專利名稱:阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)，又名黃色陰溝腸桿菌，為腸桿菌屬的一種革蘭氏陰性菌，1980年后改名為阪崎腸桿菌，是奶及奶制品加工過程及成品中近幾年新發(fā)現(xiàn)的引起廣泛關(guān)注的一種致病菌，可引起嬰幼兒及成人疾病包括嬰兒腦膜炎、膿血癥、敗血癥和小腸結(jié)腸炎等，并可能引起神經(jīng)功能紊亂，造成嚴(yán)重的后遺癥和甚至死亡。 2002-2003年美國某知名奶粉生產(chǎn)企業(yè)曾自發(fā)召回了含有阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉，此后奶粉中阪崎腸桿菌成為世界矚目的焦點(diǎn)。1961年至2003年研究報(bào)告已表明阪崎腸桿菌引起嬰幼兒及早產(chǎn)兒總體死亡率高達(dá)80%。FA0/WH0(聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織) 于2004年2月在日內(nèi)瓦召開的專家咨詢會(huì)上將阪崎腸桿菌列入導(dǎo)致嬰幼兒感染、疾病和死亡的主要原因的“A”類微生物范疇，嚴(yán)重威脅人類(尤其是嬰幼兒)的健康，并給食品(尤其是奶及奶制品)工業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。
因此，各國政府對(duì)食品(尤其是奶及奶制品)中的阪崎腸桿菌都作出嚴(yán)格的要求。 2002年美國FDA在世界范圍內(nèi)率先建立了阪崎腸桿菌的檢測標(biāo)準(zhǔn)；我國先后發(fā)布了 “奶粉中阪崎腸桿菌檢驗(yàn)方法第1部分分離與計(jì)數(shù)方法” (SN/T1632. 1-2005)、“奶粉中阪崎腸桿菌檢驗(yàn)方法第2部分PCR方法”(SN/T1632. 2-2005)和“奶粉中阪崎腸桿菌檢驗(yàn)方法第3 部分熒光PCR方法”(SN/T1632. 3-2005)等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大部分進(jìn)口的奶及奶制品都要求進(jìn)行阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)，并要求不得檢出。因此，阪崎腸桿菌已成為許多國家食品衛(wèi)生的必檢項(xiàng)目，其檢測方法正日益引起人們的關(guān)注。
經(jīng)典的常規(guī)細(xì)菌生理生化檢驗(yàn)方法全過程至少需要6 10d，檢出限較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。免疫法比較快，但單克隆抗體制備比較困難，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性差。而PCR或熒光定量PCR方法快速，特異、靈敏度很高，但需要昂貴的PCR儀、技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用高，不易推廣應(yīng)用。熒光染色技術(shù)可以對(duì)活菌進(jìn)行檢測，但技術(shù)復(fù)雜，需要高端儀器。因此建立一種簡便、 靈敏、快速、特異的方法很有必要。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplication，簡稱LAMP) (國際專利公開號(hào)W000/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，針對(duì)待測靶基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一套兩對(duì)特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右等溫條件下能夠特異性、高效、快速的進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進(jìn)行判斷或檢測其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的熒光染料優(yōu)選STOR Green I染色，即可通過肉眼判定。由于LAMP技術(shù)擴(kuò)增的兩對(duì)引物是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)是等溫條件下即不需PCR儀等特殊儀器，且樣品的前處理非常簡單、單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高等優(yōu)點(diǎn)，已引起人們的關(guān)注。
中國發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枮?200710030435. 0,200710030437. X,200710132320. 2,200710026389. 7,200810052321. 0,200810015001. 8,200810093986. 6)分別公開了采用環(huán)
介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測病菌的方法。但是，目前尚無利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測阪崎腸桿菌的試劑盒和檢測方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的檢測方法不簡便、靈敏低、時(shí)間長、特異性差的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplication, LAMP)技術(shù)快速檢測用引物；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒檢測方法。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法具有簡便、靈敏、快速、特異好的特點(diǎn)， 可廣泛用于食品(尤其是奶及奶制品)、水產(chǎn)品、化妝品與醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案
阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物，所述的引物為一套阪崎腸桿菌特征性引物組，一套引物組由兩對(duì)引物成，一對(duì)引物為外引物，一對(duì)為內(nèi)引物，共有6套引物，序列分別為
引物組一
外引物1 :GCAATATTCCCCACTGCTGC
外引物2 GGAGGGGGATAACTACTGGA
內(nèi)引物 1 :CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT
內(nèi)引物 2 :TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG 或引物組二
外引物1 AGTGTGGCTGGTCATCCT
外引物2 CGGACGGGTGAGTAATGTCT
內(nèi)引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG
內(nèi)引物 2 :AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG 或弓丨物組三
外引物1 :TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 TGCTGCTCTGCTGACGA
內(nèi)引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC
內(nèi)引物 2 :TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 或引物組四
外引物1 TCCTCCCCGCTGAAAGT
外引物2 TGCCCAGATGGGATTAGCT
內(nèi)引物 1 GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG
內(nèi)引物 2 :CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA 或引物組五
外引物1 ACTTTACAACCCGAAGGCC
外引物2 AGCTAGTAGGTGGGGTAACG
內(nèi)引物 1 :GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG
內(nèi)引物 2 :CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC 或引物組六
外引物1 :TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 TGCTGCTCTGCTGACGA
內(nèi)引物 1 GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC[0034]內(nèi)引物 2 TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案
阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，該試劑盒包括上述技術(shù)方案中的任意一組引物組、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、樣品預(yù)處理液和陽性對(duì)照液。
作為優(yōu)選，所述的引物組由體積比為1 1 :4:4的20-30 μ M外引物1、外引物2、內(nèi)引物1與內(nèi)引物2組成。
作為優(yōu)選，所述的反應(yīng)液是由體積比為5 2 1 2的lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、 7. 5 12. 5mM dNTP, 100 200mM MgSO4與25 37. 5M甜菜堿組成。作為再優(yōu)選，所述的 lOXThermopol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8. 8三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、 IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和體積百分比濃度為1 %曲拉通X-100。
作為優(yōu)選，所述的Bst DNA聚合酶每微升含8 16個(gè)活性單位。
作為優(yōu)選，所述的樣品預(yù)處理液是由20mM pH8. OTris-HCl, 2mM EDTA,體積百分比濃度為1. 2%曲拉通X-100。
作為優(yōu)選，所述的該試劑盒還包括顯色劑，顯色劑為熒光染料。優(yōu)選熒光染料為 SYBR Green I ；
作為優(yōu)選，所述的陽性對(duì)照液為阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案
阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測方法，采用上述的任意一個(gè)技術(shù)方案所述的試劑盒，該方法包括以下的步驟
1)阪崎腸桿菌DNA的提取A、取50ul過夜培養(yǎng)的增菌液于印pendorf管中， IOOOrpm離心2min，棄上清；B、加入SOul樣品預(yù)處理液于離心管中，與沉淀所得菌體混合均勻；C、沸水中煮IOmin后立即冷卻IOmin ；D、IOOOOrpm離心anin，上清即可作為待檢的模板 DNA ；
2)反應(yīng)體系為2. 5μ L引物組、5μ L反應(yīng)液、IyLBst DNA聚合酶、2 μ L待檢模板 DNA或陽性對(duì)照液和14. 5 μ LddH20 ；
3)阪崎腸桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增將配制好的PCR管于60 65°C反應(yīng)1 1. 5h， 80°C終止反應(yīng)；
4)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2. 5ul熒光染料，混勻，靜置5min， 若顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性；或者，通過肉眼觀察鑒定，與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
本發(fā)明所說的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication, 簡稱LAMP)快速檢測樣品阪崎腸桿菌的方法是利用Bst DNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物，特異性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖一環(huán)DNA混合物。進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(簡稱LAMP反應(yīng))過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(65°C左右)條件下45至90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時(shí)間長、容易污染及檢測成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測方法對(duì)檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。國內(nèi)目前尚未有這方面的試劑盒出售。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析、血清學(xué)分型和 PCR鑒定等的通行方法，初步鑒定需2-3天，完成鑒定報(bào)告需10至15天；采用本發(fā)明中的基因診斷試劑盒檢測僅需2小時(shí)。并且，本發(fā)明的反應(yīng)液中也可以添加了熒光染料，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)、不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)、高特異性應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，陽性率可達(dá)大于99. 9%，假陽性率小于0. ； (3)、快速、高效擴(kuò)增檢測時(shí)間2小時(shí)左右；(4)、靈敏度高擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少，最低檢測極限達(dá)到10CFU/ml ；標(biāo)本的檢出率達(dá)到99% ； (5)、鑒定簡便通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其他任何分析步驟，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的M2+ 結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，可通過肉眼觀察鑒定；加入熒光染料后，陽性結(jié)果顯色為綠色，陰性結(jié)果為橙色，更加明顯可靠；(6)、用途廣可廣泛用于食品(尤其奶及奶制品)中阪崎腸桿菌的安全快速檢測。
具體實(shí)施方式
下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于實(shí)施例。
實(shí)施例1試劑盒的制備
本發(fā)明所提供的基因診斷試劑盒是由一套引物組，一套引物組包括兩對(duì)引物，Bst DNA聚合酶，反應(yīng)液，樣品預(yù)處理液，顯色劑與陽性對(duì)照液等組成。
(1)其中所說的引物組有6套，分別為
引物組一
外引物1 :GCAATATTCCCCACTGCTGC
外引物2 GGAGGGGGATAACTACTGGA
內(nèi)引物 1 CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT
內(nèi)引物 2 :TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG 或引物組二
外引物1 AGTGTGGCTGGTCATCCT
外引物2 CGGACGGGTGAGTAATGTCT
內(nèi)引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG
內(nèi)引物 2 :AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG 或弓丨物組三
外引物1 TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 TGCTGCTCTGCTGACGA
內(nèi)引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC
內(nèi)引物 2 :TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 或引物組四
外引物1 TCCTCCCCGCTGAAAGT[0069]外引物2 TGCCCAGATGGGATTAGCT
內(nèi)引物 1 :GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG
內(nèi)引物 2 :CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA 或引物組五
外引物1 ACTTTACAACCCGAAGGCC
外引物2 AGCTAGTAGGTGGGGTAACG
內(nèi)引物 1 :GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG
內(nèi)引物 2 :CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC 或引物組六
外引物1 :TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 :TGCTGCTCTGCTGACGA
內(nèi)引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC
內(nèi)引物 2 TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG
引物組由1 1 :4:4的20-30 μ M外引物1、外引物2、內(nèi)引物1與內(nèi)引物2組成；
(2)反應(yīng)液為由 5 :2 :1 :2 的 IOXThermopol 反應(yīng)緩沖液、7. 5-12. 5mM dNTP, 100-200mM MgS04與25-37. 5M甜菜堿組成；其中，10 X Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8. 8三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和體積百分比濃度為曲拉通X-100 ；
(3) Bst DNA聚合酶為Bst DNA polymerase,每微升含8-16個(gè)活性單位；
(4)樣品預(yù)處理液為20mM pH8. OTris-HCl，2mM EDTA,體積百分比濃度為1. 2%曲拉通X-100組成；
(5)顯色劑為熒光染料，優(yōu)選STOR Green I ；
(6)陽性對(duì)照液為阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA。
實(shí)施例2檢測方法
被檢樣品將少許食品或體液等被檢樣品置于增菌液中37°C培養(yǎng)。
(1)、對(duì)被檢樣品的預(yù)處理按常規(guī)方法提取DNA基因
A、取50ul過夜培養(yǎng)的增菌液于印pendorf管中，IOOOrpm離心2分鐘，棄上清；
B、加入SOul樣品預(yù)處理液于離心管中，與沉淀所得菌體混合均勻；
C、沸水中煮10分鐘后立即冷卻10分鐘；
DUOOOOrpm離心2分鐘，上清即可作為待用的模板DNA。
(2)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程
A、在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物混合物2. 5ul，反應(yīng)液5. Oul,Bstpolymerase Large Fragmentlul (8U)，準(zhǔn)備好的模板 DNA(或陽性對(duì)照液)2ul，加 ddH2014. 5ul ；
B、將配制好的PCR管于65°C反應(yīng)1_1. 5h，80°C終止反應(yīng)。
(3)、分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2. 5ul熒光染料(STORGREENI)， 混勻，靜置5min，若顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性。
序列表
<110>中國計(jì)量學(xué)院
<120>阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法
<160>24
<210>1[0102]<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>1
GCAATATTCCCCACTGCTGC 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>2
GGAGGGGGATAACTACTGGA 20
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>3
CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT 45
<210>4
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>4
TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG 46
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>5
AGTGTGGCTGGTCATCCT 18
<210>6[0137]<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>6
CGGACGGGTGAGTAATGTCT 20
<210>7
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>7
GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG 46
<210>8
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>8
AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG 45
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>9
TGTGGCTGGTCATCCTCTC 19
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>10
TGCTGCTCTGCTGACGA 17
<210>11[0172]<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>11
GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC 45
<210>12
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>12
TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 45
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>13
TCCTCCCCGCTGAAAGT 17
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>14
TGCCC AGATGGGATTAGCT 19
<210>15
<211 >45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>15
GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG 45
<210>16[0207]<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>16
CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA 43
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>17
ACTTTAC AACCCGAAGGCC 19
<210>18 <211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>18
AGCTAGTAGGTGGGGTAACG 20
<210>19
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>19
GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG 44
<210>20
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>20
CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC 44
<210>21
11[0242]<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>21
TGTGGCTGGTCATCCTCTC 19
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>22
TGCTGCTCTGCTGACGA 17
<210>23
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>23
GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC 45
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>24
TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 45
權(quán)利要求
1.阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物，其特征在于所述的引物為一套阪崎腸桿菌特征性引物組，一套引物組由兩對(duì)引物組成，一對(duì)引物為外引物，一對(duì)為內(nèi)引物，序列分別為外引物 1 :AGTGTGGCTGGTCATCCT外引物 2 CGGACGGGTGAGTAATGTCT內(nèi)引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG內(nèi)引物 2 :AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG。
2.阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如權(quán)利要求
1所述的引物組、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、樣品預(yù)處理液和陽性對(duì)照液。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于所述的引物組由體積比為1 1 4 4的20-30 μ M外引物1、外引物2、內(nèi)引物1與內(nèi)引物2組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于反應(yīng)液是由體積比為5 2 1 2的IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、7. 5 12. 5mM dNTP, 100 200mM MgSO4與25 37. 5M甜菜堿組成。.
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于=IOXThermopol反應(yīng)緩沖液含有200 mM pH8. 8三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、100 mM氯化鉀、100 mM硫酸銨、20 mM硫酸鎂和體積百分比濃度為曲拉通X-100。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于Bst DNA聚合酶每微升含8 16個(gè)活性單位。
7.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于樣品預(yù)處理液是由20mM pH 8.0 Tris_HCl，2mM EDTA，體積百分比濃度為1.2%曲拉通X-100組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括顯色劑，顯色劑為熒光染料。
9.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于陽性對(duì)照液為阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法。本發(fā)明的阪崎腸桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物，引物為一套阪崎腸桿菌特征性引物組，一套引物組由兩對(duì)引物成，一對(duì)引物為外引物，一對(duì)為內(nèi)引物，本發(fā)明共有6套引物；本發(fā)明的試劑盒由一套引物、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、樣品預(yù)處理液、顯色劑和陽性對(duì)照液等組成；檢測方法包括細(xì)菌DNA的提取、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增和顯色檢測等。使用本試劑盒通過對(duì)樣品簡單的處理便可快速檢測樣品中阪崎腸桿菌，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、通過肉眼即可判定結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GKCN101368204 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810121030
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2008年9月16日
發(fā)明者傅小偉, 劉軍, 張明洲, 方美明, 胡華軍, 陳宗倫 申請(qǐng)人:中國計(jì)量學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (5), 非專利引用 (3),