經(jīng)由pSGI-359使葡萄糖酸脫水以產(chǎn)生DHG的HPCL-MS 分析。
[0029] 圖5是用于測量葡萄糖酸脫水酶的活性的氨基脲測定曲線圖的圖解說明。
[0030] 圖6a_b提供用本發(fā)明的三種酶使葡糖醛酸和艾杜糖醛酸氧化的利-伯二氏曲線 圖。
[0031] 圖7a顯示使用EC5. 3. 1. 17家族中的酶DTHU異構酶使5KGA和艾杜糖醛酸異構 化的時間點的HPLC分析的結果。對照：死亡的酶是加熱滅活酶的對照。MedB1是指沒有異 構酶添加/n的反應。時間點，x軸1 = 0. 5h;2 = 1 ;3 = 2h;4 = 16h。圖7b顯示使用EC 5. 3. 1. 17家族中的酶使5KGA和艾杜糖醛酸異構化的時間點的HPLC分析。對照：死亡的酶 是加熱滅活酶的對照；MedB1 :是指沒有異構酶添加/n的反應。時間點，X軸：1 =Oh;2 = lh;3 = 2h;4 = 17h〇
[0032] 圖8顯示用EC5. 3. 1.nl家族中的酶使5KGA和艾杜糖醛酸異構化的產(chǎn)物形成。數(shù) 據(jù)從酶測定獲得。
[0033] 圖9 :隨著時間2, 5-DDH形成和5KGA濃度降低的HPLC分析。顯示了 2, 5-DDH的 總離子計數(shù)。
[0034] 圖10是顯示從1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯生成古羅糖醛酸內(nèi)酯的HPLC-MS色譜圖。顯示 了確認的痕量古羅糖醛酸的重疊。
[0035] 圖11是方案6反應途徑的示意圖。
[0036] 圖12a和12b分別是顯示5-KGA和DDG反應產(chǎn)物的LC-MS色譜圖。
[0037] 圖13是顯示FDCA和FDCA二丁酯衍生物反應產(chǎn)物的LC-MS色譜圖。
[0038]圖14a是從DDG與乙醇的反應合成的二乙基-FDCA的粗反應樣品的GC-MS分析。 單峰對應于二乙基-FDCA。圖14b是來自DDG與乙醇反應的主要產(chǎn)物的MS片段化。
[0039] 圖15a是從DDG與乙醇的反應合成的二乙基-FDCA的粗反應樣品的GC-MS分析。 單峰對應于二乙基-FDCA。圖15b是來自DDG與乙醇反應的主要產(chǎn)物的MS片段化。
[0040] 圖16是從DTHU合成FDCA和它的衍生物的示意圖。
[0041] 圖17是方案1的不意圖。從匍萄糖進行DDG的無細胞的酶合成。酶是：ST_1 : 葡萄糖氧化酶；ST-1A:水解-化學；ST-14 :葡萄糖酸脫氫酶（pSGI-504) ;ST-15 :5_脫 氫-4-脫氧-D-葡萄糖醛酸酯異構酶（DTHUIS，pSGI-434) ;ST-7B:糖醛酸脫氫酶（UroDH， pSGI-476)) ;ST-8A葡萄糖二酸脫水酶（GlucDH，pSGI-353) ;ST-A:NAD(P)H氧化酶（NADH_ OX，pSGI-431) ;ST-B:過氧化氫酶。圖17b顯示如由HPLC所分析在開始3h內(nèi)反應中間體 的濃度。在兩個反應中均顯示DDG形成。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] 本發(fā)明提供了產(chǎn)生酶途徑產(chǎn)物的方法。所述方法可包括將底物酶轉化成產(chǎn)物。通 過利用本發(fā)明的酶途徑和化學途徑有可能以高效和經(jīng)濟的方式合成多種產(chǎn)物?？山?jīng)由本發(fā) 明的方法和途徑產(chǎn)生的一種產(chǎn)物是2,5_呋喃基二甲酸（FDCA)，它可以根據(jù)本發(fā)明以商業(yè) 規(guī)模生產(chǎn)。所述方法可包括本文中公開的一種或多種酶的和/或化學的底物至產(chǎn)物的轉化 步驟。
[0044] 本發(fā)明的途徑由一個或多個步驟組成。應了解，本發(fā)明的途徑的步驟可包括正反 應或逆反應，即，底物A轉化成中間體B和產(chǎn)物C，同時在逆反應中底物C轉化成中間體B和 產(chǎn)物A。除非另作說明，否則在所述方法中正反應和逆反應均被稱作步驟。
[0045] 所述方法包括產(chǎn)生產(chǎn)物的途徑，所述途徑可以是酶途徑。在一些實施方案中，所述 途徑可包括一個或多個化學步驟。所述方法包括一個或多個將底物轉化成產(chǎn)物的酶轉化 步驟和/或化學轉化步驟。所述方法中可包括的步驟包括例如以下任何一個或多個步驟： 古羅糖醛酸酶轉化成D-葡萄糖二酸（步驟7) ;L-艾杜糖醛酸酶轉化成艾杜糖二酸（7B); L-艾杜糖醛酸酶轉化成4-脫氧-5-蘇-己酮糖糖醛酸（DTHU) (7B) ;5-酮葡萄糖酸（5-KGA) 酶轉化成L-艾杜糖醛酸（步驟15) ;L-艾杜糖醛酸酶轉化成艾杜糖二酸步驟7B);以及 5-酮基葡糖酸酶轉化成4,6-二羥基2, 5-二酮基己酸（2, 5-DDH)(步驟16) ;1，5-葡萄糖 酸內(nèi)酯酶轉化成古羅糖酸內(nèi)酯（步驟19)。前述步驟的任何一個或多個可以包括在本發(fā)明 的方法或途徑中。酶步驟或途徑是指為使步驟進行在反應中需要酶作為催化劑的步驟或途 徑?；瘜W步驟可以在反應中沒有酶作為催化劑的情況下進行。所述方法中列舉的任何一個 或多個步驟可以是酶步驟。在一些實施方案中，所述途徑的每個步驟均是酶步驟，而在其它 實施方案中所述途徑中的一個或多個步驟是化學步驟。
[0046] 在一些實施方案中，任何所述方法可包括如下步驟，這個步驟包括將反應底物添 加至含有進行轉化的酶的反應混合物中。因此將古羅糖醛酸轉化成D-葡萄糖二酸（步驟 7)的方法可包括將古羅糖醛酸作為起始底物添加至反應混合物中；L-艾杜糖醛酸至艾杜 糖二酸的酶轉化（7B)可包括將L-艾杜糖醛酸作為起始底物添加至反應混合物中；L-艾杜 糖醛酸至4-脫氧-5-蘇-己酮糖糖醛酸（DTHU)的酶轉化（7B)可包括將DTHU作為起始底 物添加至反應混合物中。任何所述方法中可包括的另一個步驟是從反應混合物純化反應產(chǎn) 物的步驟。因此，在本文描述的任何方法中可包括D-葡萄糖二酸或L-艾杜糖醛酸、或艾杜 糖二酸、或4,6-二羥基2, 5-二酮基己酸的純化步驟。所公開的任何所述方法可包括從反 應混合物分離或純化DDG或FDCA的步驟。
[0047] 所述方法中使用的反應混合物可以是含有用以進行酶轉化的一種或多種酶的細 胞的細胞裂解物，但還可以是含有由使用者添加以形成反應混合物的組分的反應混合物， 或可含有從細胞裂解物純化的組分，或可被包含在全細胞生物催化劑中。
[0048] 在各種實施方案中，本發(fā)明的方法是將葡萄糖轉化成DDG、或葡萄糖轉化成FDCA、 或葡萄糖轉化成DTHU或DEHU、或DDG轉化成FDCA的方法。所述方法可包括在該方法中將 起始底物轉化成產(chǎn)物。起始底物是被認為是開始所述方法的化學實體，且產(chǎn)物是被認為是 所述方法的最終終產(chǎn)物的化學實體。中間體是在所述方法中生成（無論是暫時還是永久 地）并且在起始底物和產(chǎn)物之間出現(xiàn)的那些化學實體。在各種實施方案中，本發(fā)明的方法 和途徑具有約四或五種中間體或4-5種中間體，或約3種中間體，或3-5種中間體，或少于 6或少于7或少于8或少于9或少于10或少于15或少于20種中間體，意味著這些數(shù)值未 將起始底物或最終終產(chǎn)物算上。
[0049] 本發(fā)明提供了具有高產(chǎn)率的從葡萄糖產(chǎn)生FDCA和/或DDG的方法。理論產(chǎn)量是如 果反應在理想條件下完成將形成的產(chǎn)物的量。在不同實施方案中，本發(fā)明方法從葡萄糖、果 糖或半乳糖產(chǎn)生DDG，其理論產(chǎn)率為至少50 %摩爾濃度、或至少60 %摩爾濃度或至少70% 摩爾濃度、或至少80 %摩爾濃度、至少90 %摩爾濃度或至少95 %摩爾濃度或至少97 %摩爾 濃度或至少98%摩爾或至少99%摩爾濃度、或100%摩爾濃度的理論產(chǎn)率。本發(fā)明的方法 還可提供碳保存為至少80 %或至少90 %或至少99 %或100 %的產(chǎn)物，這意味著在初始底物 中存在的特定碳原子以所列舉的百分比存在于所述方法的最終產(chǎn)物中。在一些實施方案 中，所述方法從葡萄糖經(jīng)由脫水反應產(chǎn)生DDG和/或FDCA。
[0050]合成路線
[0051] 本發(fā)明還提供用于合成和產(chǎn)生所需產(chǎn)物的特定途徑。任何以下描述的路線或途徑 可從葡萄糖開始并且流向所需產(chǎn)物。在一些實施方案中，D-葡萄糖為起始底物且向所述途 徑的任何中間體或最終產(chǎn)物的途徑方向被認為是下游方向，而向葡萄糖的反向方向被認為 是上游方向。應了解路線或途徑可以朝下游或上游方向流動。還應了解葡萄糖、果糖、半乳 糖，或任何途徑中的任何中間體可以是本發(fā)明方法中的起始底物，并且DDG、FDCA或任何本 發(fā)明的路線或途徑中的任何中間體可以是本發(fā)明方法的最終終產(chǎn)物。因此所公開的方法包 括在本發(fā)明的任何路線或途徑中公開的任何一個或多個步驟，其用于使用所公開的路線或 途徑中的一個或多個步驟將任何起始底物或中間體轉化成所公開的路線或途徑中的任何 終產(chǎn)物或中間體。因此，例如所述方法可以是用于以下的方法：將葡萄糖轉化成DDG、或葡 萄糖轉化成古羅糖醛酸、或葡萄糖轉化成半乳糖二酸、或葡萄糖轉化成DTHU、或葡萄糖轉化 成DEHU、或用于將葡萄糖轉化成古羅糖醛酸、或用于將葡萄糖轉化成艾杜糖醛酸、或用于將 葡萄糖轉化成艾杜糖二酸、或用于將葡萄糖轉化成葡萄糖二酸、或用于將半乳糖二酸轉化 成DDG、或用于將古羅糖醛酸轉化成D-葡萄糖二酸、或用于將5-KGA轉化成L-艾杜糖醛酸、 或用于將L-艾杜糖醛酸轉化成艾杜糖二酸、或用于將5-KGA轉化成2, 5-DDH或DTHU、或用 于將DHG轉化成DEHU。在這些實施方案中，所述方法利用本發(fā)明的方法和途徑中公開的步 驟從作為起