制備dc-ctl的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤治療試劑盒領(lǐng)域，尤其是涉及一種制備DC-CTL的試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002](一）已有技術(shù)描述 1.免疫細胞治療 近幾十年來，腫瘤治療取得了較大的進展，但仍存在一些難題：手術(shù)治療可有效地降低 腫瘤負荷，但對殘留的微小癌灶和轉(zhuǎn)移癌灶效果欠佳；放化療可減小腫瘤病灶并抑制腫瘤 細胞的生長，但是不能有效區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞，對正常組織毒副作用較大。隨著細胞 生物學(xué)及分子生物學(xué)的快速發(fā)展，靶向性強、毒副作用小的免疫細胞療法受到人們極大關(guān) 注。免疫細胞治療指向腫瘤患者體內(nèi)輸入具有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤細胞 或激發(fā)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達到治療腫瘤的目的。作為一種新型的腫瘤治療方式，免 疫細胞治療現(xiàn)已成為腫瘤治療的重要輔助手段，其克服了臨床常規(guī)治療的局限性，可有效 地消除微小殘留癌灶，抑制腫瘤復(fù)發(fā)，提高患者免疫能力，在腫瘤臨床治療領(lǐng)域具有廣闊的 前景。
[0003] 2. DC 樹突狀細胞Oendritic Cell，DC)是由美國學(xué)者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是 目前為止發(fā)現(xiàn)的抗原提呈功能最強的免疫細胞，在免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和調(diào)控中發(fā)揮重要作 用。DC能夠顯著刺激初始T細胞增殖，是機體適應(yīng)性T細胞免疫應(yīng)答的啟動者，在適應(yīng) 性T細胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵的"決策作用"，因此它是腫瘤免疫治療中增強抗腫 瘤抗原反應(yīng)的理想治療手段之一，在腫瘤疫苗領(lǐng)域已備受關(guān)注。自從1996年美國斯坦福 大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Hsu等在Nature Medicine上報道了全球首項DC腫瘤疫苗臨床研究以來， 誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性效應(yīng)細胞的DC腫瘤疫苗相關(guān)研究持續(xù)升溫，大量的臨床研究相繼開 展。Sipuleucel_T(Dendreon，美國）、CreaVaxRCC(CreaGene，韓國）和 Hybricell(Genoa Biotechnologia，巴西）等DC腫瘤疫苗相繼獲得上市批準。DC腫瘤疫苗已經(jīng)由實驗室走向 臨床，其可行性和安全性以及對部分患者的有效性已經(jīng)得以證實。
[0004] 目前DC疫苗制備方法包括兩種方法：抗原負載致敏DC和基因修飾DC。
[0005]1)抗原負載致敏DC?？乖撦d致敏DC的方法主要有腫瘤細胞全抗原致敏和腫瘤 抗原多肽致敏。研究表明鑒于許多腫瘤抗原仍未明確，采用全腫瘤抗原誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生的 免疫反應(yīng)范圍更廣，多種不同腫瘤抗原成分同時刺激DC，誘導(dǎo)出針對不同抗原決定簇的特 異性CTL，殺傷范圍更廣，可以避免腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，然而因為全腫瘤抗原成分不明 確，可能誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，存在安全隱患。目前市面上有人工合成腫瘤抗原多肽商品，成 分明確，安全性高，用人工合成的腫瘤抗原多肽負載DC激活的CTL殺傷靶點明確，特異性 強，但是單一抗原多肽負載DC，刺激誘導(dǎo)的CTL只能特異性殺傷表達單一抗原多肽的腫瘤 細胞，殺傷范圍局限。
[0006] 2)基因修飾DC。目前常用腫瘤抗原基因、共刺激分子、細胞因子、趨化因子等修飾 DC，方法包括病毒載體和理化方法。研究表明理化方法較病毒載體不僅轉(zhuǎn)染效率低下，而 且可能引起DC死亡和表面標志的喪失。而病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，且能負載較大基因片段， 對于靜止期和分裂期細胞都有作用，外源基因表達也更高效，然而慢病毒轉(zhuǎn)染效率雖高，但 會將外源性基因插入宿主細胞基因組，危險程度高，腺病毒相對安全，但是轉(zhuǎn)染效率不甚理 想。
[0007] 3. DC-CTL 細胞毒性了淋巴細胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)，是效應(yīng)T細胞，可特異性識別 MHC分子提呈的抗原，進而特異性地殺傷腫瘤細胞及受微生物感染的細胞等。CTL可高效且 特異地殺傷靶細胞，而不損害正常組織。CTL殺傷腫瘤細胞的機制包括：1)釋放顆粒酶和穿 孔素直接誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡；2)通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；3)分泌IFN-y和 TNF-a等細胞因子殺傷腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞生長。
[0008] 用特定的腫瘤抗原負載DC，致敏的DC被誘導(dǎo)成熟后分泌大量的IL-12,進而有效 地刺激初始T細胞活化、增殖，T細胞活化后分泌的IL-2通過自分泌的方式進一步刺激自 身的增殖，大量增殖的T細胞最終分化為效應(yīng)T細胞，發(fā)揮靶向抗腫瘤效應(yīng)。致敏DC誘導(dǎo) 的腫瘤抗原特異性CTL主要為⑶8+T細胞，部分為⑶4+T細胞。作為效應(yīng)T細胞，CTL可高 效地殺傷表達特定腫瘤抗原的腫瘤細胞。
[0009] (二）已有技術(shù)問題及缺陷描述 1. DC疫苗制備技術(shù)存在缺陷： 1) 自體腫瘤組織來源的全腫瘤抗原獲取不易，且全腫瘤抗原成份眾多，可能引發(fā)自身 免疫反應(yīng)，存在安全風(fēng)險； 2) 使用人工合成的單一腫瘤抗原多肽負載DC制備DC疫苗，成分明確，但負載的腫瘤抗 原多肽數(shù)量單一，治療效果有限；負載某一腫瘤抗原多肽的DC激活的CTL只能有效殺傷表 達該腫瘤抗原的腫瘤細胞； 3) 基因修飾DC方法尚不完善，轉(zhuǎn)染效率低或者安全指數(shù)低。
[0010] 2.現(xiàn)有技術(shù)制備DC疫苗時，一般是將抗原和TNF- a與未成熟DC共培養(yǎng)，以誘導(dǎo) DC成熟和實現(xiàn)DC的抗原呈遞作用，然而DC的抗原呈遞效率不高，激活的CTL殺傷活性不 強。
[0011] 3.目前制備CTL的常規(guī)方法為使用流式細胞儀或免疫磁珠分選出CD8+T細胞， 然后使用細胞因子組合進行細胞的擴增，常規(guī)使用的細胞因子包括IL-2、IFN-y、IL-7和 PHA。然而，流式細胞儀分選細胞的方式本身就會對細胞活性造成一定的影響，而且流式細 胞儀要分選出一定數(shù)量的目的細胞的話，陽性細胞比例一定要高，不然時間會比較長，對細 胞活性影響較大，如果采用提高細胞初始密度的方法，一是可能堵管，二是會增加分選的誤 判和浪費，細胞太多讀取分析的時間短，判斷會受到影響。再者，現(xiàn)在國內(nèi)進行流式細胞儀 分選細胞的價格不菲。免疫磁珠分選細胞，能得到的目的細胞數(shù)量比較大，對細胞活力影響 小，純度也能達到90%，但是磁性微珠不能自動脫離目的細胞群，難以完全洗脫而成為了非 細胞雜質(zhì)，對目的細胞的后續(xù)培養(yǎng)存在一定的影響。
[0012] 此外，現(xiàn)有的細胞因子組合培養(yǎng)擴增的CTL數(shù)量不足，細胞活性不高，難以滿足臨 床需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的之一在于提供制備DC-CTL的試劑盒，所述制備DC-CTL的試劑盒包 括：分離單個核細胞的試劑； 誘導(dǎo)DC分化成熟的試劑； 致敏DC的腫瘤抗原活性表位肽； 促進CTL擴增和激活的試劑，所述促進CTL擴增和激活的試劑為抗CD3單克隆抗體、 IFN-y、IL-1 a、PHA、IL-2、IL-7中的一種或者幾種與抗CD28單克隆抗體、抗IC0S單克隆 抗體的組合。
[0014] 進一步的：所述分離單個核細胞的試劑為Ficoll淋巴細胞分離液，或者percoll 細胞分離液。
[0015] 誘導(dǎo) DC 分化成熟的試劑：400-600U/mL IL-4、800-1200U/mL GM-CSF、800-1200U/ mL TNF-a (優(yōu)選中位值）。
[0016] 所述致敏DC的腫瘤抗原活性表位肽（根據(jù)腫瘤所表達的腫瘤抗原選擇雙肽 或多種肽的組合）：包括但不限于 MAGE1 :161-169、MAGE-A12 :170-178、AM-2 :14-23、 TRP-2 :180-188、gplOO :209-217、HER2 :369-377、HER2 :342-350、IL-13Ra 2 :345-354、 PSA :248-257、PAP213-221、PAP112-120、PSMA441-450、PSMA624-632、ES0-1:161-180、 CEA652-660、survivin96-104、EGFR800-809、MRP3 :503-511、SART2 :93-101。
[0017]所述促進CTL擴增和激活的試劑：50-80ng/mL抗⑶3單克隆抗體（優(yōu)選50)、 1000-1200U/mL IFN- Y (優(yōu)選 1000)、80-150U/mL IL-1 a (優(yōu)選 1〇〇)、50-100ng/mLPHA (優(yōu) 選 100)、300-500U/mL IL-2 (優(yōu)選 300)、20-30ng/mL IL-7 (優(yōu)選 30)、20-50ng/mL 抗 CD28 單克隆抗體（優(yōu)選30)、20-40ng/mL抗IC0S單克隆抗體（優(yōu)選30)。
[0018] 進一步的，所述gp100 :209-217的氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示，所述 HER2:369-377氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0019] 進一步的：所述各種腫瘤抗原活性表位肽的濃度為10 y g/ml-20 ii g/ml。
[0020] 所述DC-CTL試劑盒還包括組份： E) PBS緩沖液； F) 無血清培養(yǎng)基。
[0021] 本發(fā)明的另一目的在于應(yīng)用前述的制備DC-CTL的試劑盒制備DC-CTL，包括步驟： A) 使用分離單個核細胞的試劑分離單個核細胞； B) 使用誘導(dǎo)DC分化的試劑誘導(dǎo)外周血單個核細胞向DC分化； C) 使用腫瘤抗原活性表位肽致敏DC，然后刺激DC成熟； D) 使用促進CTL擴增和激活的試劑擴增外周血單個核細胞中的T淋巴細胞，并誘導(dǎo)T 淋巴細胞向CTL分化與增殖。
[0022] 進一步的：所述步驟C)中添加腫瘤抗原活性表位肽及TNF-a的順序為：先加入 腫瘤抗原活性表位肽，l_2h后再添加TNF- a。
[0023] 進一步的：所述步驟D)中添加抗CD28單克隆抗體以及添加抗IC0S單克隆抗體的 順序為：添加抗CD28單克隆抗體1. 5-3h (優(yōu)選為2h)后再添加抗IC0S單克隆抗體。
[0024] 本發(fā)明使用兩種或多種腫瘤抗原活性表位肽致敏DC的過程為先加入腫瘤抗原活 性表位肽，待DC攝取腫瘤抗原活性表位肽后，再加入炎性介質(zhì)TNF- a，以充分地刺激DC成 熟，更好地