專利名稱：鑒別檢測綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，確切講是一種用于檢測綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
羊痘(Capripox，CP)包括綿羊痘、山羊痘和牛的皮膚疙瘩病，其中前兩者是由綿羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分別引起綿羊和山羊發(fā)生的接觸性傳染病。病畜體溫升高，全身出現(xiàn)丘疹或結(jié)節(jié)、水皰、內(nèi)臟病變甚至死亡，給世界養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其規(guī)定為法定必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點。研究表明，SPPV和GTPV基因序列同源性達到96%_97%，僅在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異，見:Tulman，E.R.，Afonso,C.L，Lu, Z.，Zsakj L，Surj J.H.，Sandybaev, N.T.，Kerembekova, IL Z.，Zaitsev,V.L., Kutish，G.F., Rock, D.L., 2002.The genomes of sheeppox and goatpoxviruses.J Virol.76，6054-6061.。一般來說，SPPV、GTPV 具有較嚴格的宿主嗜性，但有一些研究表明試這兩種病毒也可發(fā)生宿主嗜性改變，引起交叉感染見:M.G.Garner,S.D.Sawarkar, E.K.Brett, J.R.Edwards, V.B.Kulkarni，D.B.Boyle; S.N.theExtent and Impact of Sheep Pox and Goat Pox in the State of Maharashtra, India，Tropical Animal Health and Production.2000，32 (4): 205-223.，繼而可能導(dǎo)致錯誤的臨床診斷和獲得不準確的流行病學(xué)信息，不利于對該病的有效防控。對羊痘病毒分離株進行準確的種屬鑒別有助于解決生產(chǎn)中遇到的這個問題，但SPPV和GTPV之間抗原性具有明顯交叉，用血清學(xué)方法很 難區(qū)別開來，需通過分子生物學(xué)方法進行鑒別，Sheeppoxand goatpox virus.World Organisation for Animal Health (2009).- TerrestrialAnimal Health Code.0IE，Paris.。準確鑒定分離株種屬和弄清其來源將有助于羊痘的流行病學(xué)分析，具有重要意義。目前為止，基于基因序列分析的分子生物學(xué)鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期本實驗室通過克隆結(jié)合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了 PCR-RFLP 方法，而印度的 Gnanavel Venkatesanl 和 Madhusudan Hosamani等也分別建立了分析P32基因的PCR-RFLP，但是該方法需要專用的PCR儀器和酶切操作，相對來說比較繁瑣且費用較多，不利于生產(chǎn)實踐中的實際應(yīng)用，見:顏新敏，吳國華，李健等.山羊痘病毒感染綿羊的診斷及其基因的分子分析.中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41 (01):14.、Gnanavel Venkatesan, Vinayagamurthy Balamurugan, RevaniahYogisharadhya etal.，Differentiation of sheeppox and goatpox viruses bypolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.VIR0L0GICASINICA，2012，27(6):353-359.、Madhusudan Hosamani，Bimalendu Mondal，Prabhakar Aet al..Differentiation of Sheep Pox and Goat Poxviruses by Sequence Analysisand PCR-RFLP of P32 Gene, Virus Genes 29:1，73 - 80, 2004。而國內(nèi)肖雯[6]等建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR方法擴增靈敏度僅為1.725 X IO7 copies/u L的SPPV和1.71X106 copies/u L的GTPV，且同樣需要專門的PCR儀器，因此該方法在生產(chǎn)實踐中也存在這局限性，肖雯，聶福平，王昱等.綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報.2012，7(7):551-554.。環(huán)等溫介導(dǎo)技術(shù)(loopmediated isothermal amplication, LAMP)由于其具有快速、簡便、無需特殊儀器等優(yōu)點，目前已被廣泛應(yīng)用于各種疾病病原的檢測中。目前為止，美國科學(xué)家Amaresh Das等人建立了檢測羊痕病毒屬的Lamp方法,參見:Amaresh Das, Shawn Babiuk, and MichaelT.McIntosh.Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay forRapid Detection of Capripoxviruses.Journal of Clinical Microbiology.2012,1613 - 1620.。該研究靶向SPPV、GTPV和LSDV三種病原共有的保守的VP39基因，因此該方法并不能夠區(qū)分出綿羊痘病毒和山羊痘病毒；而國內(nèi)重慶出入境檢驗檢疫局李應(yīng)國等人也建立了檢測羊痘病毒屬的Lamp診斷試劑盒，參見:羊痘病毒屬病毒等溫擴增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法，專利號:CN102373302A，該方法也是以SPPV、GTPV和LSDV三種病原共有的基因組1119272bp-120322bp保守序列為靶標基因。因此，他們所建立的方法或者試劑盒僅僅能檢測出羊痘病毒屬病毒，而不能夠區(qū)別出同屬不同種的病毒，即不能夠區(qū)分綿羊痘病毒和山羊痘病毒。同時這些方法同樣存在的檢測靈敏度較低的不足，這對病毒檢測是不利的。尋找一種可以鑒別診斷綿羊痘病毒和山羊痘病毒試劑盒和檢測方法，特別是找到一種可以有更高檢測靈敏度的檢測試劑盒和檢測方法，對羊痘病的診斷、治療與預(yù)防有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可以克服現(xiàn)有技術(shù)不足，能聯(lián)合鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒的檢測試劑盒，特別是提供一種可比現(xiàn)有技術(shù)有更高檢測靈敏度或更廉價方便的檢測試劑盒。本發(fā)明的鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒檢測盒內(nèi)包括有三組引物:SEQ ID Ns 1、SEQ ID Na 2、SEQ ID Na 3、SEQ ID Na 4、SEQ ID Na 5、SEQ ID Na 6、SEQ ID Na 7、SEQ IDNa 8、SEQ ID Na 9、SEQ ID Na 10、SEQ ID Ns 11 和 SEQ ID Na 12。本發(fā)明的六對序列分別為:
可特異性擴增山羊痘病毒核酸的引物:SEQ ID Ns 1:ACCAAAACAAATAATCAGAGATG，在本發(fā)明中被命名為GTPV F3 ；SEQ ID Ns 2:CCTAATCCATTTAAGACACTACG，在本發(fā)明中被命名為GTPV B3 ；SEQ ID Ns 3:AAGATGTCTTCCGGTAACTATGTCT-GCGGITGTGATATCGTCA，在本發(fā)明中被命名為 GTPV FIP ；SEQ ID Ns 4:CCGAACTTGTTATTTCTTGTGCTT_CACAATAAGGAACCACCTAGA，在本發(fā)明中被命名為GTPV BIP ；
可特異性擴增綿羊痘病毒核酸的引物:SEQ ID Ns 5:TGAGGCATCCTTTTTGAAAG，在本發(fā)明中被命名為SPPV F3 ；SEQ ID N26:AAGAAATAACAAGTTCGGGTTA，在本發(fā)明中被命名為SPPVB3 ；SEQ ID Na 7:GCCATCTCTGATTAITTGITITGGT-AACACAITTCCAGCAACCT，在本發(fā)明中被命名為 SPPV FIP ；SEQ ID Ns 8:CATCTGAAAAGITGTITCGGTAGAC-AGAGACTITTATCCCGITCA，在本發(fā)明中被命名為SPPV BIP ；
可同時特異性擴增綿羊痘病毒和山羊痘病毒核酸的通用引物:SEQ ID Na 9:AGCTGTTAGATCATTTCCAAAT,在本發(fā)明中被命名為 GSPV F3 ；SEQ ID Na 10:CGITCAITTTACAAGATGTCTTC，在本發(fā)明中被命名為 GSPV B3 ；SEQ ID Na 11:CATCTAGGGAGGTTGCTGGAAAT-GTGAGGCATCCTnTTGAAAG 在本發(fā)明中被命名為 GSPV FIP ；SEQ ID Na 12 =ATCAGAGATGGCTGTTGTGATATC-CAGCAACTATGTCTACCGA 在本發(fā)明中被命名為 GSPV BIP。相關(guān)的實驗表明，本發(fā)明的序列GTPV F3、GTPV B3、GTPV FIP、GTPV BIP可特異性快速擴增山羊痘病毒的核酸，但同等條件下不能擴增綿羊痘病毒的核酸，通過核酸電泳檢測到是否有特異性條帶可確定出被檢樣品是否帶有山羊痘病毒特異性條帶。本發(fā)明的序列SPPV F3、SPPV B3、SPPV FIP、SPPV BIP可特異性快速擴增綿羊痘病毒的核酸，但同等條件下不能擴增綿羊痘病毒的核酸，通過核酸電泳檢測到是否有特異性條帶可確定出被檢樣品是否帶有綿羊痘病毒。本發(fā)明的序列GSPV F3、GSPV B3、GSPV FIP、GSPV BIP可特異性快速擴增綿羊痘病毒和山羊痘病毒的核酸，通過核酸電泳檢測到是否有特異性條帶可確定被檢樣品是否帶有綿羊痘病毒或山羊痘病毒。本發(fā)明設(shè)計思路上比美國科學(xué)家Amaresh Das等人和李應(yīng)國等人的方法設(shè)計更為精細，本發(fā)明中精心選取了羊痘病毒屬 基因組的反向末端重復(fù)序列ITR區(qū)為靶基因，在選取保守的靶基因的基礎(chǔ)上設(shè)計出一組通用引物，又另外專門分別設(shè)計了只能匹配一種病毒而不匹配另外一種病毒的兩組特異性引物，三組引物結(jié)合或分別使用均可鑒別檢測出綿羊痘病毒和山羊痘病毒。而且，本發(fā)明所設(shè)計的綿羊痘病毒lamp引物在62°C下，擴增45min之后最少可檢出1.037 X IO4個拷貝的模板。山羊痘病毒lamp引物在62°C下,擴增60min之后最少可檢出1.045 X IO6個拷貝的模板,通用lamp引物在62°C下,擴增45min之后最少可檢出1.037X 103個拷貝的模板。三組引物配合使用檢測的靈敏度遠高于已有的雙重PCR以及PCR-RFLP方法，且使用更為方便和廉價，三組引物檢測結(jié)果互為驗證，使得結(jié)果更為準確。因此，本發(fā)明的檢測羊痘病毒的試劑盒能夠快捷高效靈敏的區(qū)別檢測出綿羊痘病毒和山羊痘病毒，為羊痘病毒的鑒別診斷提供可靠方法。本發(fā)明是利用環(huán)等溫介導(dǎo)技術(shù)進行檢測。環(huán)等溫介導(dǎo)技術(shù)進行檢測(loopmediated isothermal amplication, LAMP)由于其具有快速、簡便、無需特殊儀器等優(yōu)點，目前已被廣泛應(yīng)用于各種疾病病原的檢測中。但是目前國內(nèi)外尚無基于LAMP鑒別診斷綿羊痘病毒和山羊痘病毒試劑盒和檢測方法的報道。相關(guān)的實驗提示本發(fā)明的序列可用于制備快速鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒LAMP診斷試劑盒，并在羊痘病毒流行病學(xué)研究中應(yīng)用。


圖1(A)為綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物擴增溫度梯度優(yōu)化，擴增60min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中60°C、62°C和64°C均有擴增條帶產(chǎn)生，66°C和對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C和64V中任意一個溫度。圖1 (B)為山羊痘病毒lamp引物擴增溫度梯度優(yōu)化，擴增60min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中60°C、62°C和64°C均有擴增條帶產(chǎn)生，66°C和對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的山羊痘病毒lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C和64°C中任意一個溫度。
圖1 (C)為綿羊痘病毒lamp引物擴增溫度梯度優(yōu)化，擴增60min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中60°C、62、64°C和66°C均有擴增條帶產(chǎn)生，對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的綿羊痘病毒lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C、64°C和66°C中任意一個溫度。圖2(A)為綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結(jié)果。其中擴增45min、60min后均有擴增條帶產(chǎn)生，擴增30min和對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用lamp引物在62°C下擴增時間可在45min之后擴增出特異性條帶。圖2 (B)為山羊痘病毒lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結(jié)果。其中擴增60min后均有擴增條帶產(chǎn)生，擴增30min、45min、和對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增時間可在60min之后擴增出特異性條帶。圖2 (C)為綿羊痘病毒lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結(jié)果。其中擴增30min、45min和60min后均有擴增條帶產(chǎn)生，擴增對照組無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的綿羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增時間可在30min之后擴增出特異性條帶。圖3(A)為以羊的不同病原體基因組為模板，以綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物在62°C下擴增45min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中M表示IOObp DNA Laddermarker ；1為山羊痘病毒擴增產(chǎn)物；2為綿羊痘病毒擴增產(chǎn)物；3為羊口瘡病毒擴增產(chǎn)物；4為支原體擴增產(chǎn)物；5為衣原體擴增產(chǎn)物；6為螺旋體擴增產(chǎn)物；7為弓形蟲擴增產(chǎn)物；8為羊泰勒蟲擴增產(chǎn)物；9為羊巴貝斯蟲擴增產(chǎn)物；10為無形體擴增產(chǎn)物；11為陰性對照。由圖可見，通用lamp引物特異性擴增出了綿羊痘病毒和山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對照組無條帶產(chǎn)生，說明通用lamp引物特異性很高。圖3(B)為以羊的不同病原體基因組為模板，以山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增60 min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中M表不IOObp DNA Ladder marker ；1為山羊痘病毒擴增產(chǎn)物；2為綿羊痘病毒擴增產(chǎn)物；3為羊口瘡病毒擴增產(chǎn)物；4為支原體擴增產(chǎn)物；5為衣原體擴增產(chǎn)物；6為螺旋體擴增產(chǎn)物；7為弓形蟲擴增產(chǎn)物；8為羊泰勒蟲擴增產(chǎn)物；9為羊巴貝斯蟲擴增產(chǎn)物；10為無形體擴增產(chǎn)物；11為陰性對照。由圖可見，山羊痘病毒lamp引物特異性擴增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對照組無條帶產(chǎn)生，說明山羊痘病毒lamp引物特異性很高。圖3(C)為以羊的不同病原體基因組為模板，以綿羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增45 min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中M表不IOObp DNA Ladder marker ；1為綿羊痘病毒擴增產(chǎn)物；2為山羊痘病毒擴增產(chǎn)物；3為羊口瘡病毒擴增產(chǎn)物；4為支原體擴增產(chǎn)物；5為衣原體擴增產(chǎn)物；6為螺旋體擴增產(chǎn)物；7為弓形蟲擴增產(chǎn)物；8為羊泰勒蟲擴增產(chǎn)物；9為羊巴貝斯蟲擴增產(chǎn)物；10為無形體擴增產(chǎn)物；11為陰性對照。由圖可見，綿羊痘病毒lamp引物特異性擴增出了綿羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對照組無條帶產(chǎn)生，說明綿羊痘病毒lamp引物特異性很高。 圖4(A)為綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴增條件為62°C，擴增時間為45min。其中M代表IOObp DNA marker ;1為1.037X IO9個拷貝，2為1.037X IO8個拷貝；3為1.037X IO7個拷貝，4為1.037X IO6個拷貝；5 為 1.037X IO5個拷貝，6 為 1.037X IO4個拷貝，7 為 1.037X IO3個拷貝，8 為 1.037X IO2個拷貝，9為1.037X101個拷貝，10為1.037X10°個拷貝，11為陰性對照。由圖可見，1.037 X IO9-L 037 X IO3個拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，和對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用lamp引物在62°C下，擴增45min之后最少可檢出1.037X103個拷貝的模板。圖4(B)為山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴增時間為60min。其中M代表IOObp DNA marker ；1為1.045 X IO9個拷貝，2為1.045X IO8個拷貝;3為1.045X IO7個拷貝，4為1.045X IO6個拷貝;5為1.045X IO5個拷貝，6 為 1.045X 104個拷貝，7 為 1.045X IO3個拷貝，8 為 1.045X IO2個拷貝，9 為 1.045X IO1個拷貝，10為1.045X10°個拷貝，11為陰性對照。由圖可見，1.045X IO9-L 045X IO6個拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。對照組無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的山羊痘病毒lamp引物在62°C下，擴增60min之后最少可檢出1.045 X IO6個拷貝的模板。圖4(C)為綿羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴增時間為45min。其中M代表IOObp DNA marker ；1為1.037 X IO9個拷貝，2為1.037X IO8個拷貝；3為1.037X IO7個拷貝，4為1.037X IO6個拷貝；5為1.037X IO5個拷貝，6 為 1.037X IO4個拷貝，7 為 1.037X IO3個拷貝，8 為 1.037X IO2個拷貝，9 為 1.037X IO1個拷貝，10為1.037X10°個拷貝，11為陰性對照。由圖可見，1.037X IO9-L 037X IO4個拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。對照組無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的綿羊痘病毒lamp引物在62°C下，擴增45min之后最少可檢出1.037 X IO4個拷貝的模板。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細解說.1.序列的制備
應(yīng)用網(wǎng)上lamp引物設(shè)計軟件(PrimerExplorerV3)對羊痘病毒基因組反向重復(fù)末端(l-2000bp內(nèi))設(shè)計三個組引物，從獲得的數(shù)百對引物中選擇評分較高的引物在進行將設(shè)計好的序列發(fā)送至南京金斯瑞生物工程有限公司進行5’端修飾合成。2.病毒基因組提取
將VeiO細胞接種細胞培養(yǎng)瓶，單層細胞長至80%以上融合后，接種羊痘病毒病毒，370C孵育Ih后棄去毒液。加入細胞維持液含有1%胎牛血清DMEM，370C 5%C02培養(yǎng)，定期觀察細胞病變(CPE)Jt 90%以上細胞出現(xiàn)CPE后收毒。將病毒反復(fù)凍融3次，置-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨aKaRa公司DNA提取試劑盒提取細胞毒株中的DNA，獲得的病毒DNA即可用于檢測。3.Lamp擴增條件優(yōu)化
以提取純化的病毒DNA為模板進行擴增，實驗體系如下:
12.5 μ L LAMP 反應(yīng)緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),20 mmol/L KCl ,16 mmol/L MgS04、20 mmol/L (NH4) 2S04、0.2% Tween 20,1.6 mol/L 甜菜堿、2.8 mmol/L dNTPs)、0.9 μ L 引物混合液(40 pmol FIP、BIP、5 pmol F3、B3)、2.0 μ L DNA 樣品、1.0 μ L(8U) Bst DNA 聚合酶(New England Biolabs, M0275L)和 8.2 μ L 滅菌水。反應(yīng)條件為在60-64°C之間，反應(yīng)30-60min可鑒別檢測出綿羊痘病毒和山羊痘病毒。3.1反應(yīng)溫度的優(yōu)化
在進行l(wèi)amp引物的反應(yīng)溫度的確定時，按照上述體系加入反應(yīng)物。其中使用綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物時，使用模板為綿羊痘病毒或山羊痘病毒基因組均可；使用綿羊痘病毒lamp引物時,使用模板為綿羊痘病毒；使用山羊痘病毒lamp引物時,使用模板為山羊痘病毒。反應(yīng)溫度設(shè)為60°C、62°C、64°C和66°C的水浴鍋或PCR儀中進行，反應(yīng)時間為60 min,結(jié)束后80°C加熱2 min,各取2yL Lamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過紫外凝膠成像系統(tǒng)進行檢測并拍照。經(jīng)過檢測綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物擴增溫度梯度優(yōu)化，擴增60min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中60°C、62°C和64°C均有擴增條帶產(chǎn)生，66°C和對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C和64°C中任意一個溫度。山羊痘病毒lamp引物擴增溫度梯度優(yōu)化，擴增60min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中60 0C >62 0C和640C均有擴增條帶產(chǎn)生，66 °C和對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的山羊痘病毒lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C和64°C中任意一個溫度。綿羊痘病毒lamp引物擴增溫度梯度優(yōu)化，擴增60min后核酸電泳檢測結(jié)果。其中60°C、62、64°C和66°C均有擴增條帶產(chǎn)生，對照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的綿羊痘病毒lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C、64°C和66°C中任意一個溫度。3.2反應(yīng)時間的優(yōu)化
在進行l(wèi)amp引物的反應(yīng)時間的確定時 ，按照上述體系加入反應(yīng)物。其中使用綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物時，使用模板為綿羊痘病毒或山羊痘病毒基因組均可；使用綿羊痘病毒lamp引物時,使用模板為綿羊痘病毒；使用山羊痘病毒lamp引物時,使用模板為山羊痘病毒。反應(yīng)溫度設(shè)為62°C的水浴鍋或PCR儀中進行,反應(yīng)時間為3(T60 min,結(jié)束后80°C加熱2 min，各取2yL Lamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過紫外凝膠成像系統(tǒng)進行檢測并拍照。檢測結(jié)果顯示，綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結(jié)果。其中擴增45min、60min后均有擴增條帶產(chǎn)生，擴增30min和對照組均無條帶產(chǎn)生，可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用lamp引物在62°C下擴增時間可在45min之后擴增出特異性條帶。山羊痘病毒lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結(jié)果。其中擴增60min后均有擴增條帶產(chǎn)生,擴增30min、45min、和對照組均無條帶產(chǎn)生,此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增時間可在60min之后擴增出特異性條帶。綿羊痘病毒lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結(jié)果。其中擴增30min、45min和60min后均有擴增條帶產(chǎn)生,擴增對照組無條帶產(chǎn)生，可看出本發(fā)明所設(shè)計的綿羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增時間可在30min之后擴增出特異性條帶。3.3反應(yīng)特異性檢測在進行l(wèi)amp引物的反應(yīng)特異性的檢測時，按照上述體系加入反應(yīng)物。其中使用綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物、綿羊痘病毒lamp引物、山羊痘病毒lamp引物的模板分別為綿羊痘病毒、山羊痘病毒、羊水泡病毒、支原體、為衣原體、螺旋體、弓形蟲、羊泰勒蟲、羊巴貝斯蟲和無形體。反應(yīng)溫度設(shè)為62°C的水浴鍋或PCR儀中進行，反應(yīng)時間按優(yōu)化結(jié)果，綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物設(shè)為45min、綿羊痘病毒lamp引物反應(yīng)60min、山羊痘病毒lamp引物為60 min。反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱2 min,之后取出反應(yīng)管,各取2 μ LLamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過紫外凝膠成像系統(tǒng)進行檢測并拍照。檢測結(jié)果顯示以羊的不同病原體基因組為模板，以綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物在62°C下擴增45min后核酸電泳檢測結(jié)果。通用lamp引物特異性擴增出了綿羊痘病毒和山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對照組無條帶產(chǎn)生，說明通用lamp引物特異性很高。以羊的不同病原體基因組為模板，以山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增60 min后核酸電泳檢測結(jié)果。山羊痘病毒lamp引物特異性擴增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對照組無條帶產(chǎn)生，說明山羊痘病毒lamp引物非常特
巳以羊的不同病原體基因組為模板，以綿羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增45 min后核酸電泳檢測結(jié)果。結(jié)果顯示綿羊痘病毒lamp引物特異性擴增出了綿羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對照組無條帶產(chǎn)生，說明綿羊痘病毒lamp引物特異性很高。3.4反應(yīng)靈敏度檢測
在進行l(wèi)amp引物的反應(yīng)靈敏度檢測時，按照上述體系加入反應(yīng)物。其中使用綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物時，使用模板為綿羊痘病毒或山羊痘病毒基因組均可；使用綿羊痘病毒lamp引物 時,使用模板為綿羊痘病毒；使用山羊痘病毒lamp引物時,使用模板為山羊痘病毒。所有模板均通過核酸測定儀測定濃度計算出拷貝數(shù)，分別稀釋出濃度梯度為1.037 X IO9-L 037 X 10°個拷貝共計10個梯度作為模板。反應(yīng)溫度設(shè)為62°C的水浴鍋或PCR儀中進行，反應(yīng)時間按優(yōu)化結(jié)果，綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物設(shè)為45min、綿羊痘病毒lamp引物設(shè)為45min、山羊痘病毒lamp引物為60 min。反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱2 min，之后取出反應(yīng)管，各取2yL Lamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過紫外凝膠成像系統(tǒng)進行檢測并拍照。結(jié)果顯示，綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴增條件為62°C，擴增時間為45min。結(jié)果顯示，1.037X IO9-L 037X IO3個拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，和對照組均無條帶產(chǎn)生，由此可看出本發(fā)明所設(shè)計的通用lamp引物在62°C下，擴增45min之后最少可檢出1.037X IO3個拷貝的模板。山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴增時間為60min。結(jié)果顯示，1.045X IO9-L 045X IO6個拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。對照組無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的山羊痘病毒lamp引物在62°C下,擴增60min之后最少可檢出1.045X IO6個拷貝的模板。為綿羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴增時間為45min。結(jié)果顯示，1.037X IO9-L 037X IO4個拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。對照組無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計的綿羊痘病毒lamp引物在62°C下,擴增45 min之后最少可檢出1.037 X IO4個拷貝的模板。3.5檢測結(jié)果判定
和陰性對照相比，GSPV通用引物擴增產(chǎn)物經(jīng)核算電泳檢測出現(xiàn)條帶，判定為羊痘病毒，同時GTPV引物擴增產(chǎn)物出現(xiàn)條帶而SPPV引物擴增產(chǎn)物不出現(xiàn)條帶判定為山羊痘病毒；GSPV通用引物擴增產(chǎn)物經(jīng)核算電泳檢測出現(xiàn)條帶，同時GTPV引物擴增產(chǎn)物不出現(xiàn)條帶而SPPV引物擴增產(chǎn)物出現(xiàn)條帶判定為綿羊痘病毒；GSPV通用引物擴增產(chǎn)物經(jīng)核算電泳檢測出現(xiàn)條帶，同時GTPV引物擴增產(chǎn)物出現(xiàn)條帶且SPPV引物擴增產(chǎn)物出現(xiàn)條帶判定為綿羊痘病毒和山羊痘病毒混合物。綜上可見，本發(fā)明設(shè)計合成的12個基因序列以及其形成的LAMP試劑盒及檢測方法可以聯(lián)合使用快速鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒，而且3組引物在靈敏度上互為補充，檢測方法簡單、檢測結(jié)果真 實可靠。
權(quán)利要求
1.鑒別檢測綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于檢測盒內(nèi)包括有三組引物:SEQ ID Na U SEQ ID Na 2、SEQ ID Na 3、SEQ ID Na 4、SEQ ID Na 5、SEQ ID Na 6、SEQID Na 7、SEQ ID Na 8、SEQ ID Na 9、SEQ ID Na 10、SEQ ID Ns 11 和 SEQ ID Na 12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別檢測綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于檢測盒內(nèi)還有 dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4)2S04、MgS04、Tween 20 和 Bst 酶，以及模板 DNA 陽性對照 。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于鑒別檢測綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒。本發(fā)明的鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒檢測盒內(nèi)包括有三組引物SEQID№1、SEQID№2、SEQID№3、SEQID№4、SEQID№5、SEQID№6、SEQID№7、SEQID№8、SEQID№9、SEQID№10、SEQID№11和SEQID№12。本發(fā)明可快速鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒，并在羊痘病毒流行病學(xué)研究中應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/70GK103215384SQ20131016181
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月4日
發(fā)明者趙志荀, 張強, 范斌, 吳國華, 顏新敏, 李健, 朱海霞, 蘆曉立, 孫曉林, 劉發(fā)央 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所