專利名稱：山羊痘反向間接血凝診斷試劑及其制備方法和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反向血凝診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑及其制備方法和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
山羊痘是由山羊痘病毒屬山羊痘病毒(goat poxvirus，GTPV)引起的一種呈地方流行的高度接觸性傳染病，一年四季均可發(fā)生，春秋常見，不分性別、年齡、品種。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將山羊痘列為A類重大傳染病，1999年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第96號(hào)公告將山羊痘列為國(guó)家一類動(dòng)物疫病。近年來，我國(guó)二十多個(gè)省市相繼報(bào)導(dǎo)山羊痘發(fā)生流行，給我國(guó)蓬勃興起的山羊養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，帶來了嚴(yán)峻威脅。傳統(tǒng)的檢測(cè)山羊痘的方法可采用瓊脂擴(kuò)散法，但該方法的靈敏度不高、檢測(cè)速度較慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有檢測(cè)山羊痘疾病的方法的靈敏度不高、檢測(cè)速度較慢的缺陷，提供一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑及其制備方法，該試劑可敏感、 快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)山羊痘病毒抗原。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案
本發(fā)明山羊痘反向間接血凝診斷試劑中山羊痘IgG致致敏紅細(xì)胞的含量為0.8 1% (體積)，純化山羊痘IgG含量為1. 549mg/ml。上述山羊痘反向間接血凝診斷試劑中的致敏紅細(xì)胞是用純化山羊痘IgG致敏的醛化綿羊紅細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種制備前述山羊痘反向間接血凝診斷試劑的方法采集健康綿羊靜脈血，制備成紅細(xì)胞懸液，用戊二醛和鞣酸進(jìn)行醛化，在醋酸鹽緩沖液中用純化山羊痘 IgG致敏，離心分離，取沉淀紅細(xì)胞配制成紅細(xì)胞懸液，經(jīng)血凝檢測(cè)合格后即得。進(jìn)一步的，上述方法為采集健康綿羊靜脈血，用PBS離心分離提取紅細(xì)胞，再用磷酸緩沖液制備成紅細(xì)胞懸液，用戊二醛醛化后重新用磷酸緩沖液配制成紅細(xì)胞懸液，然后再用鞣酸醛化，離心分離得醛化紅細(xì)胞，將醛化紅細(xì)胞在醋酸鹽緩沖液中用純化山羊痘 IgG致敏，離心分離，取沉淀紅細(xì)胞用含Na隊(duì)和新生小牛血清的磷酸緩沖液洗滌，再用此緩沖液配制成紅細(xì)胞懸液，經(jīng)血凝檢測(cè)合格后即得。最佳的，前述制備方法為采集健康綿羊靜脈血，用PBS離心分離提取紅細(xì)胞，再用0. 1M、pH7. 4的磷酸緩沖液制備成體積百分比為2. 5%的紅細(xì)胞懸液，用戊二醛醛化后重新用0. 1M、pH7. 4的磷酸緩沖液配制成體積百分比為2. 5%的紅細(xì)胞懸液，然后再用新鮮鞣酸在37°C的水浴鍋中醛化1小時(shí)，用0. 1Μ、ρΗ7. 4的磷酸緩沖液的洗滌，離心分離得醛化紅細(xì)胞，將醛化紅細(xì)胞加入10體積倍量的0.1M、pH 3 4的醋酸鹽緩沖液中，再與等體積量純化山羊痘IgG稀釋液混合，置于37°C感作池致敏，離心分離，取沉淀紅細(xì)胞用含0. 1%(重量)NaN3和1% (體積)新生小牛血清的0. 1M、pH7. 4磷酸緩沖液洗滌，再用此緩沖液配制成紅細(xì)胞懸液，經(jīng)血凝檢測(cè)合格后即得。采用前述診斷試劑檢測(cè)山羊痘的方法檢測(cè)時(shí)，pH值控制在7. 4 7. 8，反應(yīng)溫度 20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。與現(xiàn)有常用的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)相比，本發(fā)明以純化山羊痘IgG致敏醛化綿羊紅細(xì)胞制備了山羊痘反向間接血凝診斷試劑，可快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)山羊痘病毒抗原，具有較好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床上山羊痘病毒抗原的快速檢測(cè)，為疾病預(yù)防、診斷和防控提供依據(jù)。
具體實(shí)施例方式山羊痘反向間接血凝診斷試劑按如下配比和方法制備 1、制備醛化紅細(xì)胞
無菌采集健康綿羊靜脈血，加10體積倍PBS，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用PBS洗5遍， 以磷酸緩沖液(0. 1M，pH 7. 4)配成2. 5% (體積百分比)的紅細(xì)胞懸液，然后將此紅細(xì)胞懸液與1% (體積百分比)戊二醛水溶液以9 1的體積比混合，于室溫下緩慢攪拌lh，2000轉(zhuǎn) /分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，重新制成2. 5%的懸浮液，然后將該懸浮液與等體積量1/200000 (體積比)新鮮鞣酸溶液混合，置37°C的水浴鍋中1小時(shí)后取出，用磷酸緩沖液洗滌3次，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘得醛化沉淀紅細(xì)胞。2、致敏將醛化沉淀紅細(xì)胞加入10體積倍量醋酸鹽緩沖液(0. 1M, pH 3 4)中， 再與等體積量純化山羊痘IgG稀釋液(1.549mg / ml)混合，置于37°C感作池，其間每隔 15min吹吸混勻1次，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，得沉淀致敏紅細(xì)胞。3、取沉淀致敏紅細(xì)胞用含0. (重量)NaN3U % (體積)新生小牛血清的磷酸緩沖液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 4)洗滌5次，然后配成致敏紅細(xì)胞濃度1% (體積)、IgG含量1. 549mg/ml 的紅細(xì)胞懸液。4、按常規(guī)反向間接血凝試驗(yàn)方法分析檢測(cè)合格后即制得反向間接血凝診斷試劑。檢測(cè)時(shí)，pH值控制在7. 4 7. 8，反應(yīng)溫度20 25 °C，反應(yīng)時(shí)間50min為最佳反應(yīng)條件。
權(quán)利要求
1.一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑，其特征在于血凝診斷試劑中山羊痘IgG致敏紅細(xì)胞的含量為0. 8 1%，純化山羊痘IgG含量為1. 549mg/mL·
2.按照權(quán)利要求1所述山羊痘反向間接血凝診斷試劑，其特征在于所述致敏紅細(xì)胞是用純化山羊痘IgG致敏的醛化綿羊紅細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1或2所述山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法，其特征在于 采集健康綿羊靜脈血，制備成紅細(xì)胞懸液，用戊二醛和鞣酸進(jìn)行醛化，在醋酸鹽緩沖液中用純化山羊痘IgG致敏，離心分離，取沉淀紅細(xì)胞配制成紅細(xì)胞懸液，經(jīng)血凝檢測(cè)合格后即得。
4.按照權(quán)利要求3所述山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法，其特征在于采集健康綿羊靜脈血，用PBS離心分離提取紅細(xì)胞，再用磷酸緩沖液制備成紅細(xì)胞懸液，用戊二醛醛化后重新用磷酸緩沖液配制成紅細(xì)胞懸液，然后再用鞣酸醛化，離心分離得醛化紅細(xì)胞，將醛化紅細(xì)胞在醋酸鹽緩沖液中用純化山羊痘IgG致敏，離心分離，取沉淀紅細(xì)胞用含 NaN3和新生小牛血清的磷酸緩沖液洗滌，再用此緩沖液配制成紅細(xì)胞懸液，經(jīng)血凝檢測(cè)合格后即得。
5.按照權(quán)利要求4所述山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法，其特征在于采集健康綿羊靜脈血，用PBS離心分離提取紅細(xì)胞，再用0. 1M、pH7. 4的磷酸緩沖液制備成體積百分比為2. 5%的紅細(xì)胞懸液，用戊二醛醛化后重新用0. 1M、pH7. 4的磷酸緩沖液配制成體積百分比為2. 5%的紅細(xì)胞懸液，然后再用新鮮鞣酸在37°C的水浴鍋中醛化1小時(shí)，用 0. 1M、pH7. 4的磷酸緩沖液的洗滌，離心分離得醛化紅細(xì)胞，將醛化紅細(xì)胞加入10體積倍量的0. 1M、pH 3 4的醋酸鹽緩沖液中，再與等體積量純化山羊痘IgG稀釋液混合，置于 37°C感作池致敏，離心分離，取沉淀紅細(xì)胞用含0. 1% (重量州3隊(duì)和1% (體積)新生小牛血清的0. 1M、pH7. 4磷酸緩沖液洗滌，再用此緩沖液配制成紅細(xì)胞懸液，經(jīng)血凝檢測(cè)合格后即得。
6.權(quán)利要求1至5任一所述診斷試劑檢測(cè)山羊痘的方法，其特征在于檢測(cè)時(shí)，pH值控制在7. 4 7. 8，反應(yīng)溫度20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑及其制備方法，該血凝試劑中致敏紅細(xì)胞的含量為0.8～1.0%，純化山羊痘IgG含量為1.549mg/ml，與現(xiàn)有常用的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)相比，本發(fā)明以純化山羊痘IgG致敏醛化綿羊紅細(xì)胞制備了山羊痘反向間接血凝診斷試劑，可快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)山羊痘病毒抗原，具有較好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床上山羊痘病毒抗原的快速檢測(cè)，為疾病預(yù)防、診斷和防控提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102253197SQ20111016698
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者劉忠偉, 周碧君, 岳筠, 嵇辛勤, 文明, 汪德生, 王開功, 程振濤 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)