專利名稱：鑒別診斷羊痘野毒感染的試劑盒及制備與檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，確切講是一種用于鑒別診斷羊痘野毒感染的ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，試劑盒中有包被抗原的ELISA抗體檢測(cè)板和酶標(biāo)二抗。
背景技術(shù)：
羊痘(Capripox)又名羊“天花”，是由羊痘病毒引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。1879年Hansen首次報(bào)道了挪威的山羊痘，我國(guó)在20世紀(jì)40年代先后發(fā)現(xiàn)了綿羊痘和山羊痘的流行。羊痘病毒可引起山羊痘(goatpox)、綿羊痘(sheeppox)和牛的結(jié)節(jié)性疹塊病(lumpy skin disease, LSD。本病的主要特征是發(fā)熱、無(wú)毛和少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹和皰疹、內(nèi)臟病變(特別是肺)乃至死亡。羊痘是所有動(dòng)物痘病毒中致病性最為嚴(yán)重的一種，具有高度的傳染性，可導(dǎo)致妊娠母羊流產(chǎn)，羔羊死亡，并有非典型癥狀和繼發(fā)、并發(fā)感染，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類重大傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疾病。羊痘在我國(guó)的廣泛流行，不僅給我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)及毛皮加工業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重影響了國(guó)際貿(mào)易和養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。目前，羊痘的診斷方法較多，但這些方法也都存在很多問(wèn)題。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷要借助電子顯微鏡，但羊痘病毒與傳染性膿皰性皮炎病毒在形態(tài)上相似，很難區(qū)分。瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(AGID)可用于羊痘病毒的抗原檢測(cè)，但該抗原與副痘病毒有交叉反應(yīng)。間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)(IFAT)存在較深的背景顏色和非特異性反應(yīng)，同時(shí)，此法不能區(qū)分羊口瘡(orf)、牛膿皰性口炎病毒。病毒中和試驗(yàn)(VNT)是檢測(cè)羊痘病毒特異性較強(qiáng)的血清學(xué)診斷方法，也是目前《國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生法典》要求的替代診斷試驗(yàn)(目前羊痘尚無(wú)指定血清學(xué)診斷方法)。然而羊痘感染后主要以細(xì)胞免疫為主，動(dòng)物接觸病原后僅產(chǎn)生低水平的中和抗體，所以病毒中和試驗(yàn)敏感性不高。Western印跡試驗(yàn)是以羊痘病毒感染的細(xì)胞溶解物檢查血清樣品中病毒結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，具有較好的敏感性和特異性，但該試驗(yàn)價(jià)格昂貴，操作繁瑣。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)因其操作方便、快速、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于許多抗原抗體的檢測(cè)。1988年arnrm應(yīng)用山羊痘痂皮制成粗抗原建立了山羊痘抗體的間接 ELISA 方法，參見(jiàn) Siarm S N, Negi B S. Yadav M P. et al. Application of ELI SA in the detection of goat pox antigen and antibodies. Acta Virologica, 1988,32 :65-69,但試驗(yàn)的本底值太高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。1997年Rao建立了檢測(cè)羊痘病
Rao Τ. V. S. Nandi. Evalution of immunocaputure ELISA for diagnosis of goatpox. Acta Virologica，1997，41 :345_348，但該方法單獨(dú)使用時(shí)有一定的限制，需要與對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)共同應(yīng)用才能確診。應(yīng)用純化的具有較強(qiáng)抗原性的重組蛋白做抗原進(jìn)行ELISA可提高其敏感性，1999年Heine利用表達(dá)的羊痘病毒P32蛋白為抗原進(jìn)行ELISA取得成功，參見(jiàn)Heine H G，et al. A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32the homolog of the vaccinia virus H3L gene. Journal oflmmunological Methods，1999，227 :187-196，然而P32 蛋白制備難度很大，限制了該ELISA方法的應(yīng)用。因此，篩選能穩(wěn)定而大量表達(dá)的免疫原性強(qiáng)的抗原基因是建立可靠ELISA方法的關(guān)鍵。羊痘的預(yù)防主要依靠疫苗的免疫接種，滅活疫苗具有安全、無(wú)毒的特點(diǎn)，但滅活苗的免疫效果較差，弱毒疫苗則具有良好的免疫效果。羊痘病毒的疫苗株與野毒株之間的差異很小，兩者氨基酸序列的同源性高達(dá)99.9%，因此，接種弱毒疫苗后很難區(qū)分疫苗免疫和野毒自然感染。山羊痘弱毒疫苗可同時(shí)用于山羊痘和綿羊痘的預(yù)防，接種4 5日后即可產(chǎn)生免疫力，抗體持續(xù)期可長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月，有的羊甚至產(chǎn)生終身免疫。所以，進(jìn)行羊痘的抗體檢測(cè)關(guān)鍵在于能否有效的避開(kāi)弱毒疫苗帶來(lái)的干擾，目前尚無(wú)任何一種能區(qū)分出弱毒免疫與野毒感染的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能特異性檢測(cè)出羊痘野毒株的抗體，排除弱毒疫苗免疫后的抗體干擾。本發(fā)明同時(shí)提供這種檢測(cè)試劑盒的制備與使用方法。本發(fā)明的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中有包被抗原的 ELISA抗體檢測(cè)板和酶標(biāo)二抗，其包被的抗原為重組羊痘病毒0RF95蛋白和0RF103蛋白的混合物。本發(fā)明的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中，其所用的 ELISA抗體檢測(cè)板的規(guī)格為8孔X 12條的可拆酶標(biāo)板，所包被的抗原為重組羊痘病毒 0RF95蛋白和重組0RF103蛋白的混合物。本發(fā)明的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中，酶標(biāo)板每個(gè)孔中抗原包被量為0RF95蛋白10ng，ORF 103蛋白20ng，所使用的酶標(biāo)二抗工作液為Sigma 公司兔抗山羊酶標(biāo)二抗經(jīng)IXblocking buffer (Sigma)稀釋6萬(wàn)倍。本發(fā)明提供的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中所用的重組羊痘病毒0RF95蛋白和0RF103蛋白的制備方法是以山羊痘病毒弱毒疫苗株基因組DNA 為模板，分別以兩對(duì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后與pET30a(+)表達(dá)載體連接，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-95和pET-103，轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，將陽(yáng)性重組菌接種于卡那抗性LB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別得到0RF95重組蛋白和0RF103重組蛋白，收集大量表達(dá)的宿主菌并超聲裂解，用8M尿素溶解包涵體并用濾膜過(guò)濾，經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化得到目的蛋白，所用的兩對(duì)特異引物分別如下0RF95 上游弓丨物ACCGAATTCATGGACTTCATGAAAAAATATACT ；0RF95 下游引物ACCAAGCTTTTTGCTGTTATTATCATCCAG ；0RF103 上游引物ACCGAATTCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG ；0RF103 下游引物ACCAAGCTTATCCATACCATCGTCGATAG。本發(fā)明的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中酶標(biāo)板的制備方法是用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液作為包被液，將純化的0RF95和0RF103重組蛋白混勻， 使得0RF95的終濃度為100ng/mL，0RF103的終濃度為200ng/mL，按IOOuL/孔加入酶標(biāo)板中，0RF95重組蛋白每孔的包被量為10ng，0RF103重組蛋白每孔的被量為20ng，4°C包被過(guò)夜，用PBST洗板四次，每孔加入200uL IXblocking buffer 37°C封閉1小時(shí)，用PBST洗板四次，室溫晾干，裝入干燥劑進(jìn)行真空包裝，置4°C保存；酶標(biāo)二抗工作液為Sigma公司兔抗山羊酶標(biāo)二抗經(jīng)IXblocking buffer (Sigma公司)稀釋6萬(wàn)倍而成；樣品稀釋液為 1 Xblocking buffer ；10倍濃縮洗滌液為含0. 5%吐溫-20的0. 1M、ρΗ7· 4磷酸鹽緩沖液； 底物顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；終止液為2Μ硫酸溶液。本發(fā)明的鑒別診斷羊痘野毒感染的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的使用方法是(1)將IOX濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2)待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清均用抗體稀釋液作1 100倍稀釋， 按每孔IOOuL加入抗體檢測(cè)板中，37°C孵育30min，甩干；(3)每孔加入200uL洗滌液，洗滌4次，每次lmin，甩干；(4)每孔加入IOOuL 二抗工作液，37°C孵育30min，甩干；(5)每孔加入200uL洗滌液，洗滌4次，每次lmin，甩干；(6)每孔加入IOOuL TMB顯色液，37°C避光孵育5min ；(7)每孔加入50uL終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值(OD45tlnm值)。最后根據(jù)測(cè)得的OD值確定待檢樣品是否是野毒感染，當(dāng)0D450 > 0. 3判定為陽(yáng)性；0D450 < 0. 25時(shí)樣品判為陰性；當(dāng)0. 3 > 0D450 > 0. 25時(shí)判為可疑，此時(shí)樣品需復(fù)檢一次，若0D450 > 0. 3判定為陽(yáng)性，否則判為陰性。本發(fā)明中所用的ELISA包被抗原0RF95和0RF103是羊痘病毒粒子的核心蛋白，其序列見(jiàn)后附基因序列表中SQ LNa 5和SQL Na 6。0RF95和0RF103在病毒粒子的裝配中發(fā)揮重要的作用。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證明，由0RF95和0RF103蛋白混合包被所建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)芴禺愋缘倪M(jìn)行羊痘野毒感染的抗體檢測(cè)，有效地排除羊痘弱毒疫苗免疫帶來(lái)的干擾。本發(fā)明優(yōu)選的方法是通過(guò)原核表達(dá)并純化的0RF95和0RF103重組蛋白制備檢測(cè)試劑盒，這種檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果穩(wěn)定可靠且成本低廉，具有很強(qiáng)的實(shí)用性和推廣性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明所采用的0RF95和0RF103重組蛋白便于大量制備和純化。與P32蛋白的表達(dá)相比，0RF95和0RF103在pET原核表達(dá)系統(tǒng)中得到了高效的表達(dá)，攜帶組氨酸標(biāo)記的重組蛋白易于純化。2、本發(fā)明所使用的重組蛋白純度高，活性好?？乖姆疥嚨味ㄔ囼?yàn)顯示，每個(gè)酶標(biāo)孔只需包被IOng的0RF95和20ng的0RF103就能取得很好的檢測(cè)結(jié)果。3、本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)，能有效的排除羊痘弱毒疫苗免疫的干擾，特異性的檢測(cè)羊痘野毒感染，這是現(xiàn)有的任何方法所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。4、本發(fā)明的試劑盒結(jié)果判定靈敏、準(zhǔn)確、可靠。采用TMB底物進(jìn)行顯色，酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果判定，陰陽(yáng)性結(jié)果差異明顯，比OPD顯色更加靈敏穩(wěn)定。5、利用本發(fā)明的試劑盒能在1. 5h內(nèi)完成檢測(cè)。該診斷方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，成本低，非常適合大量動(dòng)物血清樣品的檢測(cè)。


圖1為0RF103和0RF95基因的核酸電泳鑒定圖，其中各泳道為1、2、3為0RF103 ； 4、5、6 為 0RF95 ；M :DL2000。圖20RF103和0RF95重組蛋白的表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳鑒定圖其中各泳道為1、2 經(jīng)Ni柱純化的0RF103重組蛋白；3、4 純化前的0RF103重組蛋白產(chǎn)物；M Marker ；5 純化前的0RF95重組蛋白產(chǎn)物；6、7、8泳道為經(jīng)Ni柱純化后的0RF95重組蛋白。
具體實(shí)施例方式以下為本發(fā)明的具體實(shí)施例1、山羊痘病毒0RF95和0RF103基因的克隆和原核表達(dá)載體的構(gòu)建參考GenBank中羊痘病毒基因組序列(AY07783》設(shè)計(jì)0RF95和0RF103基因的特異性引物，引物序列為0RF95 上游引物:ACCGAATTCATGGACTTCATGAAAAAATATACT,劃線部分為 EcoRI 酶切位點(diǎn)；下游引物:ACCAAGCTTTTTGCTGTTATTATCATCCAG,劃線部分為HindIII 酶切位點(diǎn)；0RF103 上游引物:ACCGAATTCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG,劃線部分為 EcoRI 酶切位點(diǎn)；下游引物:ACCAAGCTTATCCATACCATCGTCGATAG,劃線部分為HindIII 酶切位點(diǎn)；通過(guò)PCR擴(kuò)增大小為483bp的0RF95和570bp的0RF103特異性目的基因，酶切后與pET30a(+)表達(dá)載體連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-95和pET_103，通過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定表明，成功構(gòu)建0RF95和0RF103基因原核表達(dá)載體，其電泳圖見(jiàn)圖1。2、0RF95和0RF103重組蛋白的高效表達(dá)和純化原核表達(dá)載體pET-95和pET-103轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，將陽(yáng)性重組菌接種于卡那抗性 LB培養(yǎng)基中37 °C振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液0D600達(dá)到0. 6時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的終濃度為ImM。離心收集大量表達(dá)的宿主菌并超聲裂解，用8M尿素溶解包涵體并用0. 45的濾膜過(guò)濾，經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定表明，0RF95重組蛋白大小約為30kD，0RF103重組蛋白大小約為35kD。其電泳圖見(jiàn)圖2。3、ELISA抗體檢測(cè)板的抗原最佳包被劑量和包被方法0RF95和0RF103兩種重組蛋白分別采用如下的包被方式進(jìn)行方陣滴度試驗(yàn)，見(jiàn)表 1。表 權(quán)利要求
1.鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體試劑盒，其中有包被抗原的ELISA抗體檢測(cè)板和酶標(biāo)二抗，其特征在于包被的抗原為羊痘病毒0RF95蛋白和ORF 103蛋白的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體試劑盒，其特征在于所用的ELISA抗體檢測(cè)板的規(guī)格為8孔X 12條的可拆酶標(biāo)板，所包被的抗原為重組羊痘病毒0RF95蛋白和重組0RF103蛋白的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體試劑盒，其特征在于其中每孔的抗原包被量為0RF95蛋白10ng，0RF103蛋白20ng ；酶標(biāo)二抗工作液為兔抗山羊酶標(biāo)二抗經(jīng)IXblocking buffer (Sigma)稀釋6萬(wàn)倍。
4.權(quán)利要求2或3所述的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體試劑盒中所用的重組羊痘病毒0RF95蛋白和重組羊痘病毒0RF103蛋白的制備方法，其特征是以山羊痘病毒弱毒疫苗株基因組DNA為模板，分別以兩對(duì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后與 pET30a(+)表達(dá)載體連接，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-95和pET_103，經(jīng)轉(zhuǎn)化BL21宿主菌表達(dá)和純化后，將陽(yáng)性重組菌接種于卡那抗性LB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別得到0RF95 重組蛋白和0RF103重組蛋白，收集大量表達(dá)的重組宿主菌并超聲裂解，用8M尿素溶解包涵體并用濾膜過(guò)濾，經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化得到目的蛋白，所用的兩對(duì)特異引物分別如下0RF95 上游引物ACCGAATTCATGGACTTCATGAAAAAATATACT ；0RF95 下游引物ACCAAGCTTTTTGCTGTTATTATCATCCAG ；0RF103 上游引物ACCGAATTCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG ；0RF103 下游引物ACCAAGCTTATCCATACCATCGTCGATAG。
5.權(quán)利要求3所述的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體試劑盒的制備方法，其特征在于用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液作為包被液，將純化的0RF95和0RF103重組蛋白混勻， 使得0RF95的終濃度為100ng/mL，0RF103的終濃度為200ng/mL，按IOOuL/孔加入酶標(biāo)板中，0RF95重組蛋白每孔的包被量為10ng，0RF103重組蛋白每孔的被量為20ng，4°C包被過(guò)夜，用PBST洗板四次，每孔加入200uL IXblocking buffer 37°C封閉1小時(shí)，用PBST洗板四次，室溫晾干，裝入干燥劑進(jìn)行真空包裝，置4°C保存；酶標(biāo)二抗工作液為兔抗山羊酶標(biāo)二抗經(jīng)IXblocking buffer做6萬(wàn)倍稀釋而成；樣品稀釋液為1 Xblocking buffer ；10 倍濃縮洗滌液為含0. 5%吐溫-20的0. 1Μ、ρΗ7. 4磷酸鹽緩沖液；底物顯色液為四甲基聯(lián)苯胺；終止液為2M硫酸溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒別診斷羊痘野毒感染的ELISA檢測(cè)試劑盒使用方法，其特征是(1)將IOX濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2)待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清均用抗體稀釋液作1 100倍稀釋，按每孔IOOuL加入抗體檢測(cè)板中，37°C孵育30min，甩干；(3)每孔加入200uL洗滌液，洗滌4次，每次lmin，甩干；(4)每孔加入IOOuL二抗工作液，37°C孵育30min，甩干；(5)每孔加入200uL洗滌液，洗滌4次，每次lmin，甩干；(6)每孔加入IOOuLTMB顯色液，37°C避光孵育5min ；(7)每孔加入50uL終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值(OD45tlnm值)；根據(jù)測(cè)得的OD值確定待檢樣品是否是野毒感染。
全文摘要
本發(fā)明為公開(kāi)一種用于鑒別診斷羊痘野毒感染的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的鑒別診斷羊痘野毒感染的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中有包被抗原的ELISA抗體檢測(cè)板和酶標(biāo)二抗，其包被的抗原為重組羊痘病毒ORF95蛋白和ORF103蛋白的混合物。本發(fā)明所采用的ORF95和ORF103重組蛋白便于大量制備和純化。本發(fā)明試劑盒特異性強(qiáng)，能有效的排除羊痘弱毒疫苗免疫的干擾，特異性的檢測(cè)羊痘野毒感染。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102183643SQ20101062372
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者劉振勇, 才學(xué)鵬, 朱學(xué)亮, 李輝, 竇永喜, 駱學(xué)農(nóng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所