本發(fā)明屬于豬遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率的培養(yǎng)液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬體細(xì)胞核移植克隆技術(shù)是目前最簡易、最可靠的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬的方法。在影響豬核移植效率的諸多因素中，卵母細(xì)胞質(zhì)量的優(yōu)劣占首位。目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞成熟率普遍在60-70％，效率仍然相對(duì)較低，使體細(xì)胞核移植技術(shù)的實(shí)施受制于優(yōu)質(zhì)成熟卵母細(xì)胞的缺乏。
卵泡液和聚乙烯醇(polyvinylalcohol，pva)是兩種最常用的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液添加成分，由于卵泡液成分復(fù)雜，且具有多種生物活性因子，因此在多種動(dòng)物的卵母細(xì)胞體外成熟中都能起到非常好的促進(jìn)成熟質(zhì)量的效果。在豬的體外成熟培養(yǎng)體系中針對(duì)卵泡液的作用的研究很多，但是針對(duì)pva和卵泡液在培養(yǎng)液中的添加方式的研究較少，為了進(jìn)一步改良豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，為豬的體細(xì)胞核移植和轉(zhuǎn)基因豬研究提供大量高質(zhì)量的卵母細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)采用改良型tcm199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，研究了pva和豬卵泡液添加方式對(duì)卵母細(xì)胞成熟以及早期孤雌胚胎發(fā)育的影響。
卵泡液是由卵泡中血清滲出物經(jīng)過新陳代謝活動(dòng)產(chǎn)生的，包含有卵泡壁細(xì)胞合成的類固醇和糖蛋白。卵母細(xì)胞成熟液中添加卵泡液濃度的不同對(duì)卵母細(xì)胞的成熟也有不同的影響，從不同大小卵泡中獲取的卵泡液效果也不同。pva(聚乙烯醇)是一種常見的血清替代品，大量研究表明，使用血清替代品可以支持卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精以及胚胎發(fā)育。一般認(rèn)為血清替代品不如血清的培養(yǎng)效果，sofaa中添加4mg/mlbsa或1mg/mlpva降低了牛體外受精胚的囊胚率和細(xì)胞數(shù)量。
公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率的培養(yǎng)液及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
一種提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率的培養(yǎng)液，包括以下原料：tcm-199、nahco3、d-glucose、sodiumpyruvate、streptomycinsulfate、pva、cysteine和penicilling。
作為優(yōu)選，所述的提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率的培養(yǎng)液，所述原料的濃度為：tcm-1999.5g/l、nahco32.2mg/ml、d-glucose3.05mmol/l、sodiumpyruvate0.91mmol/l、streptomycinsulfate0.5g/l、pva0.05％、cysteine0.57mmol/l和penicilling0.075g/l。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明在目前國內(nèi)普遍使用的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上增添了0.05％pva和5％卵泡液，使豬卵母細(xì)胞體外成熟效率可提高至90％以上，可為豬體細(xì)胞核移植技術(shù)提供更優(yōu)質(zhì)、數(shù)量更多的成熟卵母細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。
除非另有其它明確表示，否則在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“包括”或其變換如“包含”或“包括有”等等將被理解為包括所陳述的元件或組成部分，而并未排除其它元件或其它組成部分。
實(shí)施例1：
1材料
tcm-199、nahco3、d-glucose、sodiumpyruvate、streptomycinsulfate、pva、cysteine、penicilling、egf、fbs、hcg、pmsg、milli-q水、洗卵液。
2方法與結(jié)果
2.1卵泡液收取
從南寧市屠宰場收集母豬卵巢，置于34℃的生理鹽水中2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用0.9％的雙抗生理鹽水沖洗3次。用注射器抽取直徑為3-6mm的豬卵泡內(nèi)卵泡液，1600g/min離心20min，取上清液，用0.22μm濾器過濾后分裝，-20℃保存待用。
2.2成熟液配制
實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液成分如下表1所示，并加入5％(v/v)卵泡液，使用naoh調(diào)節(jié)ph值至7.2-7.4，定容后用0.22μm濾器過濾，4℃保存待用。
表1實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液成分
對(duì)照組培養(yǎng)液成分如下表2所示，并加入10％(v/v)卵泡液和10％(v/v)胎牛血清(fbs)，調(diào)節(jié)ph值至7.2-7.4，定容后用0.22μm濾器過濾，4℃保存待用。
表2對(duì)照組培養(yǎng)液成分
2.3豬卵母細(xì)胞體外成熟
取兩組不同成熟液添加10ng/mlegf、10iu/mlhcg、10iu/mlpmsg，放入38.5℃、5％co2、100％濕度的培養(yǎng)箱中平衡4h。
用注射器抽取卵巢表面上3-6mm卵泡內(nèi)液體，在體視顯微鏡下用玻璃吸管吸取卵泡液中帶2層及2層以上卵丘細(xì)胞、胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體，在洗卵液中洗3次，再在含激素成熟液中洗3次，最終放入含激素的兩組不同成熟液中。
在38.5℃、5％co2、100％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22-23h后，將卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體轉(zhuǎn)移到無激素的相應(yīng)的兩組不同成熟液中，繼續(xù)培養(yǎng)至44h。
2.4顆粒細(xì)胞去除
將經(jīng)體外成熟后的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體轉(zhuǎn)移至含0.1％透明質(zhì)酸酶的洗卵液中，用100μl移液槍反復(fù)吹打以去除顆粒細(xì)胞，再用洗卵液洗3次待用。
2.5成熟率計(jì)算
在體視顯微鏡下用玻璃吸管挑取卵周間隙清楚明顯、卵子細(xì)胞膜完整無損，且己經(jīng)有第一極體排出的卵母細(xì)胞，計(jì)算成熟率(有第一極體排出的卵母細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的比例)，如下表3所示。
表3本發(fā)明的培養(yǎng)液對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟率的影響
注：同一列含有不同小寫字母差異顯著(p<0.01)；
由表3可知，本發(fā)明的提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率的培養(yǎng)液對(duì)卵母細(xì)胞的成熟率為90.40％，遠(yuǎn)高于對(duì)照組。
2.6豬卵母細(xì)胞孤雌激活
在2種不同成熟體系ivm44h成熟培養(yǎng)后，將用0.1％透明質(zhì)酸酶除去卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞放在體視鏡顯微鏡下挑選已排出第一極體、細(xì)胞質(zhì)均勻的個(gè)體采用電激活處理，即用100v/mm、80usec、3次脈沖對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行電激活后放入pzm-3中培養(yǎng)，分別于第7天統(tǒng)計(jì)分裂率和囊胚發(fā)育率。
表4本發(fā)明的培養(yǎng)液對(duì)豬卵母細(xì)胞分裂率和囊胚發(fā)育率的影響
由表4可知，本發(fā)明的提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率的培養(yǎng)液對(duì)卵母細(xì)胞分裂率和囊胚發(fā)育率與對(duì)照組相當(dāng)，沒有明顯區(qū)別。
前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。