專利名稱：一種基于gpv p32蛋白的間接elisa試劑盒及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于GPV P32蛋白的間接ELISA試劑盒及制備方法。
背景技術：
山羊痘是由山羊痘病毒/7θ^α>Μ，GPV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)羊業(yè)的急性、烈性傳染病，國際獸醫(yī)衛(wèi)生組織將其列為A類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為 I類傳染病，因此我國獸醫(yī)衛(wèi)生系統(tǒng)對該病的預防也提出了較高的要求。山羊痘是可以通過疫苗免疫得到良好控制的一種疾病，但由于某些不可預知的原因，導致免疫失敗現(xiàn)象時有發(fā)生。血清學檢測是制定和實施山羊痘防制措施的一個關鍵環(huán)節(jié)，目前常用的血清學檢測方法有病毒中和試驗(VNT)、瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，其中，ELISA方法因其具有方便、快捷等優(yōu)點有潛在開發(fā)前景。P32蛋白是GPV囊膜蛋白，在病毒感染早期即可誘導體液免疫和細胞免疫，可用于 GP早期診斷，此外，P32蛋白作為羊痘病毒種屬特異性蛋白，能區(qū)分GPV和其它痘病毒屬成員，可用于鑒別診斷，因此建立基于P32蛋白的ELISA檢測試劑盒具有可行性。目前，對山羊痘的控制主要通過疫苗接種來完成，但隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，牲畜交易的廣泛性，跨省市交易時有發(fā)生，而不同地區(qū)羊群免疫的不確定性導致了本病的不時暴發(fā)。目前，我國尚未建立商品化的山羊痘血清抗體檢測試劑盒，使該病的臨床控制缺乏了一種關鍵實時監(jiān)測手段，因此，建立一種快捷可行的山羊痘血清抗體檢測方法是十分必要和迫切。本發(fā)明通過畢赤酵母菌表達系統(tǒng)獲得P32蛋白，建立了基于該蛋白的山羊痘血清抗體快速檢測間接ELISA試劑盒，將為我國養(yǎng)羊業(yè)山羊痘的綜合防控提供重要監(jiān)測手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題在于，選取核苷酸同源性較高的GPV-LD株，通過P32基因真核表達載體的構建與表達，建立基于表達產(chǎn)物GPV P32蛋白的間接ELISA方法，并進行條件優(yōu)化，制備成商品化間接ELISA試劑盒。該間接ELISA試劑盒的發(fā)明，將為山羊痘疫苗免疫效果的評價，提供一種有效的手段，減少了生產(chǎn)中山羊痘疫苗免疫的盲目性，為山羊痘疫病的免疫防控提供技術支撐。本發(fā)明的間接ELISA試劑盒的組成包括5(Γ200 μ L重組蛋白包被、50 200 μ L陽性對照、50 200 μ L陰性對照、50 200 μ L封閉液、50 200 μ L酶標二抗、50 200 μ L顯色液及5(Γ200 μ L終止液和25mL-100 mL洗滌液。所述重組蛋白為GPV P32基因通過畢赤酵母菌表達系統(tǒng)獲得P32蛋白，并通過用 His ‘ Bind Purification Kit進行重組蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白， 使用包被緩沖液稀釋為0. 833 μ g/100 μ L 3 μ g/100 μ L。所述包被緩沖液為=Na2CO3 1. 59g、NaHCO3 2. 93g溶于去離子水中，定容至 IOOOmL,調(diào)至 pH 9. 5 9. 8。
所述陽性對照為通過山羊痘分離毒臨床感染山羊獲得的高免血清，使用時用血清稀釋液按1:10 1:800倍稀釋；陰性對照為未感染且未免山羊痘疫苗的山羊血清，稀釋度為 1:10 1:800。所述血清稀釋液為BSA，其濃度為0. 3g/100mL lg/100mL。所述封閉液為脫脂乳，濃度為3g/100mL飛g/100mL的溶液；酶標二抗為兔抗羊 IgG-HRP，使用濃度為 1:2000 1:5000。所述顯色液為鄰苯二胺(OPD)底物液，具體配方為在0. lmol/L枸櫞酸鹽緩沖液 (ρΗ5· 0)中含 20 mmol/L OPD 和 12 mmol/L H2O2，或 10 mmol/L OPD 和 5. 5mmol/L H2O2 ；檢測波長為492nm。所述枸櫞酸鹽緩沖液(pH5. 0)一水檸檬酸5. llg，無水磷酸氫二鈉7. 3g，加水定容至 1000mL。所述終止液為1. 2 mol/L 2mol/L硫酸；洗滌液為PBST緩沖液NaCl 8. 0g、KCl 0. 2g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、Tween-20 0. 5mL 溶于 800mL 蒸餾水，調(diào)整 pH 為 7. 4，定容至 IOOOmL0所述的基于GPV P32蛋白的間接ELISA試劑盒，制備方法步驟包括 第一，純化重組GPV P32蛋白的獲得；
第二，重組GPV P32蛋白及血清的最佳工作濃度測定結(jié)果
采用矩陣法設計不同稀釋度P32蛋白與不同稀釋度陽性、陰性血清反應，測定其OD值， 并計算其P/N值。綜合陰性血清OD值高低以及P/N值大小這兩個因素，確定重組GPV P32 蛋白及血清的最佳工作濃度；
第三，最適封閉液及封閉時間的確定
采用不同封閉液和不同封閉時間后，測定各孔的OD值，并計算P/N值，確定最佳封閉液及封閉時間；
第四，基于重組GPV P32蛋白間接ELISA判定標準的確定
通過已建最佳間接ELISA條件測定20份已知陰性血清的OD值并計算其P/N值；通過計算樣品P/N的平均值、標準差和臨界值，為了降低假陽性及假陰性結(jié)果設一個可疑區(qū)，即被檢血清P/N值大于等于臨界值+標準差為陽性，P/N值小于等于臨界值_標準差為陰性。本發(fā)明有益效果本發(fā)明將改變山羊痘血清抗體無ELSIA檢測試劑盒使用的局面；本發(fā)明所建立試劑盒適用于檢測山羊痘免疫血清抗體和山羊痘病毒感染抗體，能夠體現(xiàn)免疫羊群機體疫苗免疫效果和非免疫羊群山羊痘病毒隱性感染情況，對養(yǎng)羊場山羊痘疫苗免疫提供一種有效評價手段，減少生產(chǎn)中疫苗免疫的盲目性，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下的技術優(yōu)勢和積極效果
(1)敏感性高本發(fā)明基于ELISA技術，比傳統(tǒng)病毒中和試驗(VNT)、瓊脂免疫擴散試驗 (AGID)檢測敏感性高100倍-200倍；
(2)特異性好本發(fā)明使用畢赤酵母菌表達重組GPVP32蛋白作為抗原，與使用全病毒相比，能更好的反映機體山羊痘血清抗體水平，減少了與其他疾病血清抗體交叉影響；
(3)高通量本發(fā)明基于ELISA技術，可應用于大批量樣本的檢測，方便、快捷，操作簡單，成本低。


圖1為本發(fā)明的GPV P32蛋白的iELISA試劑盒制備生產(chǎn)流程圖。
具體實施例方式
具體實施例方式
基于GPV P32蛋白的iELISA試劑盒原料及配方為
山羊痘標準陽性血清和標準陰性血清，1:50倍稀釋待用；包被緩沖液=Na2CO3 1. 59g、 NaHCO3 2. 93g溶于去離子水中，定容至IOOOmL,調(diào)至ρ H 9. 6 ；酶標二抗兔抗羊IgG-HRP， 按 1:2000倍稀釋待用；IXPBST緩沖液NaCl 8. 0g,KCl 0. 2g,KH2PO4 0. 2g,Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、Tween-20 0. 5mL溶于800mL蒸餾水，調(diào)整pH為7. 4，定容至IOOOmL ；封閉緩沖液脫脂乳5%;磷酸-檸檬酸緩沖液一水檸檬酸5. llg、無水Na2HPO4 7.3 g、無離子水定容至1 000 mL ；顯色液40 mg OPD溶于100 mL磷酸-檸檬酸緩沖液和12 mmol/L H2O2 ；終止液 1. 25 mol/L H2SO4 溶液。所述的基于GPV P32蛋白的iELISA試劑盒制備步驟包括 第一，純化重組GPV P32蛋白的獲得
通過畢赤酵母菌表達系統(tǒng)獲得含有重組GPV P32蛋白的粗蛋白，通過His · Bind Purification Kit (按照N0VEGEN公司試劑盒說明書操作)進行重組蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE 分析后得到純化目的蛋白；
第二，重組GPV P32蛋白及血清的最佳工作濃度測定結(jié)果
采用矩陣法設計不同稀釋度(0. 1 μ g/100 μ L,0. 5 μ g/100 μ LU μ g/100 μ L, 1· 5 μ g/100 μ L、2. 0 μ g/100 μ L、2. 5 μ g/100 μ L、3. 0 μ g/100 μ L、3. 5 μ g/100 μ L)P32 蛋白與不同稀釋度(1 IOU 50,1 IOOU 200,1 300和1 500)陽性、陰性血清反
應，測定其OD值，并計算其P/N值。綜合陰性血清OD值高低以及P/N值大小這兩個因素， 確定重組GPV P32蛋白包被量為1.5yg/100yL，血清稀釋度為1 50時，陰性對照背景值較低，且P/N值為最大，達到最佳反應條件； 第三，最適封閉液及封閉時間的確定
采用不同封閉液(不封閉、1%明膠、0. 1%BSA、1%BSA、5%脫脂乳)和不同封閉時間(0. 5h、 1.0h、1.5h、2. Oh)后，測定各孔的OD值，并計算P/N值，結(jié)果顯示，最適封閉液為5%脫脂乳， 1. Oh封閉，P/N值最高，達到最佳反應條件；
第四，基于重組GPV P32蛋白間接ELISA判定標準的確定
通過已建最佳間接ELISA條件測定20份已知陰性血清的OD值并計算其P/N值(即陽性血清OD值/陰性血清OD值)。通過計算樣品P/N值的平均為1.453，標準差為0.234，故 X+3SD=2. 155為間接ELISA的臨界值，為了降低假陽性及假陰性結(jié)果設一個可疑區(qū)，即被檢血清P/N值大于等于2. 389 (臨界值+標準差)為陽性，P/N值小于等于1.921 (臨界值-標準差)為陰性，2. 389 1. 921之間判定為可疑；
第五，基于重組GPV P32蛋白間接ELISA試劑盒的最佳使用步驟與方法確定 (1)以1.5 μ g/100 μ L重組GPV Ρ32蛋白包被ELISA反應板，4°C作用16h后，應用PBS 洗滌ELISA反應板5次；(2)以5g/100mL的脫脂乳溶液封閉ELISA反應板，37°C，封閉lh_3h 后，應用PBS洗滌ELISA反應板5次；(3)將待檢血清用PBS做1 50倍稀釋，按100 μ L加
5入ELISA反應板，37°C作用Ih后，應用PBS洗滌ELISA反應板5次；(4)將兔抗羊IgG-HRP 用PBS做1 2000倍稀釋，按100 μ L加入ELISA反應板，37°C作用Ih后，應用PBS洗滌ELISA 反應板5次；(5)將50 OPD底物液加入ELISA反應板，避光室溫顯色15min，加入50 μ L終止液，立即在酶標儀492nm波長下讀取OD值。(6)試驗結(jié)果判定標準為S/N值(即待檢樣本OD值/陰性對照OD值)彡2. 389為陽性，S/N值彡1. 921為陰性； 第六，該ELISA試劑盒敏感性檢測
將陽性血清從50倍起連續(xù)二倍稀釋，進行ELISA檢測，結(jié)果顯示，陽性血清稀釋800倍時P/N值為2. 732，仍為陽性結(jié)果，而陰性血清OD492值始終低于1. 5，說明此ELISA方法具有較高的敏感性；
第七，該ELISA試劑盒特異性試驗結(jié)果
應用本試驗建立的ELISA方法分別檢測山羊痘陽性血清、綿羊痘陽性血清、口蹄疫陽性血清、山羊傳染性膿皰皮炎陽性血清，結(jié)果顯示，本研究所建立的ELISA方法與山羊口蹄疫陽性血清、傳染性膿皰皮炎陽性血清無交叉反應，只與山羊痘陽性血清、綿羊痘陽性血清發(fā)生特異性的反應，實驗結(jié)果說明該方法具有良好的特異性； 第八該ELISA試劑盒重復性檢測 (1)批內(nèi)重復性試驗
取同一批制備的重組GPV P32蛋白包被ELISA反應板，取3份山羊痘陽性血清和1份陰性血清，每份樣本重復8孔，按已建立的ELISA程序測定OD492，對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，分別計算各組的平均數(shù)I、標準差S及變異系數(shù)C · V,結(jié)果見下表 批內(nèi)重復性試驗結(jié)果
權利要求
1.一種基于GPV P32蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于其組成包括5(Γ200μ L 重組蛋白包被、5(Γ200μ L陽性對照、5(Γ200μ L陰性對照、50 200 μ L封閉液、50 200 μ L 酶標二抗、5(Γ200 μ L顯色液及5(Γ200 μ L終止液和25mL_100 mL洗滌液。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于GPVP32蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于 重組蛋白包被為重組蛋白使用包被緩沖液稀釋為0.833 yg/100yL ^3 yg/100yL； 重組蛋白為GPV P32基因通過畢赤酵母菌表達系統(tǒng)獲得P32蛋白，并通過用His · Bind Purification Kit進行重組蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白；包被緩沖液為Na2CO3 1.59g和NaHCO3 2. 93g溶于去離子水中，定容至IOOOmL,調(diào)至pH 9. 5 9. 8。
3.根據(jù)權利要求1所述一種基于GPVP32蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于陽性對照為通過山羊痘分離毒臨床感染山羊獲得的高免血清，使用時用血清稀釋液按1:10 1:800倍稀釋；陰性對照為未感染且未免山羊痘疫苗的山羊血清，稀釋度為1:10 1:800 ； 血清稀釋液為BSA，其濃度為0. 3g/100mL lg/100mL。
4.根據(jù)權利要求1所述一種基于GPVP32蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于封閉液為脫脂乳，濃度為3g/100mL飛g/100mL的溶液；酶標二抗為兔抗羊IgG-HRP，使用濃度為 1:2000 1:5000。
5.根據(jù)權利要求1所述一種基于GPVP32蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于顯色液為OPD底物液，具體配方為在0. lmol/L枸櫞酸鹽緩沖液pH 5. 0中含20 mmol/L OPD 和 12 mmol/L H2O2，或 10 mmol/L OPD 和 5. 5mmol/L H2O2 ；枸櫞酸鹽緩沖液PH 5.0為一水檸檬酸5. Ilg和無水磷酸氫二鈉7. 3g，加水定容至 1000mL。
6.根據(jù)權利要求1所述一種基于GPVP32蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于終止液為 1. 2 mol/L 2mol/L 硫酸；洗滌液為 PBST 緩沖液NaCl 8. 0g、KCl 0. 2g、KH2P04 0. 2g、 Na2HPO4 ·12Η20 2. 9g 和 Tween_20 0. 5mL 溶于 800mL 蒸餾水，調(diào)整 pH 為 7. 4，定容至 1000mL。
7.—種如權利要求1-6任一項所述基于GPV P32蛋白的間接ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于它包括以下步驟第一，純化重組GPV P32蛋白的獲得；第二，重組GPV P32蛋白及血清的最佳工作濃度測定結(jié)果采用矩陣法設計不同稀釋度P32蛋白與不同稀釋度陽性、陰性血清反應，測定其OD值， 并計算其P/N值；綜合陰性血清OD值高低以及P/N值大小這兩個因素，確定重組GPV P32蛋白及血清的最佳工作濃度；第三，最適封閉液及封閉時間的確定采用不同封閉液和不同封閉時間后，測定各孔的OD值，并計算P/N值，確定最佳封閉液及封閉時間；第四，基于重組GPV P32蛋白間接ELISA判定標準的確定通過已建最佳間接ELISA條件測定20份已知陰性血清的OD值并計算其P/N值；通過計算樣品P/N的平均值、標準差和臨界值，為了降低假陽性及假陰性結(jié)果設一個可疑區(qū)，即被檢血清P/N值大于等于臨界值+標準差為陽性，P/N值小于等于臨界值-標準差為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于GPVP32蛋白的iELISA試劑盒及制備方法，其組成包括50~200μL重組蛋白包被、50~200μL陽性對照、50~200μL陰性對照、50~200μL封閉液、50~200μL酶標二抗、50~200μL底物液、50~200μL終止液和25mL-100mL洗滌液。本發(fā)明對養(yǎng)羊場山羊痘疫苗免疫提供一種有效評價手段，減少生產(chǎn)中疫苗免疫的盲目性，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號G01N33/68GK102353792SQ20111018893
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權日2011年7月7日
發(fā)明者周碧君, 岳筠, 文明, 王開功, 程振濤 申請人:貴州大學