大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開大麥成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）引物、試劑盒及檢測方法，其堿基序列如SEQ?ID?NO.18～22；采用LAMP檢測技術(shù)，建立了適用于食品中大麥致敏原特異性檢測的方法，本發(fā)明所述方法操作簡單，不依賴昂貴儀器，檢測時(shí)間在1小時(shí)左右，方法靈敏度達(dá)到0.5%，檢測效率達(dá)到傳統(tǒng)PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實(shí)驗(yàn)室食品品質(zhì)監(jiān)控，適合作為行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用推廣。
【專利說明】大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢驗(yàn)技術(shù)方法領(lǐng)域，具體涉及一種大麥成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物、試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食物過敏醫(yī)學(xué)上也稱變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受抗原(包括半抗原)刺激后，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次接觸同一種抗原后在體內(nèi)引起體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，由此導(dǎo)致組織損傷或機(jī)體生理機(jī)能障礙。它是一種復(fù)發(fā)率很高的疾病，引起變態(tài)反應(yīng)的抗原被稱為變應(yīng)原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分會(huì)引起6%至8%的兒童和2%的成人的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的會(huì)危及生命。預(yù)包裝食品由于多是成分復(fù)雜的深加工產(chǎn)品，如果含有致敏原成分而又未能明確告之，就有可能引起過敏，危害消費(fèi)者的健康安全。目前大約有160多種食品致敏原，大麥為常見的致敏原之一。2003年以來，歐盟、美國、香港等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)相繼制定了預(yù)包裝食品致敏原標(biāo)識(shí)要求的法規(guī)，并已于2005年起陸續(xù)發(fā)布和實(shí)施，對(duì)我國食品出口貿(mào)易造成了明顯影響。由于目前我國在食品致敏原成分檢測方法領(lǐng)域技術(shù)薄弱，隨著越來越多國家和地區(qū)對(duì)食品致敏原成分標(biāo)識(shí)法規(guī)的全面實(shí)施，食品標(biāo)簽的致敏原成分標(biāo)識(shí)要求和符合性檢驗(yàn)將會(huì)成為我國食品出口貿(mào)易的重要障礙。
[0003]大麥(barley)是禾本科〔Gramineae〕)大麥屬(Hordeum)谷類植物。大麥按用途分，可分為啤酒大麥、飼用大麥、食用大麥(含食品加工)三種類型。
[0004]目前，致敏原成分檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、色譜質(zhì)譜法、表面等離子共振免疫法等。但是不同的方法的檢測限存在較大的區(qū)別，因此機(jī)構(gòu)之間、國家之間應(yīng)該采用一種檢測結(jié)果較為精確、重復(fù)性較好的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前較多國家所認(rèn)可的方法是酶聯(lián)免疫法。但是酶聯(lián)免疫法也受許多因素制約，如被測食品母體、檢測人員、試劑盒等。[0005]隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的新型鑒定技術(shù)已日益得到廣泛應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種較理想的手段，LAMP引物包括兩個(gè)外引物和兩個(gè)內(nèi)引物，特異結(jié)合靶序列上的6個(gè)特異區(qū)域。內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc (與Fl區(qū)域互補(bǔ))和F2序列，內(nèi)引物BIP包含Blc (與BI區(qū)域互補(bǔ))和B2序列，外引物為F3和/或B3序列，本發(fā)明在內(nèi)外引物的基礎(chǔ)上引入環(huán)引物BLP，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，具體LAMP的引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域信息見圖1。其特點(diǎn)是:①只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性；②高特異性:采用六個(gè)區(qū)段，四條引物，擴(kuò)增特異性高，可以根據(jù)是否擴(kuò)增來判斷目標(biāo)基因的存在與否；③快速、高效擴(kuò)增:擴(kuò)增在不到Ih即可完成，且產(chǎn)率高；④靈敏度高:擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少；⑤鑒定簡便:在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀，可用肉眼觀察判斷擴(kuò)增與否；另外，它利用恒溫和低反應(yīng)溫度(63°C)，減少細(xì)胞損傷，檢測人員實(shí)際操作非常簡便?？傮w而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴(kuò)增法，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測體系，在轉(zhuǎn)基因食品檢測、致敏原成份檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。[0006]本項(xiàng)目擬在前期研究的基礎(chǔ)上，將LAMP檢測技術(shù)應(yīng)用于食品中過敏原成分大麥的檢測，針對(duì)大麥淀粉酶結(jié)構(gòu)基因(Bmyl基因)，應(yīng)用五條特異引物在恒溫的條件下、簡易的設(shè)備中，僅用一小時(shí)左右有效的完成篩查任務(wù)，結(jié)果判斷簡單，既能節(jié)省時(shí)間，又可大大降低檢測成本，適用于基層實(shí)驗(yàn)室，可作為傳統(tǒng)PCR方法的有益補(bǔ)充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:通過考察并鎖定大麥成分靶基因(Bmyl基因中特異序列)，然后設(shè)計(jì)合成4套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID N0.1~24 ;，優(yōu)化體系，最后確定一套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID N0.18~22 ;進(jìn)而確定了 LAMP方法的技術(shù)參數(shù)，最后驗(yàn)證引物特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。
[0008]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:本發(fā)明涉及一種檢測大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其堿基序列為SEQ ID N0.18~22，如下:
[0009]F3 tgacagatgt atgccgatt(SEQ ID N0.18)
[0010]B3 agtttggaaa caaacactca c (SEQ ID N0.19)
[0011]FIP(Flc+F2) aatgtcgacg ataacaccag ccatgacaag cttcaggga (SEQ ID N0.20)
[0012]BIP(Blc+B2) gctggagaga tgaggtaccc gatgaattct ccgatgcct (SEQ ID N0.21)
[0013]BLP atcatatcct cagagccacg g(SEQ ID N0.22)
[0014]本發(fā)明的另一方面涉及一種大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒，其中，檢測試劑盒包括檢測引物:SEQ ID N0.18~22。
[0015]優(yōu)選的情況下:對(duì)于上述大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒中，每25ul反應(yīng)體系中包括:
[0016]SEQ ID NO:20 ~21 各 1.6 μ M，SEQ ID NO:18 ~19 各 0.2 μ Μ, SEQ ID NO:22 為
0.8yM,20mM ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,8mM MgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 μ I SYT0-9。
[0017]上述試劑盒在使用過程中，除了按上述反應(yīng)體系加入上述試劑之外，還需要加入模板DNA和蒸餾水(補(bǔ)足25 μ L反應(yīng)體系)，再進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。
[0018]本發(fā)明的另一方面在于，公開一種利用上述大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒，來檢測大麥成分的方法，其方法步驟包括:
[0019]①提取待測樣品的基因組DNA ;
[0020]②以步驟①提取的DNA作為模板，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測:
[0021]每25μL 的 LAMP 反應(yīng)體系包括:SEQ ID NO:20 ~21 各 1.6 μ M，SEQ ID NO:18 ~19 各 0.2 μ M，SEQ ID NO:22 為 0.8 μ M，20mM ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,8mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 μ ISYT0-9, 2 μ I DNA模板、蒸餾水:余量；
[0022]反應(yīng)條件為:保溫階段為63°C 30s, I個(gè)循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s,45個(gè)循環(huán)。
[0023]③檢測結(jié)果以擴(kuò)增曲線進(jìn)行判斷。[0024]本發(fā)明的另一方面在于，公開一種利用上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在檢測大麥成分方面的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的創(chuàng)新特征是:
[0026]本發(fā)明將LAMP檢測技術(shù)應(yīng)用于對(duì)大麥內(nèi)源特異基因檢測，針對(duì)大麥內(nèi)源特異基因，應(yīng)用特異引物在恒溫的條件下、簡易的設(shè)備中，僅用一小時(shí)左右有效的完成篩查任務(wù)，結(jié)果判斷簡單，既能節(jié)省時(shí)間，又可大大降低檢測成本，適用于基層實(shí)驗(yàn)室，可作為傳統(tǒng)PCR方法的有益補(bǔ)充。
[0027](I)本研究針對(duì)大麥Bmyl基因中特異序列設(shè)計(jì)了四套引物，從中篩選出一套出峰時(shí)間早，信號(hào)強(qiáng)的引物BMY1-4，將反應(yīng)條件控制在63 V，45min進(jìn)行檢測，成功建立了大麥成分的LAMP檢測方法；
[0028](2)進(jìn)行了引物BMY1-4的靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示該引物檢測限可達(dá)0.5% ；
[0029](3)進(jìn)行了引物BMY1-4的引物特異性，結(jié)果顯示該引物特異性良好，無非特異擴(kuò)增；
[0030](4)進(jìn)行了引物BMY1-4的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示引物5%，1%及0.5%的穩(wěn)定性均良好。
[0031](5)進(jìn)行了引物 BMY1-4的實(shí)際樣品實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示引物對(duì)大麥茶、大麥粉、大麥面條可檢出，對(duì)芝麻沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、熟蝦醬、蜢子蝦醬、芥末沙拉汁、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃不能檢出。性能參數(shù)等同于傳統(tǒng)PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實(shí)驗(yàn)室食品品質(zhì)監(jiān)控，適合作為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用推廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1:LAMP的引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域信息；
[0033]圖2 =BMYl-1引物的LAMP反應(yīng)結(jié)果
[0034]圖3:ΒΜΥ1-2弓丨物的LAMP反應(yīng)結(jié)果；
[0035]圖4:ΒΜΥ1-3弓丨物的LAMP反應(yīng)結(jié)果；
[0036]圖5 =BMY1-4引物的LAMP反應(yīng)結(jié)果；
[0037]圖6 =LAMP引物BMYI_4的靈敏度；
[0038]圖7 =BMY1-4引物特異性鑒定圖；
[0039]圖8:5%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0040]圖9:1%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0041]圖10:0.5%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0042]圖11:0%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0043]圖12:實(shí)際樣品檢測圖；
【具體實(shí)施方式】
[0044]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0045](I)LAMP 反應(yīng)試劑:[0046]Bst DNA 大片段聚合酶(Bst DNA polymerase large fragment), New EnglandBiolabs公司；
[0047]甜菜堿(Betaine)、MgCl2,Sigma 公司；
[0048]dNTPs，寶生物工程(大連)有限公司；
[0049](2) SYT0-9 焚光染料，Invitrogen 公司；
[0050](3) LAMP引物(正向外引物F3、正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3、反向環(huán)引物BLP)，生工生物工程(上海)有限公司。
[0051](3)焚光定量 PCR 儀，7500，Applied Biosystems ；
[0052](4)本發(fā)明所述的對(duì)照樣品以及LAMP反應(yīng)體系中所使用的各種溶劑均由常規(guī)途徑制備或者商業(yè)途徑獲得。
[0053]實(shí)施例1
[0054](I)LAMP引物設(shè)計(jì)步驟如下:
[0055]①查閱大麥相關(guān)文獻(xiàn)，了解不同品系大麥中的特異基因，選取大麥Bmyl基因中特異序列(SEQ ID N0.1)；
[0056]②在NCBI網(wǎng)站中查找所挑選的基因序列；
[0057]③利用DNAMAN軟件對(duì)查到的各序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明BMYl基因具有一定的保守性；
[0058]①設(shè)計(jì)4套特異引物，即大麥LAMP引物BMY1-1，大麥LAMP引物BMY1-2，大麥LAMP引物BMY1-3，大麥LAMP引物BMY1-4，堿基序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種檢測大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其特征在于，堿基序列為SEQ IDN0.18 ~22。
2.一種大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測引物:SEQ IDN0.18 ~22。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大麥成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒，其特征在于，在檢測試劑盒中: 每 25μ L 的 LAMP 反應(yīng)體系包括:SEQ ID NO:20 ~21 各 L 6 μ M，SEQ ID NO:18 ~19 各 0.2 μ M，SEQ ID NO:22 為 0.8 μ M，20mM ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,8mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 μ ISYT0-9,2y I DNA 模板。
4.利用權(quán)利要求2所述試劑盒檢測大麥成分的方法，其特征在于，檢測步驟包括: ①提取待測樣品的基因組DNA； ②以步驟①提取的DNA作為模板，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測: 每 25μ L 的 LAMP 反應(yīng)體系包括:SEQ ID NO:20 ~21 各 L 6 μ M，SEQ ID NO:18 ~19 各 0.2μΜ，SEQ ID NO:22 為 0.8 μ M，20mM ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,8mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 μ ISYT0-9, 2 μ I DNA模板、蒸餾水:余量； 反應(yīng)條件為:保溫階段為63°C 30s, I個(gè)循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s,45個(gè)循環(huán)。
5.如權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫`擴(kuò)增引物在檢測大麥成分方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103509866SQ201310437177
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】曹際娟, 徐君怡, 王剛 申請(qǐng)人:曹際娟, 徐君怡, 王剛