本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有新型插入位點(diǎn)的羊痘病毒，該病毒缺失了135orf，并選擇該處為新型插入位點(diǎn)，該疫苗株毒株免疫原性沒有影響，表達(dá)外源基因的能力強(qiáng)于傳統(tǒng)的tk基因插入位點(diǎn)。本發(fā)明還包括以所述病毒為載體疫苗利用所述含有新型插入位點(diǎn)的羊痘病毒疫苗株制備的羊痘疫苗以及它們的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

羊痘病毒(capripoxvirus，cpv)是痘病毒科(poxviridae)、脊索動(dòng)物痘病毒亞科(chordopoxrinae)、羊痘病毒屬(capripoxvirus)成員，包括山羊痘病毒(goatpoxvirus，gtpv)和綿羊痘病毒(sheeppoxvirus)。羊痘，是羊痘病毒引起的一種急性高度接觸性的傳染病，主要通過氣溶膠和緊密接觸進(jìn)行傳播。羊痘主要分布于非洲、中東、印度、北歐、地中海各國(guó)及德國(guó)、澳大利亞、美國(guó)等，特別是非洲的北部、中東和亞洲的部分國(guó)家流行較為嚴(yán)重。與我國(guó)接壤的周邊國(guó)家，如印度、俄羅斯、蒙古等國(guó)家均有本病的流行。我國(guó)貴州、新疆、福建、山西、遼寧、吉林、黑龍江、江蘇、四川、上海等都有過羊痘發(fā)生的相關(guān)報(bào)道。因?yàn)樵摬【哂懈咧虏÷屎透咧滤缆实奶攸c(diǎn)，所以羊痘給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且嚴(yán)重影響國(guó)際貿(mào)易，因此oie將其列為法定通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病?，F(xiàn)在防控用的疫苗都是體外傳代致弱的疫苗株。而基因工程疫苗的研究熱點(diǎn)是tk基因，該基因作為插入位點(diǎn)已經(jīng)普遍用于痘病毒和皰疹病毒疫苗的研制中。

山羊痘病毒是雙股dna病毒，病毒基因組共有147個(gè)開放閱讀框(orf)，編碼密度為93％，所編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為53-2027個(gè)氨基酸不等，基因組中間的區(qū)域(orf024-orf123)有與其它痘病毒同源的保守序列，這些序列與病毒復(fù)制相關(guān)。羊痘病毒也和其它痘病毒一樣，基因組包括一個(gè)中間編碼區(qū)和兩端相同的末端反向重復(fù)序列(invertedterminalrepeat，itr)。

羊痘病毒作為載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于羊病預(yù)防。tk基因由于其便于篩選，已經(jīng)成為痘病毒的常用插入位點(diǎn)。但是也存著問題，雖然該基因是病毒復(fù)制非必需，但是缺失突變后，對(duì)病毒的復(fù)制有明顯地影響。利用tk插入位點(diǎn)，已經(jīng)有表達(dá)羊藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒、傳染性膿皰病毒、羊口蹄疫病毒等抗原基因的重組山羊痘病毒(caufourpetal.vaccine，2004；mawetal.archvirol，2014；zhangqetal.，weishengwuxuebao，2014；wade-evansametal.virology，1996；bnb；wetal.vaccine，2010.)的報(bào)道，但是該位點(diǎn)的缺失，導(dǎo)致了載體病毒自身的復(fù)制能力降低，進(jìn)而影響了病毒載體毒和插入的外源蛋白的免疫原性并且需要大劑量免疫(chenwetal.vaccine，2010)，進(jìn)而影響了其作為載體苗的免疫效力。羊痘病毒在我國(guó)普遍流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展而我國(guó)尚無應(yīng)對(duì)措施，所以能夠研制出既保留了載體的免疫原性并且能夠良好地表達(dá)外源基因的安全性強(qiáng)的新型疫苗是非常有意義的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種免疫原性好和安全性強(qiáng)的羊痘載體(例如，改造的山羊痘病毒av41株和綿羊痘疫苗株)基因工程毒株及其在構(gòu)建疫苗株中的應(yīng)用。本發(fā)明的羊痘載體基因工程毒株的免疫原性和安全性優(yōu)于目前本領(lǐng)域常用的利用傳統(tǒng)tk插入位點(diǎn)構(gòu)建的羊痘載體基因工程毒株。

在第一方面，本發(fā)明提供一種免疫原性好和安全性強(qiáng)的羊痘載體基因工程毒株。本發(fā)明的羊痘載體基因工程毒株具有新型插入位點(diǎn)，其以羊痘病毒的135orf位點(diǎn)作為插入位點(diǎn)，可以將其他病原的抗原基因插入到該位點(diǎn)，從而構(gòu)建表達(dá)這些外源抗原的重組羊痘病毒基因工程疫苗毒株。例如，可以將小反芻獸疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus，pprv)的h蛋白編碼基因和/或f蛋白編碼基因等插入到該位點(diǎn)而構(gòu)建一系列具有良好的免疫原性和安全性的羊痘病毒基因工程疫苗。

具體而言，本發(fā)明人構(gòu)建了一種重組山羊痘病毒基因工程毒株gtpvδ135/egfp，該基因工程毒株于2017年4月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc，地址：中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵編：430072)，保藏編號(hào)為cctcc-v201714；以及一種重組綿羊痘病毒基因工程毒株sppvδ135/egfp，其于2017年4月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc-v201715。

在第二方面，本發(fā)明提供第一方面的具有新型插入位點(diǎn)的羊痘病毒載體基因工程毒株在制備羊痘病毒基因工程疫苗中的應(yīng)用。

在第三方面，本發(fā)明提供了一種制備重組羊痘病毒基因工程疫苗的方法，所述方法通過將靶標(biāo)外源基因插入到第一方面所述的羊痘病毒載體基因工程毒株的135orf位點(diǎn)而進(jìn)行。優(yōu)選地，所述外源基因的插入通過同源重組進(jìn)行。

所述靶標(biāo)外源基因可以是來自羊藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒、傳染性膿皰病毒、羊口蹄疫病毒、羊布魯氏菌或其它病原的一種或多種抗原基因。例如，所述靶標(biāo)外源基因?yàn)樾》雌c獸疫病毒的h基因或f基因或二者的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，通過將靶標(biāo)外源基因插入到第一方面所述的羊痘病毒載體基因工程毒株的135orf位點(diǎn)而構(gòu)建的重組羊痘病毒基因工程疫苗能夠同時(shí)預(yù)防或治療羊痘病毒引起的羊痘和與所述靶標(biāo)外源基因相關(guān)的病原引起的疾病。例如，本發(fā)明包含小反芻獸疫病毒的h或f基因的重組羊痘病毒能夠同時(shí)預(yù)防或治療羊痘和小反芻獸疫。

在第四方面，本發(fā)明提供了一系列通過將靶標(biāo)外源基因插入到第一方面的羊痘病毒載體基因工程毒株的135orf位點(diǎn)而構(gòu)建的重組羊痘病毒基因工程疫苗。與利用傳統(tǒng)的tk基因插入位點(diǎn)構(gòu)建的重組羊痘病毒基因工程疫苗具相比，所述重組羊痘病毒基因工程疫苗具有良好的免疫原性和安全性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將來自羊藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒、傳染性膿皰病毒、羊口蹄疫病毒、羊布魯氏菌或其它病原的一種或多種抗原基因插入到第一方面的羊痘病毒載體基因工程毒株的135orf位點(diǎn)，構(gòu)建得到表達(dá)相應(yīng)的一種或多種外源抗原基因的重組羊痘病毒基因工程疫苗。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將小反芻獸疫病毒的h基因或f基因或二者的組合插入到第一方面的羊痘病毒載體基因工程毒株的135orf位點(diǎn)，構(gòu)建得到的重組羊痘病毒基因工程疫苗能夠用于預(yù)防或治療羊痘病毒和小反芻獸疫病毒引起的疾病。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，小反芻獸疫病毒的h基因或f基因的插入通過同源重組進(jìn)行。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明人合成包含7.5啟動(dòng)子和小反芻獸疫病毒(pprv)的h基因(seqidno：22)，同時(shí)在基因兩端引入noti酶切位點(diǎn)，pb-δ135/egfp經(jīng)noti酶切，將通過noti酶切位點(diǎn)將7.5啟動(dòng)子和pprvh連入到上下游同源臂之間，構(gòu)建成pb-δ135/pprvh重組質(zhì)粒。將純化好的重組δ135/egfp缺失株作為親本(gtpvδ135/egfp和sppvδ135/egfp)，進(jìn)行增殖擴(kuò)增，提取重組羊痘病毒δ135/egfp缺失株基因組dna，用noti進(jìn)行酶切，回收酶切后的基因組dna。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pb-δ135/pprvh與回收后的病毒基因組共轉(zhuǎn)染于lt細(xì)胞，待出現(xiàn)cpe(細(xì)胞病變)，即是目標(biāo)重組病毒，即，重組的gtpvδ135/pprvh病毒和sppvδ135/pprvh病毒。它們保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2017年4月6日，保藏號(hào)分別為cctccno：v201716和cctccno：v201717。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明人以類似的方式構(gòu)建了重組的sppvδ135/pprvh/f病毒。它保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2017年4月6日，保藏號(hào)為cctccno：v201718。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明人進(jìn)行了上述構(gòu)建的重組病毒疫苗株與利用常規(guī)方法在tk位點(diǎn)插入的相應(yīng)的重組病毒疫苗株的對(duì)比檢測(cè)。結(jié)果表明135orf插入位點(diǎn)在體外具有更好的復(fù)制能力以及免疫原性，并且保持了至少同等的安全性。

在第五方面，本發(fā)明提供了第四方面的重組羊痘病毒基因工程疫苗在制備用于預(yù)防或治療羊痘病毒和其他病原引起的疾病的試劑盒中的應(yīng)用。其中所述其他病毒為所述重組羊痘病毒基因工程疫苗中包含的靶標(biāo)外源基因所來源的病原。

例如，當(dāng)本發(fā)明第四方面的重組羊痘病毒基因工程疫苗包含來自小反芻獸疫病毒的抗原基因時(shí)，則所述重組羊痘病毒基因工程疫苗可以用于預(yù)防或治療羊痘病毒和小反芻獸疫病毒引起的疾病。

在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療羊痘病毒和其他病原引起的疾病的試劑盒，其包含治療有效量的第四方面所述的重組羊痘病毒基因工程疫苗，并且，其中所述其他病原為所述重組羊痘病毒基因工程疫苗中包含的靶標(biāo)外源基因所來源的病原。

例如，當(dāng)本發(fā)明第四方面的重組羊痘病毒基因工程疫苗包含來自小反芻獸疫病毒的抗原基因時(shí)，則所述試劑盒可以用于預(yù)防或治療羊痘病毒和小反芻獸疫病毒引起的疾病。

在第七方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療羊痘病毒和其他病原引起的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的第四方面的重組羊痘病毒基因工程疫苗或使用第六方面的試劑盒，并且，其中所述其他病原為所述重組羊痘病毒基因工程疫苗中包含的靶標(biāo)外源基因所來源的病原。優(yōu)選地，所述其他病原可以來自羊藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒、傳染性膿皰病毒、羊口蹄疫病毒、羊布魯氏菌或其它病原。

在所述方法中，所述受試者為羊，包括，但不限于，山羊和綿羊。

綜上所述，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明人構(gòu)建了一種重組山羊痘病毒基因工程毒株gtpvδ135/egfp，該基因工程毒株于2017年4月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc-v201714；以及一種重組綿羊痘病毒基因工程毒株sppvδ135/egfp，其于2017年4月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc-v201715。

本發(fā)明的上述兩種重組羊痘病毒基因工程毒株的基本構(gòu)建方法是：首先針對(duì)目的基因135構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有egfp標(biāo)記基因，以及兩側(cè)的針對(duì)135的上下游同源臂，在同源臂的5’和3’端引入羊痘病毒基因組里沒有的noti酶切位點(diǎn)，將其命名為pb-δgtpv135/egfp；同理，將針對(duì)綿羊痘135orf的重組質(zhì)粒命名為pb-sppvδ135/egfp。將gtpvav41病毒(購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)和pb-gtpvδ135/egfp或者sppv疫苗株病毒(由本實(shí)驗(yàn)室分離，傳代致弱)和pb-sppvδ135/egfp共同感染和轉(zhuǎn)染于羔羊睪丸細(xì)胞(lt)，通過多輪純化篩選獲得gtpvδ135/egfp毒株和sppvδ135/egfp毒株。這兩個(gè)重組山羊痘病毒基因工程毒株已經(jīng)在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。

本發(fā)明在上述基礎(chǔ)上，將gtpvδ135/egfp和sppvδ135/egfp的基因組dna分別用noti進(jìn)行酶切，與相應(yīng)的pb-△135/pprvh重組質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，構(gòu)建出重組的gtpv△135/pprvh病毒和sppv△135/pprvh病毒。同理如果需要構(gòu)建二價(jià)或者多價(jià)疫苗，可以將gtpvδ135/egfp毒株或者sppvδ135/egfp毒株的基因組用noti限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，之后再與相應(yīng)的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組病毒。

為深入評(píng)價(jià)用該重組羊痘病毒基因工程毒株制備的羊痘病毒疫苗及對(duì)應(yīng)的插入外源基因的二價(jià)或者多價(jià)疫苗株的應(yīng)用，用制備的疫苗在試驗(yàn)動(dòng)物(例如，1年以上的綿羊)進(jìn)行了免疫效果評(píng)價(jià)及安全評(píng)價(jià)。結(jié)果表明本發(fā)明的重組羊痘病毒基因工程毒株保持了原有疫苗株的安全性且具有更好的免疫原性。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是：

1、本發(fā)明通過同源重組的方法將羊痘病毒的135基因缺失，并帶有egfp標(biāo)簽，有利于重組病毒的純化、篩選。

2、本發(fā)明構(gòu)建的gtpvδ135/egfp毒株和sppvδ135/egfp毒株中的報(bào)告基因的兩端引入了羊痘病毒基因組中沒有的noti酶切位點(diǎn)，經(jīng)過酶切處理后，可以阻止親本病毒的復(fù)制，進(jìn)而直接獲得目標(biāo)重組病毒。

3、本發(fā)明所選擇的插入位點(diǎn)135orf優(yōu)于tk位點(diǎn)，對(duì)病毒自身的復(fù)制沒有影響，因而相對(duì)tk基因位點(diǎn)135orf插入位點(diǎn)保持了更好的免疫原性。

附圖說明

從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中：

圖1：本發(fā)明的基本流程示意圖。

基本步驟是先將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和羊痘病毒共轉(zhuǎn)染于lt細(xì)胞，以報(bào)告基因?yàn)闃?biāo)識(shí)，挑取發(fā)綠色熒光的空斑。

圖2：重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pb-gtpvδ135/egfp的構(gòu)建流程圖。

圖3：135基因上、下游同源臂pcr擴(kuò)增結(jié)果。圖中泳道m(xù)：dl2000dnamarker；泳道1：135基因下游同源臂，大小為568bp。泳道2：135基因上游同源臂，大小為659bp。

圖4：egfp表達(dá)盒以及gpt篩選基因的pcr擴(kuò)增結(jié)果。圖中泳道m(xù)：dl2000dnamarker；泳道1：由pcr擴(kuò)增出的2.7kbegfp和gpt篩選基因的表達(dá)盒。

圖5：本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pb-gtpvδ135/egfp的酶切鑒定圖。泳道m(xù)：dl15000dnamarker；泳道1：用xmai單酶切，結(jié)果可見一條6.4kb大小的dna片段。泳道2：用noti酶切，結(jié)果可見兩條帶，大小分別為：4.2kb和2.2kb。

圖6：本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pb-sppvδ135/egfp的酶切鑒定圖。泳道m(xù)：dl5000dnamarker；泳道1：用xmai單酶切，結(jié)果可見一條6.4kb大小的dna片段。泳道2：用noti酶切，結(jié)果可見兩條帶，大小分別為：4.2kb和2.2kb。

圖7：本發(fā)明構(gòu)建的gtpvδ135/egfp和sppvδ135/egfp顯微鏡下觀察的熒光噬斑。

圖8：圖8a是本發(fā)明構(gòu)建的gtpvδ135/egfp的pcr圖。b是sppvδ135/egfppcr鑒定圖。圖8a：泳道m(xù)：dl5000dnamarker，泳道1：野生型(wt)對(duì)照，泳道2：gtpvδ135/egfp，圖8b：泳道m(xù)：dl5000dnamarker，泳道1：野生型對(duì)照，泳道2：sppvδ135/egfp。

圖9：是pb-gtpvδ135/pprvh重組質(zhì)粒的鑒定圖。m：dl15000dnamarker；泳道1：用noti酶切，結(jié)果可見兩條帶，大小分別為：4.2kb和2.2kb。

圖10：本發(fā)明pb-sppvδ135/pprvh/f重組質(zhì)粒圖譜。

圖11：本發(fā)明構(gòu)建的gtpvδ135/pprvh和pcr鑒定圖。泳道m(xù)：dl5000marker。泳道1：野生型對(duì)照，泳道2：gtpvδ135/pprvh，泳道3：sppvδ135/pprvh。野生型可以擴(kuò)增出1600bp的片段；gtpvδ135/pprvh和sppvδ135/pprvh都可以擴(kuò)增出3400bp左右的片段。

圖12：本發(fā)明針對(duì)sppvδ135/pprvh/f病毒的間接免疫熒光結(jié)果。

圖13：135和tk兩種插入位點(diǎn)體外生長(zhǎng)曲線的比較。圖13a是山羊痘病毒兩種插入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)病毒的生長(zhǎng)曲線的比較；圖13b為綿羊痘病毒兩種插入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)病毒的生長(zhǎng)曲線的比較。

圖14：圖14a是將本發(fā)明構(gòu)建的gtpvδ135/pprvh與以前構(gòu)建的gtpvδtk/pprvh免疫羊后，中和抗體產(chǎn)生情況。圖14b是sppvδ135/pprvh與gtpvδtk/pprvh(tk位點(diǎn)插入pprvh)的重組病毒免疫羊后，中和抗體產(chǎn)生情況。

生物材料保藏信息說明

注：cctcc是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵編：430072)

序列表說明

seqidno：1是gtpv135基因上游同源臂的核苷酸序列。

seqidno：2是gtpv135下游同源臂的核苷酸序列。

seqidno：3是sppv135上游同源臂的核苷酸序列。

seqidno：4是sppv135下游同源臂的核苷酸序列。

seqidno：5-20是引物序列。

seqidno：21是報(bào)告基因egfp和篩選基因gpt的核苷酸序列，其中，9-728：egfp；730-1316：ires；1326-1784：gtp；1801-1898：p11啟動(dòng)子。

seqidno：22是小反芻獸疫病毒p7.5啟動(dòng)子和h基因核苷酸序列，其中，1-8：noti；9-284：7.5啟動(dòng)子；2033-2040：noti，303-2132：pprvh基因。

seqidno：23是小反芻獸疫病毒p11啟動(dòng)子和f基因核苷酸序列，其中，1-99：p11啟動(dòng)子，100-1740：pprvf基因。

具體實(shí)施方式

下面參照具體的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施例。除非特別說明，下述實(shí)施例中所用的試劑、質(zhì)粒等均可從生物試劑公司購(gòu)得。

實(shí)施例1.引物設(shè)計(jì)

根據(jù)genbank上發(fā)表的山羊痘病毒基因組的全長(zhǎng)核苷酸序列(genbank登記號(hào)：kc951854.1)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以gtpv(山羊痘病毒av41株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)基因組dna為模板，分別擴(kuò)增135基因的上下游同源臂，設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)分別為xmai，noti和noti，sacii，片段大小分別約為682bp和554bp，將上下游同源臂分別連入pbluescriptiiks載體(購(gòu)自becton，dickisonandcompany)中；以本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的含有egfp和gpt表達(dá)盒質(zhì)粒(構(gòu)建方法參見chenwetal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010jul5；28(30)：4742-50.)為模板，擴(kuò)增出該片段，同時(shí)引入noti酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，以及本發(fā)明的中間產(chǎn)物pcr鑒定引物(引物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物技術(shù)公司合成)分別如下(以下引物都可以在seqidno：1-4的序列中識(shí)別，可得知本發(fā)明及其中間產(chǎn)物中所缺失基因的大小及pcr鑒定時(shí)所擴(kuò)增出的片段大小)：

seqidno：5p1：5’atcccgggatgaaaaatatacatatgttattg3’(xmai)(gtpv135上游同源臂上游引物)

seqidno：6p2：5’tagcggccgcattttatttataatattttatac3’(noti)(gtpv135上游同源臂下游引物)

seqidno：7p3：5’acgcggccgcttacttgtacagctcgtcc3’(noti)(報(bào)告基因上游引物)

seqidno：8p4：5’tagcggccgccggggatccgtcactgttc3’(noti)(報(bào)告基因下游引物)

seqidno：9p5：5’tcgcggccgctgtaaaacataaaataaataac3’(noti)(gtpv135下游同源臂上游引物)

seqidno：10p6：5’ccgcggtgaaatacatccatatggtttattg3’(sacii)(gtpv135下游同源臂下游引物)

seqidno：11p7：5’tagcggccgccatctatatactatatagtaatac3’(noti)(pprvh上游引物)

seqidno：12p8：5’tagcggccgctcagactggattacatgttacc3’(noti)(pprvh下游引物)

seqidno：13p95’cacacgaggtgttagatatactttag3’(sppv135上游同源臂上游引物)

seqidno：14p105’ttctttaataatacgtttaatttcatc3’(sppv135上游同源臂下游引物)

seqidno：15p11gtccaaggatggataaacttccaa3’(sppv135下游同源臂上游引物)

seqidno：16p12taaaccaacactgcaatctattgcc3’(sppv135下游同源臂下游引物)

以下引物為鑒定重組病毒的引物：

seqidno：17p13：5’atctattaattacaaacatgagg3’(鑒定gtpv135缺失以及重組病毒)

seqidno：18p14：5’taaaccatgacatataatctttac3’(鑒定gtpv135缺失以及重組病毒)

seqidno：19p15：5’ataatattggatcaaatgtaac3’(鑒定sppv135缺失以及重組病毒)

seqidno：20p16：5’ttatttgtgtatttataaacg3’(鑒定sppv135缺失以及重組病毒)

實(shí)施例2.pb-gtpvδ135/egfp重組質(zhì)粒的構(gòu)建(見圖4、5、6)

根據(jù)genbank上發(fā)表的山羊痘病毒基因組的全長(zhǎng)核苷酸序列(genbank登記號(hào)：kc951854.1)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以gtpv(山羊痘病毒av41株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)基因組dna為模板，分別擴(kuò)增135基因的上下游同源臂，設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)為xmai，noti，用p1、p2，p5、p6引物分別擴(kuò)增出約682bp和554bp的特異性片斷，與預(yù)期大小相符，如圖3所示，泳道1為下游同源臂片段；泳道2為上游同源臂片段；m表示dnamarker。

上游同源臂擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃5min，94℃15s，57℃15s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，保持在4℃；反應(yīng)體系：模板1.0μl，10×緩沖液5μl(購(gòu)自vazyme公司)，dntpmix1μl(購(gòu)自vazyme公司)5mmol/l引物p15.0μl，5mmol/l引物p25.0μl(由長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司合成)，taq聚合酶(購(gòu)自vazyme公司)1.0μl，dmso2.0μl，h2o29μl。

下游同源臂擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃4min，94℃15s，57℃15s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，保持在4℃；反應(yīng)體系：模板1.0μl，10×緩沖液5.0μl，1mmol/ldntp2.0μl，5mmol/l引物p55.0μl，5mmol/l引物p65.0μl，taq聚合酶1.0μl，dmso2.0μl，h2o29μl。

將上述兩個(gè)pcr產(chǎn)物回收純化之后分別克隆到pmd18-t載體(購(gòu)自大連takara)。測(cè)序結(jié)果顯示，上下游同源臂分序列與genbank登錄序列g(shù)tpv(登錄號(hào)：kc951854.1)具有100％的同源性。分別用xmai，noti和noti，sacii雙酶切，同時(shí)將質(zhì)粒pbluescriptiiks(購(gòu)自becton，dickisonandcompany)用xmai，noti雙酶切。先將上游同源臂通過xmai和noti連入pbluescriptiiks，再通過noti和sacii將下游同源臂連入載體。用擴(kuò)增報(bào)告基因egfp表達(dá)盒(seqidno：21)(chenwetal.vaccine，2010)為模板，用引物p3，p4，擴(kuò)增出約2700bp的片段，與預(yù)期大小相符，如圖4所示。pcr反應(yīng)條件為：95℃5min，94℃30s，56℃20s，72℃160s，35循環(huán)，72℃10min，保持在4℃；反應(yīng)體系：模板1.0μl，10×緩沖液5.0μl；1mmol/ldntp2.0μl，5mmol/l；引物p35.0μl，5mmol/l引物p45.0ml；taq1.0μl，dmso2.0μl，h2o29μl。將連入上下游同源臂的載體用noti酶切，將報(bào)告基因egfp表達(dá)盒(seqidno：21)通過noti連入載體，最終構(gòu)建成pb-δ135/egfp重組質(zhì)粒。分別通過xmai、noti酶切鑒定，進(jìn)一步證明了該重組質(zhì)粒的正確性，如圖5所示，泳道1為xmai酶切后形成一條6400bp左右的片段；泳道2為noti酶切形成的兩條片段大小分別為2200bp和4200bp左右。

實(shí)施例3.pb-sppvδ135/egfp重組質(zhì)粒的構(gòu)建

pb-sppvδ135/egfp重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程同實(shí)施例2，不同之處在于所用模板為綿羊痘疫苗株(sppv)(由本實(shí)驗(yàn)室用臨床病料經(jīng)常規(guī)方法分離，在雞胚上傳代150代致弱，并在本實(shí)驗(yàn)室保存，具體信息參見“遺傳資源來源披露登記表”，如果本領(lǐng)域技術(shù)人員需要，申請(qǐng)人承諾從申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向有需要的公眾發(fā)放)，同源臂分別用引物用p9，p10和p11，p12擴(kuò)增。如圖6所示，泳道1：xmai酶切，泳道2：noti酶切，分別能獲得5500bp，4200bp和2450bp左右的片段。

實(shí)施例4.重組羊痘病毒δ135/egfp缺失株的構(gòu)建及鑒定(見圖7，8)

山羊痘和綿羊痘缺失重組病毒用同種方法構(gòu)建和鑒定。

(1)親本株基因組的制備：

在lt細(xì)胞(原代羔羊的睪丸細(xì)胞，按照常規(guī)方法，通過用胰酶消化羔羊睪丸組織，來制備羔羊睪丸細(xì)胞，凍存于液氮罐)上增殖山羊痘親本株(株號(hào)：av41株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)或者綿羊痘疫苗株(該疫苗株是由本實(shí)驗(yàn)室用臨床病料經(jīng)常規(guī)方法分離而來，在雞胚上傳代150代，自然致弱得到，并在本實(shí)驗(yàn)室保存，具體信息參見“遺傳資源來源披露登記表”，如果本領(lǐng)域技術(shù)人員需要，申請(qǐng)人承諾從申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向有需要的公眾發(fā)放)，提取羊痘病毒基因組dna。方法如下：待lt細(xì)胞病變達(dá)80％以上，收集病毒，25000rpm，處理2h。用te溶解，加十二烷基磺酸鈉(sds)裂解液(含有10％sds的pbs)裂解及20μlrna酶(10μg購(gòu)自天根公司)，在56℃的水浴中放置30min，再加50μl蛋白酶k(20μg/ml，購(gòu)自omega)，在56℃的水浴中作用30min；然后用苯酚∶氯仿∶異戊醇(體積比為25∶24∶1)抽提四次，用無水乙醚去除苯酚、氯仿和異戊醇，最后用無水乙醇將病毒基因組沉淀出來。

(2)缺失病毒的構(gòu)建：

將在(1)中制備好的病毒基因組與對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于lt細(xì)胞，挑取發(fā)綠色熒光的空斑，將其純化。最終能看到如圖7所示的純的熒光噬斑。

(3)pcr鑒定：

將重組δ135/egfp缺失株接種于剛長(zhǎng)成單層的lt細(xì)胞，72小時(shí)后提取細(xì)胞總dna。分別通過鑒定引物p13、p14，p15、p16進(jìn)行pcr檢測(cè)。結(jié)果見圖8，圖8a：泳道m(xù)代表dnamarker；泳道1，代表野生型(wt)病毒為模板擴(kuò)增出1600bp左右的片段；泳道2，代表gtpvδ135/egfp毒株為模板擴(kuò)增出3400bp左右的片段；圖8b：泳道m(xù)代表dnamarker；泳道1，代表野生型(wt)病毒為模板擴(kuò)增出1600bp左右的片段；泳道2，代表sppvδ135/egfp毒株為模板擴(kuò)增出3400bp左右的片段。

實(shí)施例5.pb-gtpvδ135/pprvh重組質(zhì)粒的構(gòu)建

由于啟動(dòng)子部分不容易擴(kuò)增，所以，包含7.5啟動(dòng)子和小反芻獸疫病毒(pprv)的h基因通過基因合成，同時(shí)在基因兩端引入noti酶切位點(diǎn)，其序列為seqidno：22。pb-δ135/egfp經(jīng)noti酶切，將通過noti酶切位點(diǎn)將7.5啟動(dòng)子和pprvh連入到上下游同源臂之間，構(gòu)建成pb-δ135/pprvh重組質(zhì)粒。鑒定結(jié)果見圖9(泳道1顯示用noti酶切后5100bp和2140bp的片段)。

實(shí)施例6.pb-sppvδ135/pprvh重組質(zhì)粒的構(gòu)建

pb-sppvδ135/pprvh重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程同實(shí)施例5，不同之處在于同源重組的同源臂是針對(duì)sppv135orf。

實(shí)施例7.pb-sppvδ135/pprvh/f重組質(zhì)粒的構(gòu)建

pb-sppvδ135/pprvh/f重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程同實(shí)施例4。不同的是通過noti連入同源臂之間的是小反芻獸疫病毒(pprv)h和f基因(均通過基因合成得到)。質(zhì)粒圖譜如圖10所示，在135上下游同源臂之間用“背靠背”啟動(dòng)子排列方式分別驅(qū)動(dòng)pprvh和f兩個(gè)基因的表達(dá)。

實(shí)施例8.重組羊痘病毒δ135/pprvh病毒的構(gòu)建及鑒定

將純化好的重組δ135/egfp缺失株作為親本(gtpvδ135/egfp和sppvδ135/egfp)，進(jìn)行擴(kuò)增，提取重組羊痘病毒δ135/egfp缺失株基因組dna，用noti進(jìn)行酶切，回收酶切后的基因組dna。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pb-δ135/pprvh與回收后的病毒基因組共轉(zhuǎn)染于lt細(xì)胞，待出現(xiàn)cpe，即是目標(biāo)重組病毒。通過pcr鑒定重組病毒是否正確，pcr反應(yīng)條件為：95℃5min，94℃1min，55℃15s，72℃2min30s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min，保持在4℃。獲得結(jié)果如圖11所示，片段大小為3400bp，泳道1：wt，1600bp；泳道2：gtpvδ135/pprvh，3400bp；泳道3：sppvδ135/pprvh，3400bp，與預(yù)期的片段大小相符。

實(shí)施例9.重組羊痘病毒δ135/pprvh/f病毒的構(gòu)建及鑒定

同理，將純化好的重組sppvδ135/egfp缺失株作為親本，進(jìn)行擴(kuò)增，提取重組羊痘病毒δ135/egfp缺失株基因組dna，用noti進(jìn)行酶切，回收酶切后的基因組dna。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pb-δ135/pprvh/f與回收后的病毒基因組共轉(zhuǎn)染于lt細(xì)胞，待出現(xiàn)cpe，即是目標(biāo)重組病毒。通過間接免疫熒光(ifa)證明該病毒確實(shí)能表達(dá)外源基因(即小反芻獸疫病毒的h基因和f基因)。獲得結(jié)果如圖12所示。

實(shí)施例10.gtpv△135/egfp與gtpv△tk/egfp毒株和sppv△135/egfp與sppv△tk/egfp毒株體外生長(zhǎng)曲線比較

分別將gtpv△135/egfp與gtpv△tk/egfp和sppv△135/egfp與sppv△tk/egfp毒株以相同的感染比接種lt細(xì)胞，moi為0.05。在24h，48h，72h和96h分別收取樣品，反復(fù)凍融后，在lt細(xì)胞上滴定其tcid50。結(jié)果證明山羊痘和綿羊痘的135orf缺失后病毒的復(fù)制能力高于相應(yīng)的tk缺失病毒，如圖13所示。

gtpv△tk/egfp毒株構(gòu)建過程：與gtpv△135/egfp構(gòu)建過程相似，只是重組質(zhì)粒是針對(duì)tk基因，通過多輪篩選而獲得，該毒株具體構(gòu)建過程參見chenwetal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010jul5；28(30)：4742-50。

sppv△tk/egfp構(gòu)建過程：首先構(gòu)建針對(duì)sppvtk的重組質(zhì)粒，再將sppv與該重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染感染，最終篩選獲得sppv△tk/egfp，該病毒已于2017年4月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：v201719。

實(shí)施例11.重組gtpvδ135/pprvh病毒和sppvδ135/pprvh病毒的免疫實(shí)驗(yàn)

將重組gtpvδ135/pprvh病毒，gtpvδtk/pprvh病毒(其構(gòu)建方法參見chenwetal.vaccine，2010)和sppvδ135/pprvh病毒，sppvδtk/pprvh在長(zhǎng)滿的單層lt細(xì)胞上增殖，于-70℃冰箱凍融三次，收毒。以每只綿羊(用于實(shí)驗(yàn)時(shí)的月齡為12月齡到18月齡，體重60-80kg)皮內(nèi)接種10^3.5tcid50的劑量接種，兩次免疫。第一次免疫后四周進(jìn)行第二次免疫。分別在第一次免疫后第三周、第四周，和第二次免疫后第二周和第四周采血，分離血清。

針對(duì)pprv中和抗體滴度的測(cè)定：將血清倍比稀釋，每孔加100個(gè)tcid50的病毒(pprv-egfp)，5天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出中和抗體滴度。

結(jié)果見圖14。這些數(shù)據(jù)表明，在免疫的綿羊體內(nèi)，pprvh插入到綿羊痘病毒135位點(diǎn)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生的針對(duì)pprv的中和抗體是tk插入位點(diǎn)的近20倍，第二次免疫后中和抗體滴度并沒有顯著的提高，說明該新型插入位點(diǎn)135orf經(jīng)一次免疫即可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體。pprvh插入到山羊痘病毒135位點(diǎn)相比tk插入位點(diǎn)也能誘導(dǎo)更高水平的中和抗體滴度，第二次免疫后，pprvh插入到135位點(diǎn)產(chǎn)生的中和抗體滴度最高是tk插入位點(diǎn)的8倍。

應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

<120>含有新型插入位點(diǎn)的羊痘病毒載體和應(yīng)用

<130>ib177726

<160>23

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>695

<212>dna

<213>gtpv135基因上游同源臂的核苷酸序列

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<213>報(bào)告基因egfp和篩選基因gpt的核苷酸序列

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