用于治療、預(yù)防或緩解疼痛的融合蛋白和方法
【專利說明】用于治療、預(yù)防或緩解疼痛的融合蛋白和方法
[0001] 本發(fā)明涉及非細(xì)胞毒性融合蛋白及其作為止痛分子的治療性應(yīng)用。
[0002] 根據(jù)毒素對(duì)目標(biāo)分子的作用類型，通?？蓪⒍舅胤譃閮山M。具體而言，第一組毒素 殺死其天然目標(biāo)細(xì)胞并因此稱為細(xì)胞毒性毒素分子。該組毒素的示例包括植物毒素（如蓖 麻毒蛋白和相思豆毒蛋白）和細(xì)菌毒素（如白喉毒素和假單胞菌外毒素A)。細(xì)胞毒性毒素 受到了用于治療細(xì)胞疾病和病癥（如癌癥）的"魔術(shù)彈"設(shè)計(jì)（例如免疫偶聯(lián)物，其包含細(xì) 胞毒性毒素組分和結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞上特定標(biāo)記的抗體）的大量關(guān)注。細(xì)胞毒性毒素通常通過 抑制細(xì)胞的蛋白合成過程殺死其目標(biāo)細(xì)胞。
[0003] 第二組毒素稱為非細(xì)胞毒性毒素，顧名思義，這類毒素不會(huì)殺死其天然目標(biāo)細(xì)胞。 與細(xì)胞毒性毒素相比，非細(xì)胞毒性毒素受到的商業(yè)關(guān)注較少，并通過抑制除蛋白合成以外 的細(xì)胞過程來發(fā)揮其對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的作用。非細(xì)胞毒性毒素由多種植物和多種微生物（梭菌 屬（Clostridiumsp.)和奈瑟球菌屬（Neisseriasp.))產(chǎn)生。
[0004] 梭菌神經(jīng)毒素是通常具有150kDa分子量的蛋白。其由多種細(xì)菌生產(chǎn)，特別是屬于 梭菌屬的細(xì)菌，最重要的是破傷風(fēng)梭菌（C.tetani)和肉毒梭菌（C.botulinum)、丁酸梭菌 (C.butyricum)和阿根廷梭菌（C.argentinense)的幾種菌株。存在8種不同類型的梭菌神 經(jīng)毒素，即破傷風(fēng)毒素，和肉毒菌神經(jīng)毒素的血清型A、B、Cl、D、E、F和G，且其都共有類似 的結(jié)構(gòu)和作用模式。
[0005] 梭菌神經(jīng)毒素代表非細(xì)胞毒性毒素分子的主要組且由宿主細(xì)菌以單個(gè)多肽的形 式合成，所述多肽通過蛋白水解切割事件進(jìn)行翻譯后修飾以形成由二硫鍵連接在一起的兩 條多肽鏈。這兩條鏈被稱為重鏈（H鏈，其分子量為約lOOkDa)和輕鏈（L鏈或LC，其分子量 為約 50kDa)。
[0006]L鏈具有蛋白酶功能（鋅依賴的內(nèi)肽酶活性）并對(duì)胞吐過程中涉及的囊泡和/或 質(zhì)膜相關(guān)蛋白表現(xiàn)出高底物特異性。來自不同梭菌物種或血清型的L鏈可水解三種底物蛋 白（即突觸小泡蛋白、突觸融合蛋白或SNAP-25)之一中不同但特定的肽鍵。這些底物是神 經(jīng)分泌機(jī)制的重要組分。
[0007] 奈瑟球菌屬（最重要地，來自淋病奈瑟氏球菌（N.gonorrhoeae)物種）生成功能 類似的非細(xì)胞毒性蛋白酶。這類蛋白酶的示例是IgA蛋白酶（參見W099/58571)。
[0008] 本領(lǐng)域中已充分證明，毒素分子可再次靶向不是該毒素天然目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞。再 次靶向時(shí)，修飾的毒素能夠結(jié)合所需目標(biāo)細(xì)胞，隨后易位至細(xì)胞溶質(zhì)，能夠?qū)δ繕?biāo)細(xì)胞發(fā)揮 作用。所述再次靶向是通過使用不同的靶向部分（TM)代替毒素的天然TM來實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于 這一點(diǎn)，對(duì)TM進(jìn)行選擇使其結(jié)合所需目標(biāo)細(xì)胞，并隨后使修飾的毒素進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的內(nèi) 體。修飾的毒素也包含易位結(jié)構(gòu)域以使非細(xì)胞毒性蛋白酶進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)。該易位結(jié)構(gòu)域可 以是毒素的天然易位結(jié)構(gòu)域或者起可以是獲自具有易位活性的微生物蛋白的不同的易位 結(jié)構(gòu)域。
[0009] 可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述TM替換。關(guān)于這一 點(diǎn)，參見Hermanson，G.T. (1996)，Bioconjugatetechniques(《生物偶聯(lián)技術(shù)》），學(xué)術(shù)出 版社（AcademicPress)和Wong,S.S. (1991)，Chemistryofproteinconjugationand cross-linking(《蛋白偶聯(lián)和交聯(lián)的化學(xué)》），CRC出版社（CRCPress)?；蛘撸墒褂弥亟M 技術(shù)，如W098/07864中所述的那些。所有上述參考文獻(xiàn)均通過引用納入本文。
[0010] 疼痛傳感細(xì)胞具有大量受體類型。然而，不是所有的受體類型都適用于（至少是 可用于）受體介導(dǎo)的胞吞。類似地，對(duì)于同一受體，不同TM之間的結(jié)合特性可廣泛變化，這 在不同TM和不同受體之間更為顯著。
[0011] 因此，需要研發(fā)能夠解決一種或多種上述問題的修飾的非細(xì)胞毒性融合蛋白。特 別感興趣的是研發(fā)用于治療疼痛的替代性/改良的非細(xì)胞毒性融合蛋白。
[0012] 本發(fā)明試圖通過提供獨(dú)特的融合蛋白解決一種或多種上述問題。
[0013] 本方面通過提供單鏈、多肽融合蛋白解決了一種或多種上述問題，包括：
[0014]a.非細(xì)胞毒性蛋白酶，該蛋白酶切割傷害性感覺傳入神經(jīng)的胞吐融合器 (exocyticfusionapparatus)的蛋白；
[0015]b.結(jié)合傷害性感覺傳入神經(jīng)上結(jié)合位點(diǎn)的甘丙肽靶向部分，該結(jié)合位點(diǎn)胞吞整合 入傷害性感覺傳入神經(jīng)內(nèi)的內(nèi)體；
[0016]c.蛋白酶切割位點(diǎn)，融合蛋白在該位點(diǎn)處被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位點(diǎn)位 于非細(xì)胞毒性蛋白酶和甘丙肽靶向部分之間；
[0017]d.易位結(jié)構(gòu)域，其將蛋白酶從內(nèi)體內(nèi)跨內(nèi)體膜移至傷害性感覺傳入神經(jīng)的細(xì)胞溶 質(zhì)中，其中靶向部分位于蛋白酶切割位點(diǎn)和易位結(jié)構(gòu)域之間；
[0018]e.位于非細(xì)胞毒性和蛋白酶切割位點(diǎn)之間的第一間隔子，所述第一間隔子包含4 至25個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；
[0019]f.位于甘丙肽靶向部分和易位結(jié)構(gòu)域之間的第二間隔子，所述第二間隔子包含4 至35個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0020] 本發(fā)明的非細(xì)胞毒性蛋白酶組分是非細(xì)胞毒性蛋白酶，該蛋白酶能夠切割傷害性 感覺傳入神經(jīng)的胞吐融合器的三種底物蛋白（即突觸小泡蛋白、突觸融合蛋白或SNAP-25) 之一中不同但特定的肽鍵。這些底物是神經(jīng)分泌機(jī)制的重要組分。優(yōu)選地，本發(fā)明的非細(xì) 胞毒性蛋白酶組分是奈瑟球菌IgA蛋白酶或梭菌神經(jīng)毒素L鏈。術(shù)語(yǔ)非細(xì)胞毒性蛋白酶包 括所述非細(xì)胞毒性蛋白酶的功能等同的片段和衍生物。特別優(yōu)選的非細(xì)胞毒性蛋白酶組分 是肉毒桿菌神經(jīng)毒素（BoNT)L鏈。
[0021] 本發(fā)明的易位組分能夠使非細(xì)胞毒性蛋白酶（或其片段）易位至目標(biāo)細(xì)胞中，從 而在目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)中發(fā)生蛋白酶活性的功能性表達(dá)。該易位組分優(yōu)選能夠在低pH條件下在脂膜中形成離子可滲透孔。優(yōu)選地，已發(fā)現(xiàn)僅使用蛋白分子中能夠在內(nèi)體膜內(nèi)形 成孔的那些部分。該易位組分可獲自微生物蛋白來源，特別是獲自細(xì)菌或病毒蛋白來源。因 此，在一個(gè)實(shí)施方式中，該易位組分是酶（如細(xì)菌毒素或病毒蛋白）的易位結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明 的易位組分優(yōu)選是梭菌神經(jīng)毒素H鏈或其片段。更優(yōu)選地，其是HN結(jié)構(gòu)域（或其功能性組 分），其中馬表不梭菌神經(jīng)毒素H鏈大致相對(duì)于H鏈的氨基端一半的一部分或片段，或者完 整的H鏈中對(duì)應(yīng)于該片段的結(jié)構(gòu)域。
[0022] 本發(fā)明的甘丙肽TM組分負(fù)責(zé)使本發(fā)明的融合蛋白結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)。 因此，該甘丙肽TM組分是一種配體，本發(fā)明的融合蛋白通過其結(jié)合經(jīng)選擇的目標(biāo)細(xì)胞。
[0023] 在本發(fā)明的上下文中，該目標(biāo)細(xì)胞是傷害性感覺傳入神經(jīng)，優(yōu)選初級(jí)傷害性傳入 神經(jīng)（例如A纖維（如AS纖維）或C纖維）。因此，本發(fā)明的融合蛋白能夠抑制神經(jīng)遞 質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)因子[例如谷氨酸、底物P、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP)和/或神經(jīng)肽Y]從離 散的傷害性感覺傳入神經(jīng)元群體中釋放。使用中，該融合蛋白減少或阻止了感覺傳入信號(hào) (如神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)因子）從外周至中樞疼痛纖維的傳遞，并因此可用作治療疼痛（特 別是慢性疼痛）的治療性分子。
[0024] 確定TM與傷害性感覺傳入神經(jīng)結(jié)合是常規(guī)的。例如，可使用簡(jiǎn)單的放射性替換 實(shí)驗(yàn)，其中代表傷害性感覺傳入神經(jīng)的組織或細(xì)胞（例如DRG)在過量的未經(jīng)標(biāo)記配體存 在的情況下接觸經(jīng)標(biāo)記（如氚化）的配體。在這種實(shí)驗(yàn)中，可評(píng)估非特異性和特異性結(jié)合 的相對(duì)比例，從而確定配體結(jié)合傷害性感覺傳入神經(jīng)目標(biāo)細(xì)胞。任選地，該試驗(yàn)可包括一 種或多種結(jié)合拮抗劑，且該試驗(yàn)還可包括觀察配體結(jié)合的損失。這類實(shí)驗(yàn)的示例可參見 Hulme，E.C. (1990)，Receptor-bindingstudies,abriefoutline(《受體結(jié)合研宄概要》）， 第 303-311 頁(yè)，Receptorbiochemistry,APracticalApproach(《受體生物化學(xué)，實(shí)踐方 法》），E.C.Hulme編，牛津大學(xué)出版社（OxfordUniversityPress) 〇
[0025] 與對(duì)應(yīng)的"游離"TM(如gall6)相比，本發(fā)明的融合蛋白通常顯示降低的對(duì)甘丙 肽受體（例如，GALR1)的結(jié)合親和性（在最多10倍的范圍內(nèi)）。然而，雖然存在這項(xiàng)觀察， 但本發(fā)明的融合蛋白出乎意料的顯示了良好的效力。這可歸因于兩個(gè)主要特性。首先，非 細(xì)胞毒性蛋白酶是催化性的一一因此少量這類分子的治療性作用被迅速擴(kuò)大。其次，傷害 性感覺傳入神經(jīng)上存在的甘丙肽受體僅需作為治療劑進(jìn)入的通道，而無需被刺激至所需水 平以實(shí)現(xiàn)配體-受體介導(dǎo)的藥理反應(yīng)。因此，本發(fā)明的融合蛋白可以比其他類型的止痛分 子（如NSAIDS、嗎啡和加巴噴?。┑偷枚嗟膭┝拷o予。后幾種分子通常以較高的微克至毫 克（甚至數(shù)百毫克）的量給予，而本發(fā)明的融合蛋白可以低得多的劑量給予，通常至少低10 倍，且更通常低100倍。
[0026] 本發(fā)明的甘丙肽TM也可以作為傷害性感覺傳入神經(jīng)（更具體是初級(jí)傷害性傳入 神經(jīng)）上存在的一個(gè)或多個(gè)甘丙肽受體的"激動(dòng)劑"。通常，激動(dòng)劑被認(rèn)為是能夠增加或降 低細(xì)胞內(nèi)活性的任何分子，即簡(jiǎn)單地引起細(xì)胞活性變化的任何分子。例如，激動(dòng)劑的常規(guī)含 義可包括能夠與細(xì)胞上受體合并并起始反應(yīng)或活性的化學(xué)物質(zhì)，或者通過活化受體誘導(dǎo)活 性應(yīng)答（無論該應(yīng)答是增加還是降低細(xì)胞活性）的藥物。
[0027] 然而，對(duì)于本發(fā)明的目的，激動(dòng)劑可更具體地定義為能夠刺激目標(biāo)細(xì)胞中胞吐融 合過程的分子，該過程易于被能夠切割所述目標(biāo)細(xì)胞中胞吐融合器蛋白的蛋白酶（或其片 段）抑制。
[0028]因此，本發(fā)明的特定的激動(dòng)劑定義排除了許多常規(guī)情況下被認(rèn)為是激動(dòng)劑的分 子。例如，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)是一種激動(dòng)劑，其能夠通過結(jié)合TrkA受體促進(jìn)神經(jīng)元分化。 然而，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)時(shí)NGF不是一種激動(dòng)劑，因?yàn)槠洳皇前氯诤系闹饕T導(dǎo)因子。此 外，NGF刺激的過程（即細(xì)胞分化）不易于被非細(xì)胞毒性毒素分子的蛋白酶活性抑制。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白顯示優(yōu)先結(jié)合受體和/或內(nèi)化特性。這轉(zhuǎn) 而導(dǎo)致蛋白酶組分更高效地遞送至疼痛感覺目標(biāo)細(xì)胞。
[0030]由于副作用的存在，使用激動(dòng)劑作為TM是自限制的。更具體地，激動(dòng)劑TM與疼痛 感覺目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合增加了胞吐融合，其可能惡化疼痛感覺。然而，由激動(dòng)劑結(jié)合刺激的胞 吐過程隨后被融合蛋白的蛋白酶組分降低或抑制。
[0031] 可使用實(shí)施例9所述的方法確定TM結(jié)合傷害性傳入神經(jīng)上受體的激動(dòng)劑特性。
[0032] 本發(fā)明的靶向部分包