本發(fā)明涉及一種無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

自從1975年kohler和milstein建立雜交瘤技術(shù)以來，由雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已應(yīng)用到許多方面，特別是在疾病診斷和治療及親和層析分離方面,單克隆抗體具有十分誘人的應(yīng)用前景，其中cd3單抗于1987年被美國fda批準(zhǔn)用于臨床，1990年已達(dá)到1千萬美元的年產(chǎn)值。美國制藥工業(yè)協(xié)會調(diào)查報告顯示，單抗位列所有醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品之首。

單克隆抗體生產(chǎn)分體內(nèi)法和體外法，體外細(xì)胞培養(yǎng)途徑具有重要的優(yōu)點，如：1.可以采用單元操作法培養(yǎng)，隨著規(guī)模增大，降低生產(chǎn)成本；2.減少鼠類動物感染疾病給產(chǎn)物帶來的污染，避免鼠的其它抗體的存在；3.可以生產(chǎn)人的單克隆抗體；4.過程可以工程化和自動控制，提高了重演性。

隨著單克隆抗體的大量應(yīng)用，雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟。英國celltech公司的1萬升氣升式反應(yīng)器已經(jīng)開發(fā)成功，并應(yīng)用于抗人abo血型單抗的生產(chǎn)。目前，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)已不再以反應(yīng)器培養(yǎng)規(guī)模作為重要的指標(biāo)，而把更多的精力集中于雜交瘤細(xì)胞的代謝調(diào)控、反應(yīng)器的操作模式和控制策略及無血清無蛋白培養(yǎng)技術(shù)等方面，以提高雜交瘤細(xì)胞密度和單抗的生產(chǎn)率，生產(chǎn)雜蛋白含量低、容易分離純化的體內(nèi)用單克隆抗體。

相對于貼壁依賴性細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的放大可以更多地借助于微生物發(fā)酵的經(jīng)驗。八十年代初，已利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。為了使培養(yǎng)放大工作更加有效，細(xì)胞高密度培養(yǎng)的研究引起重視，而首先遇到的則是培養(yǎng)條件的優(yōu)化，并逐漸過渡到代謝的調(diào)控等方面。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，適合工業(yè)抗體生產(chǎn)，配合反應(yīng)器或搖瓶培養(yǎng)，可維持雜交瘤細(xì)胞的高密度生長。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，在代謝調(diào)控，細(xì)胞抗體表達(dá)以及高密度維持做了很大改進(jìn)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：

l-精氨酸100～300；

cuso4·5h2o0.0005～0.005；

l-天門冬酰胺25～75；

l-天門冬氨酸10～30；

l-谷氨酸10～30；

ni(no3)2·6h2o0.00002～0.0002；

l-谷氨酰胺0～500；

znso4·7h2o0.06～0.6；

甘氨酸5～15；

cocl2·6h2o0.001～0.008；

l-組氨酸10～30；

nasio3·9h2o0.001～0.01；

l-異亮氨酸25～75；

na3vo4·12h2o0.0005～0.005；

l-賴氨酸鹽酸20～60；

snc12·2h2o0.00001～0.0001；

l-蛋氨酸10～30；

na2seo30.002～0.01；

l-苯丙氨酸10～30；

feso4·7h2o0.2～1.6；

l-脯氨酸10～30；

葡萄糖1000～4000；

l-絲氨酸15～45；

維生素co.176～0.704；

l-蘇氨酸10～30；

對羥基苯甲酸0.5～1.5；

l-色氨酸5～15；

丙酮酸鈉55～550；

l-纈氨酸1o～30；

亞油酸0.01～0.05；

l-亮氨酸25～75；

β-巰基乙醇0.8～4.0；

二水l-酪氨酸二鈉144～432；

乙醇胺1～5；

l-胱氨酸二鹽酸25～75；

地塞米松0.001～0.005；

人轉(zhuǎn)鐵蛋白5～50；

胰島素：8～20

純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白：1～30；

膽固醇：20～60；

過氧化氫酶：20～50；

亞硒酸鈉：17.3～35.0

1％二巰基乙醇溶液：0.35～1.0ml/l；

氯化錳0.0001～0.01；

偏釩酸銨0.0001～0.1；

氯化鎳0.0001～0.1；

二水氯化錫0.0001～0.1；

四水鉬酸銨0.0001～0.1；

余量為水。

本發(fā)明的無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.2，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護(hù)進(jìn)行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。

本發(fā)明的無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，主要成分包括氨基酸，無機(jī)鹽成分，生長因子及白蛋白成分，可提高雜交瘤細(xì)胞在搖瓶生長的最大密度，擴(kuò)增倍數(shù)為60～80倍，同時抗體表達(dá)量增高，是傳統(tǒng)工藝的1倍以上；在產(chǎn)量提高的同時，使用較少的培養(yǎng)基，大大降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明的制備工藝全部采用在線清洗及在線滅菌設(shè)備，保證批間差的穩(wěn)定，同時生產(chǎn)中采用惰性氣體氮氣保護(hù)，避免不穩(wěn)定性成分被氧化，該工藝生產(chǎn)的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，解決了大多數(shù)廠家生產(chǎn)質(zhì)量不易控制的問題。

附圖說明

圖1：雜交瘤在無血清培養(yǎng)基中的生長圖片(100×)。

圖2：雜交瘤在無血清培養(yǎng)基中的生長圖片(400×)。

圖3：雜交瘤細(xì)胞的生長曲線示意圖，其中，yocon代表本發(fā)明的培養(yǎng)基(圖中的1d是指12小時)。

圖4：培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生抗體量對比示意圖，其中，位于上方的曲線代表采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)，位于下方的曲線代表采用gibco國外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。

實施例1制備無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基

是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：

l-精氨酸200；

cuso4·5h2o0.002；

l-天門冬酰胺50；

l-天門冬氨酸20；

l-谷氨酸20；

ni(no3)2·6h2o0.0001；

l-谷氨酰胺250；

znso4·7h2o0.3；

甘氨酸10；

cocl2·6h2o0.005；

l-組氨酸20；

nasio3·9h2o0.005；

l-異亮氨酸50；

na3vo4·12h2o0.003；

l-賴氨酸鹽酸40；

snc12·2h2o0.00005；

l-蛋氨酸20；

na2seo30.005；

l-苯丙氨酸20；

feso4·7h2o0.9；

l-脯氨酸20；

葡萄糖3000；

l-絲氨酸30；

維生素co.500；

l-蘇氨酸20；

對羥基苯甲酸1.0；

l-色氨酸10；

丙酮酸鈉300；

l-纈氨酸20；

亞油酸0.03；

l-亮氨酸50；

β-巰基乙醇2.0；

二水l-酪氨酸二鈉300；

乙醇胺3；

l-胱氨酸二鹽酸50；

地塞米松0.003；

人轉(zhuǎn)鐵蛋白30；

胰島素：15

純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白：15；

膽固醇：40；

過氧化氫酶：35；

亞硒酸鈉：28.0

1％二巰基乙醇溶液：0.70ml/l；

氯化錳0.005；

偏釩酸銨0.005；

氯化鎳0.005；

二水氯化錫0.005；

四水鉬酸銨0.005；

余量為水。

制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.2，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護(hù)進(jìn)行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。

實施例2制備無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基

是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：

l-精氨酸100；

cuso4·5h2o0.0005；

l-天門冬酰胺75；

l-天門冬氨酸30；

l-谷氨酸10；

ni(no3)2·6h2o0.00002；

l-谷氨酰胺500；

znso4·7h2o0.6；

甘氨酸5；

cocl2·6h2o0.001；

l-組氨酸30；

nasio3·9h2o0.01；

l-異亮氨酸25；

na3vo4·12h2o0.0005；

l-賴氨酸鹽酸60；

snc12·2h2o0.0001；

l-蛋氨酸10；

na2seo30.002；

l-苯丙氨酸30；

feso4·7h2o1.6；

l-脯氨酸10；

葡萄糖1000；

l-絲氨酸45；

維生素c0.704；

l-蘇氨酸10；

對羥基苯甲酸0.5；

l-色氨酸15；

丙酮酸鈉550；

l-纈氨酸1o；

亞油酸0.01；

l-亮氨酸75；

β-巰基乙醇4.0；

二水l-酪氨酸二鈉144；

乙醇胺1；

l-胱氨酸二鹽酸75；

地塞米松0.005；

人轉(zhuǎn)鐵蛋白5；

胰島素：8

純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白：30；

膽固醇：60；

過氧化氫酶：20；

亞硒酸鈉：17.3

1％二巰基乙醇溶液：1.0ml/l；

氯化錳0.01；

偏釩酸銨0.0001；

氯化鎳0.0001；

二水氯化錫0.1；

四水鉬酸銨0.1；

余量為水。

制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.2，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護(hù)進(jìn)行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。

實施例3制備無血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基

是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：

l-精氨酸300；

cuso4·5h2o0.005；

l-天門冬酰胺25；

l-天門冬氨酸10；

l-谷氨酸30；

ni(no3)2·6h2o0.0002；

l-谷氨酰胺100；

znso4·7h2o0.1；

甘氨酸15；

cocl2·6h2o0.008；

l-組氨酸10；

nasio3·9h2o0.001；

l-異亮氨酸75；

na3vo4·12h2o0.005；

l-賴氨酸鹽酸20；

snc12·2h2o0.00001；

l-蛋氨酸30；

na2seo30.01；

l-苯丙氨酸10；

feso4·7h2o0.2；

l-脯氨酸30；

葡萄糖4000；

l-絲氨酸15；

維生素co.176；

l-蘇氨酸30；

對羥基苯甲酸1.5；

l-色氨酸5；

丙酮酸鈉55；

l-纈氨酸30；

亞油酸0.05；

l-亮氨酸25；

β-巰基乙醇1.0；

二水l-酪氨酸二鈉432；

乙醇胺5；

l-胱氨酸二鹽酸25；

地塞米松0.001；

人轉(zhuǎn)鐵蛋白50；

胰島素：20

純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白：1；

膽固醇：20；

過氧化氫酶：50；

亞硒酸鈉：35.0

1％二巰基乙醇溶液：0.35ml/l；

氯化錳0.0001；

偏釩酸銨0.1；

氯化鎳0.1；

二水氯化錫0.0001；

四水鉬酸銨0.0001；

余量為水。

制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.2，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護(hù)進(jìn)行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。

實驗

將實施例1制備的培養(yǎng)基置于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將小鼠雜交瘤細(xì)胞(購自上海細(xì)胞保藏中心)以70cells/微升接種，在溫度37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)圖片如圖1、圖2所示(由圖1、圖2為細(xì)胞狀態(tài)圖，表明細(xì)胞生長狀態(tài)良好。其生長曲線如圖3所示，由圖3可見，雜交瘤細(xì)胞密度最高為2.185x10⁶cells/ml，倍增時間:14.53h。

同時，以gibco國外無血清培養(yǎng)基(市場購買得到)為對照培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。

上述兩種方式培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，所得單抗的濃度對比如圖4所示。由圖4可見，與gibco國外無血清培養(yǎng)基對比，本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，其抗體量有大幅度提高，抗體產(chǎn)量為國外培養(yǎng)基的1.37倍。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞時，無需馴化培養(yǎng)，避免了細(xì)胞培養(yǎng)時馴化的繁瑣工作，而其他雜交瘤無血清培養(yǎng)均需要梯度馴化，馴化周期較長(傳統(tǒng)馴化需要至少三周時間)。

上述雖然結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。