 酵母可包含一種或多種遺傳修飾以允許酵母發(fā)酵木糖。遺傳修飾的實(shí)例是引入一 個(gè)或多個(gè)xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因，缺失醛糖還原酶（GRE3) 基因，過表達(dá)PPP-基因TALI、TKL1、RPE1和RKI1以允許細(xì)胞中通過戊糖磷酸途徑的流量 (flux)增加?；蚬こ探湍傅膶?shí)例被描述于EP1468093和/或W02006009434中。如圖1 中所示，這種酵母展示出特定的碳源利用偏好；葡萄糖首先被攝取并被轉(zhuǎn)化為酵母生物質(zhì) 和副產(chǎn)物，最主要是乙醇