專利名稱：基于減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗及制備方法。
背景技術(shù)：
山羊痘是由山羊痘病毒(GPV)引起山羊或綿羊的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，為國際獸疫局(OIE)A類動物疫病和我國農(nóng)業(yè)部一類動物疫病。山羊痘不僅可以引起山羊皮膚和粘膜發(fā)生丘疹和皰疹，影響采食和消化機能，而且還可導致懷孕母羊流產(chǎn)，是威脅養(yǎng)羊業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重要疫病之一。目前，對山羊痘防控主要以接種弱毒疫苗預(yù)防為主，但山羊痘弱毒疫苗須在尾根皮內(nèi)注射或股內(nèi)側(cè)皮下注射，操作技術(shù)要求較高，且應(yīng)激反應(yīng)大，同時還存在著毒力返強危險性。因此，研究新型安全疫苗成為山羊痘防制的主要方向之一。據(jù)研究資料顯示，山羊痘病毒P32基因所編碼的P32蛋白是目前世界各地所有分離鑒定的山羊痘病毒共有且特異性強的結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強的抗原性，能誘導山羊細胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生特異性中和抗體和各種細胞因子，在山羊痘的預(yù)防與控制上發(fā)揮重要作用。以減毒沙門氏菌為載體的口服疫苗具有以下優(yōu)點一是高效遞呈抗原，即通過減毒沙門氏菌運載DNA疫苗能特異地將質(zhì)粒靶向傳遞給相關(guān)抗原遞呈細胞內(nèi)；二是持續(xù)性免疫刺激，即減毒沙門氏菌侵入宿主后，菌體及其質(zhì)粒在一段時間內(nèi)有限增殖，可持續(xù)刺激宿主；三是免疫佐劑作用，即沙門氏菌內(nèi)毒素可作為一種免疫佐劑，增強免疫應(yīng)答效果；四是接種方便，即以減毒沙門氏菌為載體的口服疫苗可采用滴鼻、點眼或口服等多種途徑免疫， 方便快捷；五是制備簡便，即接種前只需要將制備好的重組減毒沙門氏菌進行培養(yǎng)即可。關(guān)于以P32基因為靶基因的減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，提供一種以減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗及制備方法，該疫苗是以減毒沙門氏菌SL7207為載體的穩(wěn)定型山羊痘口服疫苗，對山羊腸道微生態(tài)平衡影響輕微，目的基因不與宿主染色體發(fā)生整合，具有良好的安全性；能誘導山羊產(chǎn)生抗GPV P32蛋白的血清IgG與SIgA，促進多種細胞因子如IL_2、IL-4與IFN-γ等的分泌，具有良好的體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答效果。本發(fā)明的技術(shù)方案含山羊痘病毒Ρ32基因真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1 (+)_P32的減毒鼠傷寒沙門氏菌，菌體濃度為108~9個/mL。所述的以減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗的制備步驟包括
第一，將真核表達質(zhì)粒PCDNA3. 1(+)氨芐青霉素抗性bla基因啟動子去除，構(gòu)建改良質(zhì)粒 pmcDNA3. 1 (+)；
第二，將PCR擴增從pMD-18T-P32/LD中獲取山羊痘病毒P32基因，定向插入步驟一制得的改良質(zhì)粒pmcDNA3. 1 (+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32 ；第三，將步驟二制得的重組質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32轉(zhuǎn)化至鼠傷寒減毒沙門氏菌 SL7207 (aro A_)中，構(gòu)建山羊痘口服疫苗；
第四，將步驟三制得的山羊痘口服疫苗進行體外培養(yǎng)，分析檢測其穩(wěn)定性、安全性以及免疫效果；
第五，分析檢測合格即制得以減毒沙門氏菌為載體的山羊痘口服疫苗。本發(fā)明有益效果本發(fā)明適用于山羊痘的免疫接種，防制山羊痘的發(fā)生與流行，同時具有良好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果
(1)免疫效果確實本發(fā)明利用減毒沙門氏菌具有細胞侵襲的特點，可將含P32基因的真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32直接送至細胞內(nèi)，能誘導免疫山羊產(chǎn)生良好的體液免疫、 細胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答；
(2)安全性能穩(wěn)定本發(fā)明采用的是減毒沙門氏菌，不會引起接種山羊發(fā)生臨床癥狀和病理變化；口服接種后也不會引起山羊胃腸道微生態(tài)發(fā)生明顯改變，同時山羊痘P32基因也不與宿主染色體發(fā)生整合現(xiàn)象；
(3)傳代性狀可靠由于本發(fā)明將pmcDNA3.1(+)的氨芐青霉素抗性bla基因啟動子去除而改良為pmcDNA3. 1，使攜帶真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32的減毒沙門氏菌(口服疫苗) 在體外連續(xù)培養(yǎng)18代，未發(fā)現(xiàn)攜帶質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，且其誘導山羊免疫應(yīng)答效果與第一代一致；
(4)疫苗制備簡單由于減毒沙門氏菌的培養(yǎng)需求不嚴，在普通培養(yǎng)基上能良好地生長，因此需要實施山羊痘免疫接種時，只需將制備好的重組減毒沙門氏菌(口服疫苗)進行培養(yǎng)即可。


圖1本發(fā)明的山羊痘口服疫苗的制備生產(chǎn)流程圖。
具體實施例方式
具體實施例方式
以減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗的原料為山羊痘病毒LD分離株、真核表達質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)和減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207 (aro A)。如圖1所示意，本發(fā)明的疫苗的制備方法為
第一，真核表達質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)的改良采用含R^I和MA/I酶切位點的氨芐青霉素抗性bla基因無啟動子特異性引物從真核表達質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)中擴增出無啟動子bla基因，瓊脂糖回收試劑盒回收純化，和MA/I雙酶切再回收純化，與同樣酶切處理的線性真核表達質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)進行連接，構(gòu)建改良真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1 (+)；
第二，重組真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32的構(gòu)建采用含Ba HI和Η /ΙΙΙ酶切位點的山羊痘病毒Ρ32基因特異性引物從山羊痘病毒LD分離株中擴增獲取GPV Ρ32基因，瓊脂糖回收試劑盒回收純化,PagI和Μ/"Ι雙酶切再回收純化，與同樣酶切處理的改良真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1 (+)進行連接，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32 ；
第三，重組減毒沙門氏菌的構(gòu)建將步驟二制得的重組真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32轉(zhuǎn)化至鼠傷寒減毒沙門氏菌SL7207(aro A_)中，構(gòu)建重組減毒沙門氏菌即山羊痘口服疫苗；
第四，重組減毒沙門氏菌的穩(wěn)定性檢測將構(gòu)建的重組減毒沙門氏菌分別接種于含Amp+和不含Amp-的LB液體培養(yǎng)中，37 °C培養(yǎng)Mh，再取菌液連續(xù)18代，采用PCR方法檢測重組減毒沙門氏菌中的改良真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32，以重組真核表達質(zhì)粒 pmcDNA3. 1-P32不丟失判定為合格；
第五，重組減毒沙門氏菌的安全性檢測將構(gòu)建的重組減毒沙門氏菌口服接種小白鼠 20只，IO9個菌體/mL, 2mL/只，于第3d、6d、9d、12d和15d時觀察小白鼠的臨床表現(xiàn)，并在每個時間段剖殺2只觀察內(nèi)臟組織病變情況，并采用熒光定量PCR方法檢測胃腸道主要細菌動態(tài)變化，若小白鼠未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀和病理變化，且不發(fā)生死亡，同時小白鼠胃腸道微生態(tài)未發(fā)生明顯變化，即說明所制備的重組減毒沙門氏菌(山羊痘口服疫苗)具有良好的安全性；
第六，重組減毒沙門氏菌的免疫效果檢測將構(gòu)建的重組減毒沙門氏菌口服接種小白鼠40只，IO9個菌體/mL, 2mL/只，于第8d、15d、22d、29d、36d、43d和50d時剖殺小白鼠，每次5只，收集血清樣本和組織樣本，測定血清特異性IgG水平、消化道粘膜SIgA含量、脾T 淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和血清主要細胞因子含量，以上述指標與未接種重組減毒沙門氏菌對照小白鼠呈現(xiàn)明顯提高者判定為免疫合格；
通過上述步驟證實基于減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗構(gòu)建成功。
權(quán)利要求
1.一種基于減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗，其特征在于含山羊痘病毒P32基因真核表達質(zhì)粒pmcDNA3. 1⑴-P32的減毒鼠傷寒沙門氏菌，菌體濃度為108~9個/mL。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種基于減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗的制備方法，其特征在于它包括以下步驟第一，將真核表達質(zhì)粒PCDNA3. 1(+)氨芐青霉素抗性bla基因啟動子去除，構(gòu)建改良質(zhì)粒 pmcDNA3. 1 (+)；第二，將PCR擴增從pMD-18T-P32/LD中獲取山羊痘病毒P32基因，定向插入步驟一制得的改良質(zhì)粒pmcDNA3. 1 (+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32 ；第三，將步驟二制得的重組質(zhì)粒pmcDNA3. 1-P32轉(zhuǎn)化至鼠傷寒減毒沙門氏菌 SL7207 (aro A_)中，構(gòu)建山羊痘口服疫苗；第四，將步驟三制得的山羊痘口服疫苗進行體外培養(yǎng)，分析檢測其穩(wěn)定性、安全性以及免疫效果；第五，分析檢測合格即制得以減毒沙門氏菌為載體的山羊痘口服疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于減毒沙門氏菌為載體山羊痘口服疫苗及制備方法，本發(fā)明疫苗含山羊痘病毒P32基因真核表達質(zhì)粒pmcDNA3.1(+)-P32的減毒鼠傷寒沙門氏菌，菌體濃度為108~9個/mL。本發(fā)明山羊痘口服疫苗安全有效，可誘導山羊產(chǎn)生機體產(chǎn)生特異性的體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答，能有效預(yù)防山羊痘的發(fā)生與流行。
文檔編號A61K39/275GK102233131SQ201110189128
公開日2011年11月9日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者周碧君, 尹傳寶, 文明, 王開功, 程振濤 申請人:貴州大學