專利名稱：Prohibitin蛋白抗體在制備診斷老年性癡呆的試劑盒中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及Prohibitin蛋白抗體在制備診斷老年性癡呆的試劑盒中的應用。
背景技術(shù)：
當前，世界各國人口老齡化速度日趨加快，經(jīng)濟發(fā)達國家人口平均壽命已達到或接近80歲。我國人口平均壽命70歲，其中60歲以上的老人已達I. 3億，預計在本世紀，衰老以及老化相關疾病如老年性癡呆等將成為影響人類健康和生活質(zhì)量的重要因素。在西方國家及我國上海等大城市，老年性癡呆己成為繼心臟病、腫瘤和腦卒中之后第四位致死原因。老年性癡呆，又稱為阿爾茨海默氏癡呆(Alzheimer’s disease, AD )，1907年由德國神經(jīng)病理學家Alois Alzheimer首先報道,屬于系統(tǒng)性神經(jīng)退化疾病，以高級認知功能 降低為特點；是普遍、迅速增長、常發(fā)生于老年及中年末期的年齡依賴性的老年性癡呆。目前在老年人口中發(fā)病率為7. 38-18. 2%，其發(fā)病率增長勢頭驚人，全世界現(xiàn)有AD病人1800萬，預計2025年將達到3000萬人，國內(nèi)65歲以上患病率為6. 5%。美國用于診斷和護理AD的開支為500億美元/年，如果推遲一年發(fā)病，將節(jié)省開支100億美元。AD是神經(jīng)變性性疾病，導致認知損害(健忘、失語、失用和失認)，以進行性癡呆為臨床特征，起病緩慢，早期為近事記憶減退和性格改變(如出現(xiàn)固執(zhí)、主觀、自私、急躁、淡漠，常有睡眠節(jié)律改變)；中期以理解、判斷、計算等智能活動全面減退為特點；后期則出現(xiàn)嚴重癡呆、語言障礙、ニ便失禁、生活不能自理等表現(xiàn)。腦電圖出現(xiàn)慢波慢活動，影象學檢查有腦萎縮。老年期癡呆，首先必須確定癡呆，國內(nèi)外廣為接受DSM-III-R診斷標準。然后再判斷可逆及不可逆的癡呆，一般需要收集發(fā)病年齡、病情進展等病史和臨床表現(xiàn)，并做相關的生化、頭部影像和腦電活動等輔助檢查。一些神經(jīng)心理學檢查量表，比如HDS-R長谷川簡易癡呆、MMSE簡易精神狀態(tài)、ADL日常生活能力、WAIS智力等量表常用來進行患者癡呆嚴重程度的評定。其次診斷，目前比較權(quán)威的仍是“NINCDS-ADRDA診斷標準”，它于1984年公開發(fā)表，包括“可能的、支持可能的、可疑的、確定的”等不同程度的診斷依據(jù)，對AD的診斷敏感性88%，特異性達91%，診斷可信限為92%。以其作為參考，制定了我國AD的CMA診斷標準。最后必須做好鑒別診斷，老年期癡呆的原因多種多樣，也包括一些治療可能相反的原因，如憂郁癥、藥物損害、代謝改變、營養(yǎng)缺乏等，必須充分進行鑒別診斷。從發(fā)病率來說，AD、VD(血管性癡呆)、MID(多發(fā)梗塞性癡呆)常是最需要進行鑒別的。常用Hackinki缺IfIL量表判斷)]畫IIIL管病，再用DSM-IV進行AD， VD的鑒別診斷。因此，單ー臨床試驗不能確診AD，必須依賴全面的健康史，物理檢查，神經(jīng)精神狀態(tài)評價，血、尿分析，腦影像學、腦電流圖、正式精神病學評估和神經(jīng)心理測試等綜合判斷。臨床也正在不斷地尋找有助于早期診斷的方法，比如建議載脂蛋白E(ApoE)基因型多態(tài)性分析可作為AD的ー個診斷參考指標。認為ApoE不僅參與脂類代謝，而且與AD發(fā)病有密切的關系，ApoE能促進淀粉樣蛋白(amyloidp-protein, )纖維的形成，與共同形成復合物存在于老年斑((senile plaque, SP)中，介入腦神經(jīng)細胞的變性過程。國內(nèi)研究ApoE基因多態(tài)性后認為，ApoE e 4等位基因是個體發(fā)生AD的危險因素，內(nèi)含子I內(nèi)增強子元件(IEl) G/G與e 4相關，能増加AD發(fā)病風險。對早老素(PS)的基因多態(tài)性的研究，證明PS-I 1/1基因型和I等位基因可増加散發(fā)性與晚發(fā)性AD發(fā)病風險。其他用膽堿能拮抗劑(如托毗卡胺)進行擴瞳實驗、進行血漿和/或腦脊液的激素、神經(jīng)膚、免疫復合物、微量元素及生化等檢查輔助診斷，但有證據(jù)表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)和AD整個進展過程，甚至涉及全部的生化異常。因此，迄今為止，AD只有通過腦活檢或尸體解剖才能確診。相對滯后的確診和治療，嚴重影響了 AD的預后。所以，AD分子水平作用機制的確立是研究簡便、快捷、確切的AD早期診斷方法的基礎。AD是年齡相關的多因素疾病，起始病因可引起編碼APP等其他與家族性(familial AD，F(xiàn)AD)或散發(fā)性((sporadic AD, SAD) AD發(fā)病機制有關蛋白的基因突變。FAD有遺傳性或表型等不同表現(xiàn)，即不同的基因突變可引起AD表型，同一基因的不同突變可引 起不同表型的疾病，包括Alzheimer型癡呆，和伴有腦出血及卒中的腦淀粉樣血管病。老化、性別、腦創(chuàng)傷及ApoE基因的變異都是增加AD形成的危險因子，這些特點都使得AD的病因和病理機制非常復雜。許多科學家就AD的確切病因及發(fā)病機制進行了不斷的探索和研究，但其致病原因至今尚未闡明。目前認為AD是由遺傳學因素、環(huán)境因素和代謝因素等多種因素相互聯(lián)系、相互影響、共同作用所引起的ー種病理過程，尤其是近年來由于分子生物學的發(fā)展，促進了 AD病因?qū)W研究。AD分子水平研究的目的是盡快全面了解淀粉樣變等AD病理產(chǎn)生的原因，在臨床 癥狀出現(xiàn)前正確預測發(fā)病危險，幫助尋求有效的干預防治措施，為進ー步治療提供理論基礎，同時可延緩衰老，提高老年人生存質(zhì)量，因此AD分子水平作用機制的研究已成為醫(yī)學界乃至整個人類社會廣泛關注的重大課題。是老年斑的核心成分，自1987年被首次分離成功后，它的結(jié)構(gòu)及功能一直是科學工作者研究的焦點，從離體實驗到體內(nèi)實驗，從細胞水平到分子水平的研究都顯示A 3是AD最主要的致病因子，是AD形成和發(fā)展的關鍵因素，由此而形成了淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，這是目前解釋老年癡呆病因的主流學說。該學說認為腦內(nèi)AP聚集是AD患者的原發(fā)性改變，其他病理過程均由A3產(chǎn)生和清除的不平衡所致，由此形成了 3淀粉樣蛋白級聯(lián)假說的理論依據(jù)。具體內(nèi)容是早發(fā)型AD患者由于APP，PSl，PS2基因突變使A3生成増加，晚發(fā)型患者由清除機制障礙致AP隨年齡逐漸上升，兩者共同作用的結(jié)果使AP積聚、沉積。AP可激活小膠質(zhì)和星形膠質(zhì)細胞，伴隨著炎癥反應，導致突觸進行性損傷，改變了神經(jīng)元內(nèi)的離子平衡狀態(tài)，產(chǎn)生氧化損傷，改變了激酶/磷酸酶活性，引起神經(jīng)元死亡，逐漸產(chǎn)生癡呆。這ー假說主要證據(jù)包括I.同時表達突變的人淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein, APP)和tau蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠與單一 tau蛋白表達的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，前者NFTs更多，而AP斑塊的結(jié)構(gòu)和數(shù)量基本沒有差異,提示AD患者A3改變發(fā)生在tau改變之前,進而經(jīng)實驗證實了 AP與tau蛋白因與果的關系；2.編碼tau蛋白的基因突變，在腦內(nèi)可引起嚴重的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，但沒有AP沉積，提示tau蛋白改變不能誘導出AD特征性的類淀粉樣蛋白斑塊，因此，神經(jīng)元纖維纏結(jié)很可能在AP形成斑塊之后發(fā)生；3. APP轉(zhuǎn)基因小鼠和ApoE缺陷小鼠雜交的后代，腦內(nèi)AP沉積明顯減少，提示ApoE基因突變的致病作用很可能涉及AP代謝；4. AP分解代謝和清除方面的功能障礙對晚發(fā)型AD起作用。導致AD主要有以下的機制
(I)基因突變基因突變因素主要與家族型AD密切相關，早發(fā)型AD患者由于APP，PSI，PS2基因突變使AP生成増加，晚發(fā)型患者則由ApoE基因突變所致。①APP基因
的前體蛋白基因，位于人21號染色體，APP發(fā)生基因突變導致APP異常表達和AP聚集沉淀。某些基因調(diào)控的異常也會刺激APP基因過度表達，引起AP沉淀。②Presenilin基因(PS)其中PSl位于14號染色體，PS2位于I號染色體，大多數(shù)家族型AD患者均發(fā)現(xiàn)PSI，PS2突變，Presenilin蛋白可能參與APP蛋白的合成后加工，最終導致AP異常產(chǎn)生、沉淀形成SPs或神經(jīng)退行病變。也有研究者推測Presenilin參與介導神經(jīng)細胞凋亡。③ApoE基因ApoE在脂質(zhì)運輸過程導致膽固醇運輸功能障礙，最后致使突觸丟失。 (2)誘導細胞凋亡細胞凋亡涉及到復雜的調(diào)控機制，其中Bcl-2家族起了極其重要的作用，其家族成員Bcl-2抑制細胞凋亡的發(fā)生，而Bax促進細胞凋亡的發(fā)生，Bax/Bcl-2組成了ー個平衡體系，AP能下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Bax表達，促進細胞凋亡，另外AP的沉淀可在沉淀激活P53，促進其表達并增加誘導細胞凋亡。(3)觸發(fā)氧化應激AD與氧化應激的關系已成為探討AD發(fā)病機制的新研究方向，外源性給予A3損傷神經(jīng)元有氧化應激介導的證據(jù)，提示A3本身可觸發(fā)機體氧化損傷。
神經(jīng)毒性機制可能是由于纖維狀AP的本身具有自由基性質(zhì)，促使細胞外自由基鏈反應，引起細胞膜脂質(zhì)過氧化物生成增多，破壞細胞膜功能，使細胞膜通透性増加，細胞外Ca2+進入細胞內(nèi)，激活鈣依賴性蛋白酶、脂酶、激酶，使細胞內(nèi)自由基增多，從而損傷細胞器和細胞骨架，最后導致細胞死亡。(4)免疫炎癥作用AD發(fā)生通常是ー個緩慢的炎癥病理改變過程，SP中AP沉積激活小膠質(zhì)細胞引起炎癥反應是AD的核心病理機制。炎癥初期小膠質(zhì)細胞表達吞噬受體清除AP，隨著AP增多，AP封閉了吞噬受體，使小膠質(zhì)細胞失去吞噬作用，同時，小膠質(zhì)細胞被激活釋放炎性細胞因子如IL-1、IL_6、腫瘤壞死因子-a (TNF- a )等，這些炎性因子反過來激活小膠質(zhì)細胞和星形細胞產(chǎn)生APP及Aに形成惡性正反饋環(huán)路，導致APP及A 3增加。(5)細胞骨架改變微管是神經(jīng)細胞中參與胞體與軸突營養(yǎng)輸送的通道，是細胞骨架的重要成分，它由微管蛋白和微管相關蛋白組成，tau蛋白是MAP的主要成分。在AD腦內(nèi)，異常過度磷酸化的tau蛋白含量顯著升高并聚集成雙螺旋絲形式，喪失了促進微管組裝的生物活性導致細胞骨架的結(jié)構(gòu)異常和神經(jīng)細胞的死亡。由于AD研究的樣品的來源受到限制，而其病因尚未完全闡明，因此建立良好的AD研究動物和細胞模型尤為重要。AD動物模型大致有損傷模型、自然衰老模型和轉(zhuǎn)基因動物模型三大類。每ー種模型在一定程度上、某些方面模擬了 AD癥狀和病理改變，但均有各自的適用范圍和局限性，對于研究AD分子機制方面不如細胞模型。Yankner等在1990年首先發(fā)現(xiàn)并證實合成的AP對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元有毒性作用，體外培養(yǎng)的細胞模型以其簡便、實用的優(yōu)點逐漸被廣泛用來研究AP的神經(jīng)毒性機制。實驗常用的細胞有原代培養(yǎng)的海馬、大腦皮層等神經(jīng)元。其中WAP作用原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元模型最為常見。該模型有以下優(yōu)點海馬區(qū)是AD中損傷最嚴重的部位，同時與學習、記憶密切相關，而且原代培養(yǎng)更符合實際的情況，因此選用原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細胞作為研究AD的細胞模型較為理想。但是由于原代培養(yǎng)大多采取大鼠等實驗動物來研究，而實驗動物與人之間細胞生理機能、代謝途徑、基因組成、蛋白質(zhì)構(gòu)相上存在著一定的差異。就AD病而言大鼠、小鼠的A3氨基酸序列與人的相比只有3個氨基酸不同，但卻能使保持較穩(wěn)定的可溶性狀態(tài)，而不發(fā)生聚集、沉淀產(chǎn)生癡呆。另外原代細胞培養(yǎng)操作難度大，周期長、培養(yǎng)系統(tǒng)不夠穩(wěn)定；還有原代培養(yǎng)屬于混和培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中膠質(zhì)細胞也活躍增生，對實驗的標準化不利，結(jié)果缺乏說服力。為了克服原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元模型的不足，研究中經(jīng)常使用AP損傷人神經(jīng)細胞相關的細胞系構(gòu)建AD模型，常用的細胞系有星型膠質(zhì)細胞瘤源性細胞系B12/50，大鼠嗜福細胞瘤細胞系PC12，人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y (又名成神經(jīng)瘤細胞系)，這些細胞系具有神經(jīng)元的形態(tài)特點，能在體外不斷傳代，較原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元容易培養(yǎng)。本發(fā)明選擇SH-SYSY細胞建模，用A P 25_35作用于SH-SY5Y細胞構(gòu)建A ^ 25_35損傷神經(jīng)元的體外培養(yǎng)模型。AD的發(fā)生與腦內(nèi)多種調(diào)控基因的失調(diào)密切相關，但它們與疾病的因果關系還有待 進ー步證實，因此，探明影響AD發(fā)生發(fā)展的基因的種類、結(jié)構(gòu)、功能及基因表達調(diào)控機制，對于掲示AD的發(fā)病機制具有重要意義。傳統(tǒng)的實驗方法多是針對某一或幾個AD相關的基因進行相對孤立地研究，而AD的發(fā)病機制十分復雜，是遺傳背景和外在因素(如環(huán)境條件)相互作用的結(jié)果，必然涉及多個基因和蛋白的表達調(diào)控，必須整體地、全面地了解發(fā)病的機制。蛋白質(zhì)組學可以一次檢測大量蛋白甚至細胞內(nèi)幾乎所有蛋白的表達情況，獲得大量的數(shù)據(jù)并進行平行分析，同時進行多祥本比較，由于排除了一系列復雜因素導致的各項比較實驗的內(nèi)在差異，使一次性多祥本比較性分析的精確性大大提高，具有高通量、自動化的特點，適合用于老年癡呆等神經(jīng)退行性病變及各種腫瘤發(fā)生機制的研究。直到20世紀90年代中期，生物化學家、分子生物學家和細胞生物學家還在研究單獨的基因和蛋白質(zhì)或與生物化學途徑相關的少量組分。那時可用的技術(shù)有Northern印跡法(用于基因表達分析)和western印跡法(用于蛋白質(zhì)分析)，利用這些技術(shù)研究和分析多基因或多蛋內(nèi)質(zhì)是非常因難的。蛋白質(zhì)組學的出現(xiàn)使大規(guī)模、高通量的蛋白質(zhì)研究成為可能。以下4種重要工具的發(fā)展和結(jié)合使用給研究人員提供了靈敏性和專ー性較高的識別和鑒定蛋白質(zhì)的方法。第一種工具是數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)、EST和基因組序列數(shù)據(jù)庫共同提供了生物表達全部蛋白質(zhì)的完整數(shù)據(jù)庫目錄。例如，根據(jù)對果蠅的所有編碼序列的分析，有110個果蠅基因編碼具有EGF類結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，87個基因編碼具有酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在進行果蠅蛋白質(zhì)組學研究時，檢索大量已知的可能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。當用限定的序列信息，甚至原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索時，可以根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫的匹配情況鑒定蛋白質(zhì)組分。第二種工具是質(zhì)譜(MS)。質(zhì)譜儀的使用在過去十年中有了極大的革新，在發(fā)展為分析生物分子，特別是分析蛋白質(zhì)和肪的高靈敏度和肽可靠性上達到頂點。MS儀器的使用可提供三類分析，這三類分析在蛋白質(zhì)組學分析中都非常有用。首先，MS可以進行IOOkDa或更大完整蛋白質(zhì)的精確質(zhì)量測定。估計蛋白質(zhì)質(zhì)量的最好方法是MS分析，而不是測定蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的遷移。高精度蛋白質(zhì)質(zhì)量測定的應用有限，因為它們往往不夠靈敏。凈質(zhì)量對精確鑒定蛋ロ質(zhì)往往是不充分的。其次，MS也能對蛋白質(zhì)水解消化產(chǎn)生的膚進行精確的質(zhì)量測定。相對于完整蛋白質(zhì)質(zhì)量測定，肽質(zhì)量測定可以有高靈敏度和高質(zhì)量準確度?？梢灾苯佑秒馁|(zhì)量測定數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫中進行檢索，這樣常?？梢源_切鑒定靶蛋白質(zhì)。最后，MS可以對蛋白質(zhì)水解消化得到的膚序列進行分析。日前認為MS是膚序列分析中的最新技木。MS序列數(shù)據(jù)為蛋白質(zhì)鑒定提供了最有力和最精確的方法。蛋白質(zhì)組學的第三個必要工具是對數(shù)據(jù)庫中特定蛋白質(zhì)序列與MS數(shù)據(jù)進行比對的各種軟件。前面提到從MS數(shù)據(jù)可以測定序列，但是這種從頭開始分析成百上千的譜圖時是ー項費時費力的任務。蛋白質(zhì)組學軟件將未分析的MS數(shù)據(jù)，在特定算法的幫助下與蛋白質(zhì)、EST和基因組序列數(shù)據(jù)庫的序列相比對，自動檢測大量用于蛋白質(zhì)序列匹配的MS數(shù)據(jù)。然后研究人員檢查自動槍測的結(jié)果，估計數(shù)據(jù)的質(zhì)量，所用的時間比手工解釋每ー張譜圖要少得多。蛋白質(zhì)組學的第四種必需工具是蛋白質(zhì)的分析分離技木。在蛋白質(zhì)組學中蛋白 質(zhì)分離有兩個目的。第一，通過將蛋白質(zhì)混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡化復雜蛋白質(zhì)混合物。第二，蛋白質(zhì)的分離分析可以比較兩個樣品蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)，研究者可以標記用于分析的特定蛋白質(zhì)。2D-SDS-PAGE是員廣泛用于蛋白質(zhì)組學的技木。2D凝膠電泳也許是在復雜樣品中分離蛋白質(zhì)的最好單項技木。其他的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，包括1D-SDS-PAGE、高效液相層析(HPLC)、毛細管電泳(CE)、等電聚焦(IEF)和親和層析，也都是分析蛋白質(zhì)組學的有用工具。最有力的技術(shù)是將不向的蛋白質(zhì)和膚分離技術(shù)結(jié)合為多維技術(shù)。例如，離子交換液相層析(LC)與反相(RP)-HPLC的串聯(lián)是分離復雜肽混合物的有カエ具。PHB蛋白包括phbI和phb2，1989年MeeIung等首先從老鼠肝臟內(nèi)克隆出哺乳動物的Phbl基因。Phbl被認為是ー種細胞增殖抑制因子，因此命名為Prohibitin。PHB已被證實存在于果蠅、酵母和植物中。同Phbl —祥，phb2在人和嚙齒類動物間以及低等生物中都高度保守。近來發(fā)現(xiàn)PHB既存在于線粒體內(nèi)膜上，發(fā)揮分子伴侶作用，也存在于細胞核內(nèi)，發(fā)揮著負性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Phbl蛋白發(fā)現(xiàn)存在于細胞核，并且配合轉(zhuǎn)錄因子在細胞周期過程中發(fā)揮重要作用。Phb2同樣影響細胞核轉(zhuǎn)錄因子，作為ー種雌激素受體抑制因子研究多年的REA最終被克隆發(fā)現(xiàn)序列同源于phb2。Phbl和phb2已被證實存在于質(zhì)膜，脂滴和脂筏前體中。此外woodloek等發(fā)現(xiàn)細胞漿里也有少量的PHB表達，可以與B淋巴細胞表面的IgM發(fā)生非共價結(jié)合，可能參與B細胞的早期信號傳遞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從蛋白質(zhì)組學出發(fā)，以比較蛋白組學技術(shù)為研究手段，對細胞樣品中蛋白質(zhì)進行整體水平研究，通過ニ維凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，建立A P 25_35作用的SH-SY5Y細胞和作為對照組的正常SH-SY5Y細胞的差異蛋白圖譜；用生物質(zhì)譜技術(shù)對差異蛋白質(zhì)進行分析，建立了蛋白質(zhì)肽指紋圖譜和肽序列標簽，結(jié)合生物信息學軟件查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，找到了ー種在AD中存在的差異表達的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Prohibitin蛋白。進ー步的免疫印跡試驗證實，Prohibitin蛋白的確在AD患者和正常個體血清中存在顯著的差異表達。基于Prohibitin蛋白與AD的這種相關性,該蛋白可以作為ー個蛋白質(zhì)分子標記，對其表達量進行檢測可以用于檢測AD。本發(fā)明的ー個目的在于提供一種檢測老年性癡呆的試劑盒。本發(fā)明的另ー個目的在于提供ー種Prohibitin蛋白抗體在制備用于檢測老年性癡呆試劑盒中的應用。Prohibitin蛋白與AD的相關性為AD的診斷和/或治療提供了一條全新的途徑。


圖I為AD患者和正常個體血清中Prohibitin蛋白免疫印跡檢測結(jié)果。其中，第I泳道為正常個體血清樣本，2-4泳道分別為3例AD患者的血清樣本。上部為Prohibitin蛋白，下部為作為內(nèi)參的P-Actin蛋白。
具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進ー步對本發(fā)明加以說明。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，按照常規(guī)條件操作或按照制造廠商建議的條件。本發(fā)明從蛋白質(zhì)組學出發(fā)，以比較蛋白組學技術(shù)為研究手段，對細胞樣品中蛋白質(zhì)進行整體水平研究，通過ニ維凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，建立A P 25_35作用的SH-SY5Y細胞和作為對照組的正常SH-SY5Y細胞的差異蛋白圖譜；用生物質(zhì)譜技術(shù)對差異蛋白質(zhì)進行分析，建立了蛋白質(zhì)肽指紋圖譜和肽序列標簽，結(jié)合生物信息學軟件查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，找到了ー種在AD中存在的差異表達的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Prohibitin蛋白。進ー步的免疫印跡試驗證實，Prohibitin蛋白的確在AD患者和正常個體血清中存在顯著的差異表達。實施例I、AD細胞模型樣品的制備
I.細胞培養(yǎng)
從液氮中取出冷凍SH-SYSY細胞進行復蘇，迅速投入37°C水浴中，約Imin溶化，恢復至室溫的15%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至原體積5倍(8-10ml), IOOOrpm低速離心，IOmin,棄上清，沉淀用15%胎牛血清培養(yǎng)基15ml，37°C，5% CO2培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，當細胞長滿培養(yǎng)瓶底面時傳代換液(大約48h)，倒掉舊培養(yǎng)液，用0. 25%胰酶作用細胞lmin，當細胞形態(tài)變?yōu)閳A形時立即停止消化，然后用培養(yǎng)液直接吹打法傳代(也可以直接吹打)。對生長狀態(tài)良好的細胞適當凍存保種，其方法為收集細胞IXlO7細胞于用15%胎牛血清培養(yǎng)基中，另加DMSO至終濃度為20%，采用梯度降溫(減少-15°C左右細胞內(nèi)形成冰晶對細胞的損傷)，立即4°C，30min再_20°C，4_8h再_70°C過夜，最后液氮保存。2.藥物處理細胞制備AD細胞模型
(1)收集SH-SYSY細胞，血球板進行細胞記數(shù)，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為IXlO7細胞分別加入兩個培養(yǎng)瓶，保證細胞數(shù)一致。加入15%的FBS的RPMI 1640, 37°C, 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)
(2)凝聚態(tài)AP 25_35的制備用超純水將凍干的A P 25_35充分溶解配成lmmol/L的儲存液，于_20°C保存，臨用前于37°C放置4-24h使其形成凝聚態(tài)A ^ 25_35，加入其中一瓶進行處理，工作濃度為10 u mol/L,另ー瓶作為對照組，常規(guī)培養(yǎng)48h。3.蛋白收集和濃度測定
在細胞狀態(tài)良好時收集細胞，刮取貼壁細胞并計數(shù)，細胞濃度約為107/mL，用PBS (pH=7. 4)洗滌細胞3 次。加入細胞裂解液(8mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris-HCI,pH=7.4)，振蕩30 min，充分混勻樣品后，將細胞裂解液高速離心(16 OOOg離心20 min)，取上清液，采用Bradford法測定蛋白濃度后置于_70°C冰箱保存。實施例2、差異蛋白的篩選
I.第一向等電聚焦電泳與平衡
將樣品與水化液(7mol/L 尿素，2mol/L 硫脲，4 % CHAPS, 65mmol/L DTT，0. 2 %IPGBuffer,痕量溴酚藍)混合，總體積為500 u L，總蛋白量為200 u g，加入聚焦盤中，并將IPG干膠條膠面向下置于聚焦盤中，然后在ProteanIEF Cell等電聚焦儀中進行等電聚焦。參數(shù)設置如下17°C被動水化16 h，100 V聚焦5 h，250 V聚焦3 h，500 V聚焦2 h，I 000V聚焦2 h，10 000 V聚焦5 h，總電壓時間積為60 000 Vh 后終止聚焦。電泳結(jié)束后取出膠條沖洗井先后于DTT和碘こ酰胺中各平衡I次，毎次均為15 min。2.第二向 SDS-PAGE 電泳
將平衡后的膠條置于10%的均勻SDS-PAGE分離膠上端，用0. 5%的瓊脂糖封膠。電泳參數(shù)設置第一步為恒定電流5 mA/gel,50 min ;第二步為25mA/gel，待溴酚藍遷移至凝膠下緣時停止電泳。3.凝膠染色
采用和質(zhì)譜相容的銀染方法顯示2-DE圖譜，其步驟分為固定、漂洗、水洗、銀染、水洗、顯色、終止、水洗及保存。4.凝膠掃描與圖像分析
每組細胞重復上樣5次，得到5張不同的凝膠。用雙向電泳凝膠專用圖像掃描儀GS-710對所有凝膠進行透射掃描。利用ImageMaster 2D軟件對凝膠進行分析。整個分析過程包括通過自動檢測和手工標記進行蛋白質(zhì)點檢測，利用背景扣除消減部分背景和垂直條紋并進行蛋白質(zhì)點的匹配和匹配蛋白質(zhì)點的表達量差異分析。圖譜顯示，除已用于AD篩查的標志物外，表達差異的蛋白質(zhì)點共7個。5.質(zhì)譜分析
將雙向電泳分析發(fā)現(xiàn)的表達有明顯差異的蛋白質(zhì)點，從凝膠上切下，進行水洗、脫色、酶解、萃取和冷凍干燥后，在MALDI-T0FMS質(zhì)譜儀上進行分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)和相應數(shù)據(jù)。6.數(shù)據(jù)庫查詢
將MALDI-T0F-MS肽指紋圖譜所得到的質(zhì)荷比在Mascot數(shù)據(jù)庫中進行比對，再通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索匹配蛋白。查詢參數(shù)物種分類選擇為人類；酶選擇為Trypsin ;允許的未酶切位點選擇為I ;固定修飾為carbamidomethyl (C),變量修飾為oxidation(M),量誤差為0. 5Da ;肽片段容差選擇為IOOppm ;離子選擇為MH+和monoiso-tope ;選擇直接輸入MascotSearch即可進行數(shù)據(jù)庫檢索。其中以匹配分值(mowse score)為基礎的概率(P)評價數(shù)據(jù)庫搜尋結(jié)果的質(zhì)量，匹配分值的大小表示鑒定蛋白屬于隨機匹配的可能性，當匹配分值達到或超過66分時，待測蛋白的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中某已知蛋白的氨基酸序列覆蓋率較高，認為匹配的可能性很大，統(tǒng)計學上有意義(P < 0. 05)。本發(fā)明的Prohibitin蛋白得分100遠高于66分,且在綠色域值以外說明結(jié)果可信。在7個顯著差異蛋白質(zhì)點中選擇差異倍數(shù)最大的I個異常蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析。結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)多個蛋白之匹配并可能性具有統(tǒng)計學意義(即匹配的程度)，搜索鑒定該差異蛋白質(zhì)為Prohibitin蛋白。實施例3、Prohibitin蛋白蛋白差異表達的免疫印跡驗證
為了確認Prohibitin蛋白的差異表達，取已被確診為AD的患者血清標本3例，并取經(jīng)證實為患AD的正常血清標本I例作為對照，血液室溫凝集后高速離心(12000rpm/min，15min),經(jīng)常規(guī)樣品處理后,進行Western blot檢測。實驗步驟大體如下以40 mg蛋白上樣電泳(SDS-PAGE凝膠),電壓I5OV轉(zhuǎn)印至Immobilon-P膜(Millipore公司)。5%脫脂奶粉室溫封閉I. 5 h,加入ー抗。ー抗分別是抗P-Actin抗體和抗Prohibitin抗體(I 1000 ；Abcam公司)，次日加入ニ抗辣根過氧化物酶抗體，并進行ECL化學發(fā)光法染色(ECL試劑盒，Amersham公司)。免疫印跡驗證結(jié)論表明，和正常人體血清中相比，Prohibitin蛋白在AD患者血清中顯著高表達,與質(zhì)譜結(jié)果吻合，進ー步驗證了質(zhì)譜鑒定結(jié) 果的準確性。實施例4、Prohibitin蛋白抗體在制備用于AD檢測的試劑盒中的用途
由于Prohibitin蛋白在AD中存在差異表達，顯然與AD的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關性，因此以Prohibitin蛋白作為ー個蛋白質(zhì)分子標記，對其表達量進行檢測可以用于檢測AD。相應的,特異性抗Prohibitin蛋白的抗體,包括各種抗Prohibitin蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其能夠用于檢測Prohibitin蛋白的表達量。因而可以用于檢測AD，或者用于制備檢測AD的制劑或試劑盒等。檢測方法可以包括，但不限于，免疫印跡、蛋白質(zhì)芯片、免疫熒光、酶聯(lián)免疫檢測、免疫層析檢測等方法，試劑盒中的其他試劑及其組合方法均為本領域的常規(guī)之選，抗體可進行必要的修飾，例如偶聯(lián)標記物，所述標記物可以是熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素等。本領域的技術(shù)人員可利用Prohibitin蛋白在AD中存在差異表達這ー重要信息，對上述內(nèi)容進行適當修改，以實現(xiàn)相應的執(zhí)行情況。但是，所有基于本發(fā)明的修改或改造新方法，屬于保留的權(quán)利。
權(quán)利要求
1.一種檢測老年性癡呆的試劑盒，其特征在于，包括Prohibitin蛋白抗體，用于測量來自受測對象生物樣本中的Prohibitin蛋白表達量。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中，所述Prohibitin蛋白抗體為單克隆或多克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒,其中，所述Prohibitin蛋白抗體偶聯(lián)有標記物。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述所述標記物選自由熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素組成的組。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的試劑盒，其中，所述生物樣本為血清。
6.Prohibitin蛋白抗體在制備診斷老年性癡呆的試劑盒中的應用，其特征在于,所述試劑盒包括Prohibitin蛋白抗體,用于測量來自受測對象生物樣本中的Prohibitin蛋白表達量，通過與正常個體生物樣本中的Prohibitin蛋白表達量進行比較，以確定所述受測對象是否患有老年性癡呆。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒,其中，所述Prohibitin蛋白抗體為單克隆或多克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒,其中，所述Prohibitin蛋白抗體偶聯(lián)有標記物。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述所述標記物選自由熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素組成的組。
10.如權(quán)利要求6-9中任一項所述的試劑盒，其中，所述生物樣本為血清。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗乳腺癌活性的寡肽，其序列為His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。所述寡肽在較低濃度下能選擇性抑制體外乳腺癌細胞的生長，而對正常乳腺細胞的生長無影響。體內(nèi)試驗也表明，該寡肽對癌細胞的生長和增殖有很強的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑效關系。因其安全、高效、理想的抗癌效果，該寡肽可用于制備抗癌藥物，并具有良好的應用前景。
文檔編號G01N33/53GK102707065SQ20121007959
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者吳健 申請人:常熟市虞山綠茶有限公司