專利名稱：魚疫苗的制作方法
魚疫苗 本發(fā)明涉及用于對抗魚類細菌感染的不含Nocardia (諾卡氏菌)的組合疫苗，涉 及細菌用于制備這樣的疫苗的用途，涉及制備這樣的疫苗及相應(yīng)試劑盒的方法。在過去的幾十年，可以看到世界范圍內(nèi)魚類消費的巨大增長。這也涉及到比如鮭 魚、大菱鲆魚(Turbot)、大比目魚(Halibut)、和鱈魚這樣的冷水魚以及比如尖吻鱸(Asian sea bass)、羅非魚、遮目魚、黃尾魚(yellowtail)、琥珀魚、石斑魚、鯛魚和海鱺這樣的熱帶 魚的消費。因此，為滿足該日益增長的消費，已經(jīng)可以看到漁場數(shù)量和規(guī)模的增長。正如從畜牧學(xué)可知的，大量近距離聚居的動物易于受到各種各樣疾病的侵襲，甚 至受到在大規(guī)模商業(yè)化農(nóng)場出現(xiàn)之前幾乎未知或未見、或者甚至是未知的疾病的侵襲。對 于漁場也同樣有這樣的情況。發(fā)現(xiàn)對魚類致病的細菌屬于諾卡氏菌屬(Nocardia)、弧菌屬 (Vibrio)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、Tenacibaculum、 黃桿菌屬(Flavobacterium)、屈撓桿菌屬(Flexibacter)、唾胞菌屬(Cytophaga)、 Francisella、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬 (Lactococcus)或愛德華氏菌屬(Edwardsiella)0在Nocardia種中，Nocardia seriolae在溫水魚類中引起慢性問題。由 諾卡氏菌(Nocardial)感染給漁場業(yè)帶來的損失歷年來都在增長。尤其是，黃尾魚 (Seriolae quinqueradiata)> 砠 白 H (Seriolaedumerelli)> | IA H. (Lateolabrax japonicus)、黃魚(Lamitichthyscrocea)、魚昌魚(Pampus argenteus)、四指馬敏 (Eleutheronematetradactylum)(Lut janus sp)、石斑魚(Epinephelus sp)禾口六帶Ii (Caranx sexfasciatus)已經(jīng)被 Nocardia 感染。該疾病——常稱作“marine nocardiosis”，開始于無癥狀感染。其在“fry fish” 和幼魚中發(fā)展.該細菌在比如脾、肝和腎這樣的主要器官中繁殖。由于繁殖速率低，該細菌在任何可視癥狀出現(xiàn)之前可在魚組織中長時間繁殖。因 此該疾病被稱作慢性的。當暴發(fā)顯現(xiàn)時只要其結(jié)果是魚的重量在300至IOOOg之間，經(jīng)濟 損失就是顯著的。研究顯示，與患病幼魚(在先注射過活Nocardia)共享魚池空間的黃尾魚(yellow tail)在同居三個月后最終出現(xiàn)體內(nèi)病狀(脾上的白點)。在海洋長須鯨的養(yǎng)殖中，諾卡氏 菌(Nocardial)感染在水溫達到24°C或更高的夏季月份似乎發(fā)展得更快，但是由Nocardia 導(dǎo)致的死亡率更常見于秋季和初冬月份，因為該魚不得不適應(yīng)新的環(huán)境狀況但其免疫系統(tǒng) 卻退化了。Nocardia本身似乎是非常弱的免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)物，因為盡管該疾病進展非常緩慢， 但是免疫系統(tǒng)卻并不設(shè)法清除該感染。這也解釋了這樣一個事實不存在對抗Nocardia的 有效疫苗。包含一定限定的活減毒或失活細菌的疫苗能模擬天然感染，但是如果甚至天然 感染都不能成功誘導(dǎo)足夠的免疫反應(yīng)，那么人們就無法期望疫苗能夠做得更好。顯然，極為需要有效的疫苗。本發(fā)明的一個目的是提供更好的對抗Nocardia感染的疫苗。
現(xiàn)在驚人地發(fā)現(xiàn)，包含加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、殺魚巴斯德氏菌 (Pasteurella piscicida)(也已知為Photobacteriumdamselae subspecies piscicidae) 和鰻弧菌(目前還已知為Listonella anguillarum)種的不含Nocardia的組合疫苗，不 僅按照預(yù)期的提供對抗加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、Pasteurellapiscicida和 鰻弧菌(vibrio angui llarum)感染的保護，還完全意外地提供顯著水平的對抗Nocardia seriolae的保護。最令人驚奇的是，這一對抗Nocardia seriolae感染的保護水平顯著高 于通過單價Nocardia seriolae疫苗獲得的保護水平。因此，本發(fā)明第一種實施方案涉及用于對抗魚類Nocardia感染的不含 Nocardia的組合疫苗，其特征在于所述疫苗含有Lactococcusgarviae、殺魚巴斯德氏菌 (Pasteurella piscicida)和Vibrioanguillarum種的細菌以及藥學(xué)上可接受的載體。這一預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)背后的工作機理目前尚不清楚。然而，推測存在于或者吸附 于所使用的細菌表面的某種成分，是對抗魚類Nocardia的交叉特異性免疫的強刺激物。交 叉特異性在此意指并非由Nocardia引起但仍然提供對抗Nocardia的保護。對于制備這樣的疫苗，細菌的狀態(tài)，活的或者是失活的，確實并不重要。重要的是 這樣一個事實在魚類中仍然出現(xiàn)對抗Nocardia的交叉特異性免疫。這可以通過使用全細菌制劑來保證。如上所述，制劑中的細菌是活的、滅活的或者 甚至片斷化(例如，通過將其擠壓通過弗氏壓碎器)，這一點是不重要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于滅活的方法與細菌活性并不非常相關(guān)。經(jīng)典的滅活 方法，例如UV射線、gamma射線、用福爾馬林、二乙烯亞胺、熱處理等等，所有本領(lǐng)域熟知的 方法均可采用。通過物理脅迫方法來滅活細菌，采用例如弗氏壓碎器，提供用于同樣適宜的 制備本發(fā)明疫苗的起始材料。因此滅活細菌不必須是滅活的完整細胞形式，這些細胞可以 被破壞。滅活細菌相比活減毒病毒具有非常安全的優(yōu)點。因此，在該實施方案的一種優(yōu)選形式中，本發(fā)明涉及其中細菌種為滅活的本發(fā)明
組合疫苗。活減毒細菌也是非常適宜的，因為它們顯然攜帶有刺激對抗Nocardia的交叉特 異性免疫的因子。并且活減毒細菌相比滅活細菌，尤其是不帶佐劑時，還具有以下益處它 們比滅活細菌更為有效。此外，它們進行一定程度的復(fù)制直到它們被免疫系統(tǒng)阻止，其結(jié)果 是可以給予更低數(shù)量的細胞?；顪p毒細菌是比相應(yīng)的野生型細菌具有更低的致病性但仍然 能夠誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答的細菌。減毒菌株可通過本領(lǐng)域久已知曉的傳統(tǒng)方法獲得，例如繼代培養(yǎng)、 temperature-adaptation、化學(xué)誘變、UV射線等，或者定點誘變。因此，在另一種優(yōu)選形式中，本發(fā)明涉及其中至少一種細菌種為活減毒形式的本 發(fā)明組合疫苗。本發(fā)明的疫苗可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)從細菌培養(yǎng)物開始制備。與魚疫苗及其制備有關(guān)的綜述性文章有Jommerset，L，Krossoy, B.， Biering, E.禾口 Frost， P.發(fā)表于 Expert Review of Vaccines 4:89—101(2005)， Buchmann, K. , Lindenstrom, Τ.禾口 Bresciani,發(fā)表于 J. Acta Parasitologica 46 71-81 (2001), Vinitnantharat, S. , Gravningen, K.禾口 Greger, Ε·發(fā)表于 Advances inveterinarymedicine 41:539-550(1999)以及 Anderson, D. P.發(fā)表于 Developments in Biological Standardization 90:257-265(1997)。本發(fā)明的疫苗主要包括有效量的本發(fā)明細菌和藥學(xué)可接受載體。本文所使用的術(shù)語“有效的”被定義為足以在靶魚中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量，從而使得 與在相同條件下未經(jīng)免疫的魚相比，以及和用野生型Nocardia感染所導(dǎo)致的靶魚發(fā)病水 平低50%。所施用的細胞量依賴于各物種的細菌量、細菌狀況、減毒活或者滅活、有無佐劑以 及施用方式。如果從商購疫苗開始，制造商將會提供這一信息。否則，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從上述參考文獻以及以下給出的信息尤其是實施例中 找到足夠的教導(dǎo)。如上所述，本發(fā)明的疫苗可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)從細菌培養(yǎng)物開始制 備。在實施例部分，給出了制備本發(fā)明疫苗的實施例。通常來講，根據(jù)本發(fā)明制備的基于滅活細菌的疫苗通?？梢越o予IO3至101(1，優(yōu)選 IO6至109，更優(yōu)選IO8和IO9之間個細菌的劑量。超過IOltl量的細菌，盡管在免疫學(xué)上是適 宜的，但是由于經(jīng)濟原因卻并不那么吸引人。根據(jù)本發(fā)明方法制備的基于活減毒細菌的疫 苗可以給予較低的劑量，因為存在這樣一個事實細菌在施用后將繼續(xù)復(fù)制一定的時間。根 據(jù)本發(fā)明方法制備的基于活減毒細菌的疫苗通?？山o予IO2至108，優(yōu)選IO3至IO5個細菌 的劑量。特別適于本發(fā)明疫苗的藥學(xué)可接受載體的例子有無菌水、生理鹽水、比如PBS這 樣的水性緩沖液等等。此外，如下所述，本發(fā)明的疫苗還可包含比如佐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑 這樣的其他添加劑，以及其他。如本發(fā)明所述制備的疫苗可在優(yōu)選的呈現(xiàn)形式中包含免疫刺激物質(zhì)，那所謂的 佐劑。佐劑通常包括以非特異性方式增強宿主免疫應(yīng)答的物質(zhì)。許多佐劑是本領(lǐng)域已知 的。漁場和貝類農(nóng)場常用的佐劑的例子有胞壁酰二肽、脂多糖、數(shù)種葡聚糖和多糖以及 Carbopol 。Jan Raa在文獻綜述中給出了適用于魚類和貝類魚疫苗的佐劑的廣泛綜述 (Reviews in Fisheries Science 4(3) :229_288(1996))。該疫苗還包括所謂的“載體”。載體是細菌所依附但不與之共價結(jié)合的化合物。這 樣的載體有生物微囊、藻酸鹽微球、脂質(zhì)體和大分子物，均為本領(lǐng)域已知。這樣的載體的一種特別形式，其中抗原被部分種植于該載體中，是所謂的 ISCOM(歐洲專利 EP 109. 942，EP 180. 564，EP 242.380)。此外，該疫苗可包括一或多種適宜的表面激活化合物或乳化劑，例如Span或 Tween0這樣，在該實施方案的一種優(yōu)選形式中，本發(fā)明的組合疫苗含有佐劑。對于本發(fā)明的組合疫苗，油佐劑通常表現(xiàn)得更為有效些。適用于油包水乳化物的油佐劑有礦物油或可代謝油。礦物油有例如 Bayol 、Marcol 和Drakeol 。可代謝油有例如，比如花生油和大豆油這樣的植物油，比如魚油角鯊烯和角鯊?fù)?這樣的動物油，以及生育酚及其衍生物。
適宜的佐劑有例如w/o乳劑，o/w乳劑和w/o/w復(fù)乳劑。非常適宜的o/w乳劑是例如，獲自始于5-50% w/w水相和95_50% w/w油佐劑，更 優(yōu)選20-50% w/w水相和80-50% w/w油佐劑的乳劑。因此，在該實施方案的一種甚至更優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的組合疫苗含有佐劑，其 中的佐劑是油佐劑。如上所述，油佐劑可大略分為含礦物油的佐劑和不含礦物油的佐劑。從食品安全 的角度以及由于其某些時候帶來的損害兩方面來看，礦物油都更缺乏吸引力。因此，一種優(yōu) 選的油佐劑含有非礦物油。一種優(yōu)選的非礦物油是可以從SEPPIC，法國，商業(yè)獲得的ISA 763AVG油。所添加的佐劑量依賴于佐劑自身的性質(zhì)，關(guān)于該量的信息由制造商提供。疫苗中?；旌嫌蟹€(wěn)定劑，例如，為保護有降解傾向的蛋白質(zhì)免于被降解，為增強疫 苗的保質(zhì)期，或者為提供凍干效率。有用的穩(wěn)定劑有SPGA (Bovarnik等人，J. Bacteriology 59 :509(1950))，碳水化合物——例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖苷或葡萄 糖，比如白蛋白或酪蛋白或其降解產(chǎn)物這樣的蛋白質(zhì)，和比如堿性金屬磷酸鹽這樣的緩沖 液。優(yōu)選地，所述疫苗以凍干形式呈現(xiàn)。此外，該疫苗還可懸浮于生理可接受的稀釋劑中。不言而喻，其他佐劑化、添加載體化合物或稀釋劑、乳化或穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法都包 含在本發(fā)明中?？梢圆捎迷S多施用方式，所有都是本領(lǐng)域已知的。所述疫苗優(yōu)選通過例如腹膜注 射這樣的注射、浸泡、噴霧、浸漬或經(jīng)口施用于魚類。然而應(yīng)當牢記，施用途徑還可能依賴 于疫苗的類型如果該疫苗含活的減毒Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida禾口 Vibrioanguillarum菌，它可以容易地通過浸漬施用。另一方面如果該疫苗含有滅活細菌形 式的 Lactococcus garviae>PasteureIla piscicida 禾口 Vibrio anguiIlarum 菌，或者更常 說的如果該疫苗可通過混入佐劑來改進，優(yōu)選的施用方式則是腹膜注射途徑。從免疫學(xué)的 角度，腹膜內(nèi)接種是魚類免疫的有效方式，當然是對于滅活細菌，尤其是因為它允許摻入佐 劑。制備本發(fā)明疫苗的一種便利方式是，利用可商購的疫苗。Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida疫苗禾口Vibrioanguillarum疫苗是可商業(yè)獲得的，禾口/或文獻中己 描述了生產(chǎn)它們的方法。施用方案可以根據(jù)標準接種實踐最優(yōu)化。被接種的魚齡并不重要，盡管顯然人們想要在早期接種以對抗Nocardia感染。對 于許多魚疫苗來說是在魚重介于10和35克之間時施用。這對于對抗Nocardia也是一個 非常適宜的接種時刻。對于經(jīng)口施用，疫苗優(yōu)選與適宜的用于經(jīng)口施用的載體混合，例如纖維素、食物或 可代謝物質(zhì)，比如α-纖維素或各種植物或動物來源的油類。通過生物封裝來施用疫苗也 是一種吸引人的方法，其中將活飼料暴露于高濃度的疫苗，然后向魚類飼喂活飼料生物。尤 其優(yōu)選用于經(jīng)口運送本發(fā)明疫苗的食物載體是能夠封裝疫苗的活飼料生物。適宜的活飼料 生物包括浮游生物樣非選擇性過濾進食者，優(yōu)選為輪蟲(Rotifera)、鹵蟲(Artemia)等中的成員。高度優(yōu)選的是鹵蟲Artemiasp.。基于大量對魚類致病的病毒和生物，對于疫苗生產(chǎn)有益的是還與Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida 禾口 Vibrioanguillarum 菌共同施用一或多禾中其他非 Nocardia魚類致病細菌或病毒、這些細菌或病毒的抗原或編碼這樣的抗原的遺傳材料。眾人皆知的在商業(yè)上很重要的魚類病原例子是近來發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致大肚癥狀的細菌， 如同泰國專利申請TH 92840所述，(該新細菌的一個例子(BB E3F1)已保藏于法國微生物 保藏中心(CNCM), InstitutPasteur, 25 Rue du Docteur Roux，F(xiàn)_75724 Paris Cedex 15， 法國，保藏號為 CNCM 1-3257), Tenacibaculum maritimum、Flavobacterium coIumnare> Flexibacter maritimus(舊名為 Tenacibaculum maritimum)、 Streptococcus iniae、 Streptococcusdifficile> Streptococcus agalactiae、 Streptococcusdysgalactiae、 Edwardsiella tarda、Edwardsiella ictaluri、Mycobacterium maritimum、Francisella sp,以及比如Nodavirus、Irido病毒、Koi herpes病毒、Channel Catfish病毒這樣的病毒。這樣的組合疫苗的優(yōu)點是它不僅提供對抗加氏乳球菌(Lactococcus garviae), 殺魚巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)禾口 Vibrio anguiIlarum 感染以及 Nocardia 感 染的保護，還提供對抗其他疾病的保護。因此，在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的不含Nocardia的組合疫苗含有，除 Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida 禾口 Vibrioanguillarum 禾中的細菌夕卜，至少 還含有一種其它對魚類致病的微生物或病毒，或這樣的微生物或病毒的一種其他抗原或編 碼所述其他抗原的遺傳材料。在一種更優(yōu)選的實施方案種中，至少一種對魚類致病的其他微生物，或一種這 樣的微生物的其他抗原或者編碼所述其它抗原的遺傳材料選自導(dǎo)致引起大肚病的細 菌、Flavobacterium columnare、Tenacibaculum maritimum、Streptococcus iniae、 StreptococcusdifficiIeλ Streptococcus agalactiae、 Streptococcusdysgalactiae、 Edwardsiella tarda、Edwardsiella ictaluri、Mycobacterium maritimum、Francisella sp.、Nodavirusλ Irido 痛毒、Koi herpes 病毒、Channel Catfish 病毒。本發(fā)明的另一種實施方案涉及生產(chǎn)對抗魚類Nocardia感染的疫苗的方法。這 樣的方法包括將活減毒或滅活形式的Lactococcusgarviae, Pasteurella piscicida禾口 Vibrio anguiIlarum細菌與藥學(xué)可接受載體混合。該實施方案的一種優(yōu)選形式涉及還包括與佐劑混合的方法。如果就 Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida 禾口 Vibrioanguillarum 疫 苗組分來說使用即用型疫苗，則可以在施用前將其混合。如果它們是經(jīng)口施用的，較好的選擇是在施用前混合。如果疫苗是注射施用的，為 同時施用可以將組分混合，也可以以連續(xù)注射的方式分別或者依次施用。無論是使用可商業(yè)獲得的加氏乳球菌(Lactococcus garviae)疫苗，Pasteurella piscicida (殺魚巴斯德氏菌)疫苗和Vibrioanguillarum疫苗，或如本發(fā)明實施例制備 的疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員寧愿使用必需量的誘導(dǎo)對抗各自細菌的免疫應(yīng)答的各細菌。僅作 為舉例本發(fā)明不含Nocardia的疫苗中的Lactococcus garviae量優(yōu)選為足以誘導(dǎo)對抗 Lactococcus garviae感染的免疫應(yīng)答。組合疫苗中的 Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida 禾口 Vibrioanguillarum種的細菌可同時、分別或依次施用。按照下文的解釋，如果在短時間間隔內(nèi)施 用的話，它們?nèi)匀豢梢员灰暈榻M合疫苗。同時施用是指在時間上于同一時刻施用Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida和Vibrio anguiIlarum菌，優(yōu)選作為混合物注射。因為便于操作，這當然是一種 優(yōu)選的方法。分別施用是指在兩個或者更多個不同的注射位點施用加氏乳球菌、殺魚巴斯 德氏菌和Vibrio anguillarum菌(部分或者全部)，優(yōu)選在時間上于同一時刻。依次施用是指在時間上于不同時刻施用Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum菌。顯然，如果分別或者依次施用，優(yōu)選在同一天施用， 更優(yōu)選按照優(yōu)選順序在12、10、8、6、4、2或1小時內(nèi)施用。甚至更優(yōu)選的是在彼此之后的50、 40、30、20、10或5分鐘內(nèi)施用。如果要在十分鐘，甚至更好的是5或少于5分鐘，內(nèi)完成全 部組合疫苗的施用，在一個時刻處理各魚將能夠?qū)崿F(xiàn)，并允許幾乎同時開始對免疫系統(tǒng)的 開啟。本發(fā)明的另一實施方案涉及 Lactococcus garviae， Pasteurellapiscicida 禾口 Vibrio anguillarum中至少一種細菌用于生產(chǎn)對抗魚類Nocardia感染的不含Nocardia的 組合疫苗的用途。在該實施方案的一種優(yōu)選形式中，將要對抗其中的Nocardiaseriolae感染 以及為此生產(chǎn)疫苗的魚類屬于黃尾魚(Seriolaequinqueradiata)、琥珀魚(Seriolae dumerelli) > S盧 H (Lateolabrax japonicus) > 胃 H. (Lamitichthys crocea) > 魚昌 H (Pampus argenteus)、四指馬鲅(Eleutheronema tetradactylum)、鯛魚(Lutjanus sp)、石 SEH. (Epinephelus sp)禾口AHi (Caranxsexfasciatus)。在該實施方案的另一種優(yōu)選形式中，用于制備的至少一種細菌物種為活減毒形 式。在該實施方案的另一種優(yōu)選形式中，用于制備的細菌物種是滅活的。在該實施方案的一種更優(yōu)選形式中，為制備所述疫苗還使用至少一種其他對魚類 致病的微生物或病毒、或一種其他這樣的微生物或病毒的抗原或編碼所述抗原的遺傳材 料。在該實施方案的一種甚至更優(yōu)選形式中，所述其他微生物或病毒選自引起大肚 病(Big Belly syndrome)的細菌、FlavobacteriumcoIumnareΛ Streptococcus iniae、 Streptococcus difficile、Streptococcus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、 Edwardsiella tarda、Edwardsiella ictaluri、Mycobacteriummaritimum、Francisella sp.、Nodavirusλ Irido 病毒、Koiherpes 病毒、Channel Catfish 病毒。最后，另一實施方案涉及相應(yīng)試劑盒，其中該試劑盒包含至少兩種疫苗瓶，且這 至少兩種瓶子共同含有用于對抗魚類Nocardiaseriolae感染的Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum種的細菌及藥學(xué)可接受載體。僅僅作為例 子如果該試劑盒共同含有包含 Lactococcus garviae, Pasteurellapiscicida 禾口 Vibrio anguillarum種的細菌，這意味著這三種類型的細菌各自存在于至少其中一個瓶子中。結(jié) 果是這三種類型的細菌都存在于試劑盒中。在該例子中，一個瓶子可含有Lactococcus garviae,而另一個瓶子含有 Pasteurella piscicida 禾口 Vibrio anguillarum。作為選擇， 一個瓶子可以含有Lactococcus garviae, Pasteurellapiscicida,而另一個瓶子可含有Vibrio anguillarum。如果該試劑盒含有例如三個瓶子，則各類型的細菌可以存在于單一 的瓶里。
實施例實施例1動物管理測試系統(tǒng)動物 禾中(Seriola quinqueradiata)來源野生捕獲的幼魚試驗開始時的平均體重約20g(18_27g)由于這些魚是野生捕獲的幼魚，因此它們都沒有接受過任何在先的接種免疫。在 一達到時即將魚置于隔離魚池中直到它們長到試驗所需的正確大小。采納和排除標準僅使用健康的魚。免疫接種后，未對患病動物作出治療或者排除動物。水鹽度天然海水25_35ppt溫度接種后24°C +/"2 °C，免疫試驗后26 °C +/_2°C喂養(yǎng)在預(yù)備試驗階段，每日隨意飼喂數(shù)次。一旦足夠數(shù)量的魚達到約20g的目標體重 并顯示出無感染，即將它們轉(zhuǎn)入試驗魚池。在試驗階段(免疫接種后)，每天飼喂其體重的 2-3% (BW)(每周調(diào)整)。盡可能地使免疫接種和假接種魚類的每kg體重飼喂量保持相似。 以每周間隔，在各組按照10-15條每組稱量體重以確定平均體重以重新計算飼喂量。在免 疫接種前使魚饑餓24小時以確保胃腸道為空且由此預(yù)防注射對內(nèi)臟的損傷。免疫試驗后 給魚飼喂1-3% BW。魚池試驗開始時將魚分為接種組和假接種組，然后轉(zhuǎn)入500L魚池中。利用垂直豎立于 魚池中間將魚池一分為二的網(wǎng)將魚組區(qū)分開。各半魚池用魚池編號和字母(A或B)來識別。 免疫試驗后，將魚居住于50L魚池中。分組和給藥免疫接種在魚體測大約胸鰭末端的位置進行IP注射。使用小的一次性皮下注射針頭和一 次性針管。對照魚用SVDB(標準疫苗稀釋緩沖液=PBS)假接種。免疫試驗免疫試驗材料的準備從零下50°C冰箱中取出野生型Nocardia seriolae免疫菌種并令其解凍。將瓶中 內(nèi)容物以(ν/ν)的比率接種到Eugon Broth液體培養(yǎng)基中，在橢圓振蕩器上以150RPM 的震蕩速率于26°C培養(yǎng)約 -71h。相應(yīng)于每毫升大約IO8CFU可視細胞數(shù)量的培養(yǎng)物OD66tlnm 通常為1. 5-1. 6。
利用這一呈現(xiàn)延遲對數(shù)生長期的懸浮物來制備免疫試驗懸浮物。在鹽溶液中適當 稀釋后用于注射。免疫試驗IP注射完成免疫試驗。從試驗組，給魚類注射0.1ml標準化的細菌懸浮液。在 AQUI-S中對各組進行麻醉直到它們鎮(zhèn)靜，在其體左側(cè)緊靠在胸鰭尖后面進行腹膜內(nèi)注射。 注射后立即將魚轉(zhuǎn)入它們的分配魚池中，然后回收。在免疫試驗前令魚饑餓24小時以確保 其胃腸道全空。結(jié)果評價通過在對照組的死亡率達到60%或更高的那天計算各組相對于對照組的相對存 活百分數(shù)(RPS)數(shù)值來評估對各疫苗劑型做的免疫試驗結(jié)果。此外，用2X2 列聯(lián)表和 Fisher' s 確切概率(One tailed, Stat SoftInc (2004), Statistica, data analysis Software system, version6)對最終確定的試驗組禾口各對照 組間的確定累計死亡率作了統(tǒng)計分析。根據(jù)以下公式計算RPS值
RPS = (1------------) x 100實施例中的抗原濃度常以O(shè)DU/ml給出。ODU/ml是根據(jù)以下計算的抗原濃度 (ODU/ml) = (((OD660). 1+(OD660) .2)/2)-0.2118)/0.0018*DF*106，其中(OD660) · 1+(OD660) · 2 是兩次OD66tl測定的OD66tl值，以及其中DF是稀釋倍數(shù)。此處所述的所有單價疫苗都來自甲醛滅活的N. seriolae抗原并配制成油佐劑化 疫苗。疫苗Vl和V2以0. 05的注射體積進行注射。將疫苗與等體積疫苗稀釋液混合后，以 0. Iml注射疫苗V3、V4和V5。測試項目疫苗1 類型單價N. seriolae/油佐劑化配方1.0 X 1070DU/ml (5. 0 X IO5ODU/ 魚)疫苗2 類型單價N. seriolae/油佐劑化配方1.OX 1060DU/ml (5. 0X IO4ODU/ 魚)疫苗3 類型單價N. seriolae/油佐劑化配方1.0 X 1070DU/ml (5. 0 X IO5ODU/ 魚)疫苗4 類型單價N. seriolae/油佐劑化配方1.OX 1060DU/ml (5. 0X IO4ODU/ 魚)疫苗5 類型單價N. seriolae/油佐劑化配方1.0 X 1050DU/ml (5. 0 X IO3ODU/ 魚)疫苗稀釋液類型油中的標準疫苗稀釋緩沖液SVDB
類型標準疫苗稀釋緩沖液(SVDB)所測試的疫苗配方列于表1。疫苗是配制成微組分的油包水疫苗，并在使用前與 ISA 763A VG油性疫苗稀釋液混合。表1處理組，免疫進行第三周和第六周的魚數(shù)量 RPS 值表2.最小抗原試驗中不同疫苗條件下第三周和第六周免疫的RPS6tl值 正如從表2得出的，免疫接種的魚的存活并不顯著區(qū)別于對照(單尾Fisherexact,ρ < 0. 05)。接種組和對照組的存活率和死亡率的相對百分數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上都不顯著。實施例2動物管理測試系統(tǒng)動物采納和排除標準水喂養(yǎng)魚池分組和給藥免疫接種免疫試驗免疫試驗材料的準備同實施例1免疫試驗同實施例1結(jié)果評估同實施例1測試項目疫苗疫苗類型三價 V. anguillarum/L. garvieae 6.8X108 細胞 /ml，P. piscicida 1. 36 X IO9 細胞/ml注射0.1ml所測試的疫苗制劑列于表3。疫苗是配制成微組分的油包水疫苗，并在使用 前與ISA 763A VG油-疫苗稀釋液混合。這些疫苗所使用的抗原來源于正常生產(chǎn)菌株 P. piscicida、L garvieae 禾口 V anguillarum0表3實驗組，所使用的疫苗，免疫接種和免疫試驗后分配的半魚池 RPS 值N. seriolae免疫試驗后的RPS (η = 15)。星號*表示免疫物和對照之間的統(tǒng)計學(xué)
同實施例1 同實施例1 同實施例1 同實施例1 同實施例1
同實施例1差異(單尾Fisher exact, ρ < 0. 05))。根據(jù)計算RPS得到的對照死亡率是73%。表4免疫試驗后的RPS6tl值 從該試驗，表4，可以得出，免疫試驗組的相對存活百分數(shù)是73%，而同時對照 組超過60%的魚死亡(對照組中的實際死亡率是72% )。因此，可以得出結(jié)論，含有 P. piscicida、L. garvieae 和 Vanguillarum 的疫苗能夠保護魚類對抗 Nocardia 感染。
權(quán)利要求
1)對抗魚類中Nocardia感染的不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于所述疫苗含有加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、殺魚巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrio anguillarum種的細菌和藥學(xué)可接受載體。2)根據(jù)權(quán)利要求的1不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于至少一種細菌種為活減毒形式。3)根據(jù)權(quán)利要求的1不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于細菌種為滅活的。4)根據(jù)權(quán)利要求的1 3不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于其含有佐劑。5)根據(jù)權(quán)利要求4的不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于佐劑為油佐劑。6)根據(jù)權(quán)利要求4或5的不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于佐劑為非礦物油佐劑.7)根據(jù)權(quán)利要求4 6的不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于佐劑為ISA 763A VG。8)根據(jù)權(quán)利要求1 7的不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于所述疫苗含有至少一種對魚類致病的其他微生物或病毒，或這樣的微生物或病毒的一種其他抗原或編碼所述其他抗原的遺傳材料。9)根據(jù)權(quán)利要求8的不含Nocardia的組合疫苗，其特征在于所述至少一種其他微生物或病毒選自引起大肚病的細菌、Tenacibaculum maritimum，F(xiàn)lavobacterium columnare，Streptococcus iniae，Streptococcus difficile，Streptococcusagalactiae，Streptococcus dysgalactiae，Edwardsiella tarda，Edwardsiella ictaluri，Mycobacterium maritimum，F(xiàn)rancisellasp.，Nodavirus，Irido病毒，Koi herpes病毒或Channel Catfish病毒。10)制備根據(jù)權(quán)利要求1 9不含Nocardia的組合疫苗的方法，其特征在于所述方法包括將加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、殺魚巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrio anguillarum物種的細菌與藥學(xué)可接受載體混合。11)至少加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、殺魚巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrio anguillarum用于生產(chǎn)對抗魚類中Nocardia seriolae感染的不含Nocardia的組合疫苗的用途。12)根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其特征在于魚類屬于黃尾魚(Seriolae quinqueradiata)、琥珀魚(Seriolae dumerelli)，海鱸魚(Lateolabrax japonicus)或黃魚(Lamitichthys crocea)種。13)根據(jù)權(quán)利要求11或12的用途，其特征在于至少一種所述細菌種為活減毒形式。14)根據(jù)權(quán)利要求11或12的用途，其特征在于所述細菌種為滅活的。15)根據(jù)權(quán)利要求11 14的用途，其特征在于為制備所述疫苗，還使用至少一種其他對魚類致病的微生物或病毒，或這樣的微生物或病毒的一種其他抗原或編碼所述其他抗原的遺傳材料。16)根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其特征在于所述其他的微生物或病毒選自引起大肚病的細菌、Tenacibaculum maritimum，F(xiàn)lavobacterium columnare，Streptococcus iniae，Streptococcusdifficile，Streptococcus agalactiae，Streptococcusdysgalactiae，Edwardsiella tarda，Edwardsiella ictaluri，Mycobacterium maritimum，F(xiàn)rancisella sp.，Nodavirus，Irido病毒，Koi herpes病毒或Channel Catfish病毒。17)組件的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有至少兩個疫苗瓶，所述瓶子共同含有用于對抗魚類中Nocardia seriolae感染的加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、殺魚巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)和Vibrio anguillarum種的細菌以及藥學(xué)可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對抗魚類細菌感染的不含諾卡菌(Nocardia)的組合疫苗，涉及用于制備這樣的疫苗的細菌的用途，涉及制備這樣的疫苗及相應(yīng)試劑盒的方法。
文檔編號A61K39/106GK101903042SQ200880121863
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者F·S·王, L·拉布里 申請人:英特威國際有限公司