本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的說是涉及一種重組菌株及其應(yīng)用和制備9-氟甾體激素前體的方法。
背景技術(shù)：
：甾體激素藥物作為抗生素之后的第二大類藥物廣泛用于治療和預(yù)防許多疾病，例如消炎，利尿，避孕，促孕，抗雄激素和抗癌劑等。甾藥的高需求促生了另一重要產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展—甾藥中間體(甾藥前體)的提取與制備。微生物法制備甾藥前體的工藝因其環(huán)境污染小，反應(yīng)步驟少、產(chǎn)品損失低、收率高等突出優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。近年來，通過微生物的生物轉(zhuǎn)化對(duì)甾體化合物進(jìn)行脫氫、氧化、羥化及側(cè)鏈切割等反應(yīng)而獲得多種藥物中間體。例如，9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式ⅳ)是生產(chǎn)9-氟甾體激素(如地塞米松，倍他米松，曲安西龍等)的關(guān)鍵前體，以9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式ⅰ)為底物合成ⅳ是工業(yè)化生產(chǎn)ⅳ的重要方法。但是關(guān)于9(11)-環(huán)氧甾體生物轉(zhuǎn)化的研究還未見報(bào)道，反應(yīng)機(jī)制也沒有完全闡明。目前，對(duì)于甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化大多都基于基因工程改造的微生物或分離純化的酶催化。這些方法可以使甾體化合物的轉(zhuǎn)化率有一定的提高，但甾體底物溶解度差、微生物發(fā)酵過程染菌以及分離純化酶的高成本都是制約其工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組菌株，使得所述重組分支桿菌能夠顯著提高9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮的轉(zhuǎn)化率；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述重組菌株在生產(chǎn)9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的應(yīng)用；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供基于所述重組菌株生產(chǎn)9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種重組菌株，在分枝桿菌或大腸桿菌中轉(zhuǎn)化有包含kstd、kstd3、kstdm中一種或兩種以上基因的質(zhì)粒；或在分枝桿菌或大腸桿菌基因組上整合有kstd、kstd3、kstdm中一種或兩種以上基因。針對(duì)現(xiàn)有甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化工藝中缺少以9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式ⅰ，以下簡(jiǎn)稱ⅰ)為底物合成9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式ⅳ，以下簡(jiǎn)稱ⅳ)的方法，本發(fā)明通過在分枝桿菌或大腸桿菌中轉(zhuǎn)化表達(dá)kstd、kstd3和kstdm基因的質(zhì)粒，以重組菌株的細(xì)胞裂解液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，最終獲得具有較高轉(zhuǎn)化率的甾藥前體ⅳ。作為優(yōu)選，所述kstd、kstd3、kstdm均來源于新金分枝桿菌mycobacteriumneoaurum。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，所述kstd、kstd3均來源于新金分枝桿菌mycobacteriumneoaurumatcc25795(kstdgenbankid：gq476982，kstd3genbankid：kf772210)，序列分別如seqidno:1和seqidno:2所示。所述kstdm來源于新金分枝桿菌mycobacteriumneoaurumnwib-01(kstdmgenbankid：gq228843)，序列如seqidno:3所示。本發(fā)明中所轉(zhuǎn)化的質(zhì)?？墒褂帽绢I(lǐng)域各種常用質(zhì)粒，在具體實(shí)施過程中，本發(fā)明所述質(zhì)粒采用商用pmv261質(zhì)粒，購于biosci公司。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，所述分枝桿菌為保藏編號(hào)為cgmccno.13532的分枝桿菌，分類命名為mycobacteriumsp.，于2017年1月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。所述大腸桿菌為大腸桿菌bl21(de)，可購買或根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)構(gòu)建方法構(gòu)建獲得。采用本發(fā)明所述重組菌株的細(xì)胞裂解液對(duì)底物ⅰ進(jìn)行轉(zhuǎn)化，重組分枝桿菌可獲得至少60％轉(zhuǎn)化率的ⅳ，在對(duì)反應(yīng)體系的緩沖液ph值優(yōu)化后，ⅳ的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到90％以上。重組大腸桿菌可獲得至少45％轉(zhuǎn)化率的ⅳ，在最高可達(dá)到80％左右。基于上述優(yōu)異的技術(shù)效果，本發(fā)明提出了所述重組菌株或/和其細(xì)胞裂解液在制備以9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯為底物合成9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的應(yīng)用。與此同時(shí)，基于所述重組菌株在生物轉(zhuǎn)化方面的優(yōu)異表現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種制備9-氟甾體激素前體(即ⅳ)的方法，包括：步驟1、制備所述重組菌株的細(xì)胞裂解液；步驟2、向步驟1中的細(xì)胞裂解液加入底物9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯進(jìn)行反應(yīng)，獲得β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。其中，作為優(yōu)選，步驟1包括：步驟1.1、將所述重組菌株進(jìn)行擴(kuò)繁，然后加入氫化可的松誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體用緩沖液(如pbs)洗滌并重懸；步驟1.2、將重懸后的菌體細(xì)胞超聲破碎，獲得所述重組菌株的細(xì)胞裂解液。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，步驟1.1為：將所述重組菌株接種于5ml液體培養(yǎng)基(甘油10g/l、酵母提取物10g/l、磷酸氫二銨1.5g/l、磷酸氫二鉀0.5g/l、磷酸二氫鉀0.5g/l、吐溫802.5g/l、無水硫酸鎂10g/l、硫酸亞鐵0.5g/l、硫酸鋅0.2g/l，ph7.2-7.3；固體培養(yǎng)基添加15g/l瓊脂粉)中30℃過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移至50ml新鮮液體培養(yǎng)基中，在30℃、200r/min培養(yǎng)至od600為0.5-0.6，然后添加終濃度為0.1g/l的氫化可的松在30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，收集菌體pbs緩沖液洗滌并重懸至od600為2.0。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，所述緩沖液的ph值為6、6.5、7、7.5或8，所述pbs緩沖液可采用kh2po4/k2hpo4體系的pbs緩沖液，通過調(diào)整兩者的比例來控制緩沖液的ph值。在對(duì)ph值的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，緩沖液ph值對(duì)轉(zhuǎn)化率有明顯的影響，其中以ph值為7.5時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，步驟1.2為：將重懸后的菌體細(xì)胞在500w功率下超聲破碎，以每破碎5s間歇5s的方式進(jìn)行，共20min，全程冰上操作，獲得所述重組菌株的細(xì)胞裂解液。作為優(yōu)選，步驟2為：向步驟1中的細(xì)胞裂解液加入底物9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯、pms(吩嗪硫酸甲酯)和助溶劑(如乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、tween80或tween20)在搖床上進(jìn)行反應(yīng)，獲得β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，步驟2為：向步驟1中的細(xì)胞裂解液加入終濃度為1g/l的底物9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，2.5mm的pms和7％的乙醇，在30℃、200r/min搖床上進(jìn)行反應(yīng)，獲得β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。此外，本發(fā)明還通過試驗(yàn)首次確定了由底物ⅰ轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物ⅳ的反應(yīng)機(jī)理(本申請(qǐng)相關(guān)內(nèi)容非公知常識(shí)和現(xiàn)有技術(shù))，在確認(rèn)正確的反應(yīng)機(jī)理前，對(duì)于由底物ⅰ轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物ⅳ，本發(fā)明推測(cè)可能存在以下兩種反應(yīng)途徑：經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，在生物轉(zhuǎn)化時(shí)底物ⅰ先轉(zhuǎn)化為ii，然后轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物ⅳ。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過引入外源基因kstd、kstd3和kstdm，構(gòu)建重組分枝桿菌或大腸桿菌，并使用重組菌株細(xì)胞裂解液生產(chǎn)甾藥前體，所獲得的9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮具有極高轉(zhuǎn)化率，同時(shí)闡明了生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)機(jī)理，為將來的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。生物材料保藏信息說明ms136，分類命名為分枝桿菌mycobacteriumsp.，于2017年1月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno.13532。附圖說明圖1所示為重組質(zhì)粒pmv261-kstd的構(gòu)建示意圖；圖2所示為kstd、kstd3和kstdm的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果；其中，泳道1-3依次對(duì)應(yīng)kstd、kstd3和kstdm；圖3所示為分枝桿菌出發(fā)菌和重組菌的轉(zhuǎn)化率比較圖；圖4所示為大腸桿菌重組菌的轉(zhuǎn)化率比較圖；圖5所示為ph值對(duì)產(chǎn)物ⅳ轉(zhuǎn)化率的影響；圖6所示為分枝桿菌出發(fā)菌細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化ⅳ的產(chǎn)物生成曲線；圖7所示為分枝桿菌出發(fā)菌株細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化ⅰ的產(chǎn)物生成曲線；圖8所示為磷酸鹽緩沖液轉(zhuǎn)化ⅰ的產(chǎn)物生成曲線；圖9所示為分枝桿菌細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化ⅰ和ⅱ的產(chǎn)物生成曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種重組菌株及其應(yīng)用和制備9-氟甾體激素前體的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述菌株、方法和應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的菌株、方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1：重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、kstd、kstd3、kstdm基因的合成將三個(gè)基因通過genewiz公司合成，以商品化質(zhì)粒puc57作為承載載體，分別命名為puc57-kstd，puc57-kstd3，puc57-kstdm。2、重組質(zhì)粒pmv261-kstd、pmv261-kstd3和pmv261-kstdm的構(gòu)建如圖1所示，以pmv261-kstd的構(gòu)建為例，以合成的質(zhì)粒puc57-kstd為模板，按照表1的引物擴(kuò)增各目的基因片段并純化回收。所得pcr產(chǎn)物kstd基因片段分別與線性化的pmv261載體(hindiii和bamhi限制性酶切)通過gibsonassembly無縫連接法組裝在一起，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pmv261-kstd，使基因片段置于hsp60啟動(dòng)子的控制下。重組質(zhì)粒pmv261-kstd3和pmv261-kstdm的構(gòu)建方法相同。表1pcr引物表primerssequences(5’-3’)kstd-fcccgatccggaggaatcacggatccatgaccaccgaaaccgctggkstd-raactacgtcgacatcgataagcttttaagacggctgagcagattckstd3-fcccgatccggaggaatcacggatccatgtctgactctgacctggaattckstd3-rtaactacgtcgacatcgataagcttttattcagcagaagactgggtagckstdm-fcccgatccggaggaatcacggatccatgttctacatgaccgctcaggkstdm-rtaactacgtcgacatcgataagcttttaagctttaccagccaggtgcpmv261-fcagcgaggacaacttgagccgtpmv261-racatcagagattttgagacaca3、重組質(zhì)粒的驗(yàn)證kstd、kstd3和kstdm的基因長(zhǎng)度分別為1200bp、1560bp和1713bp，以合成的質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增pcr，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，在2000bp以下可見三條明顯的特異性條帶(圖2)，與目的片段的大小位置相符。將目的基因連接到載體pmv261上，轉(zhuǎn)入e.colidh5α中，提取重組質(zhì)粒pmv261-kstd、pmv261-kstd3和pmv261-kstdm，采用質(zhì)粒測(cè)序引物pmv261-f和pmv261-r進(jìn)行pcr驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明各重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。實(shí)施例2：重組菌株的構(gòu)建1、重組分枝桿菌的構(gòu)建將菌體用無菌水洗2次，5000r/min離心，最終重懸于無菌水中。利用電轉(zhuǎn)化法分別將重組質(zhì)粒pmv261-kstd，pmv261-kstd3和pmv261-kstdm導(dǎo)入保藏編號(hào)為cgmccno.13532的宿主菌株mycobacteriumsp.ms136，電轉(zhuǎn)化條件：電壓1.8kv，電擊杯孔徑1mm，電擊兩次；確認(rèn)電擊頻率(4-5ms)-1范圍，電擊處理后的感受態(tài)于冰上放置5min，利用終濃度為50μg/ml卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，獲得三種重組分枝桿菌ms136-kstd，ms136-kstd3，ms136-kstdm。2、重組大腸桿菌的構(gòu)建方法與1相同，宿主菌株更換為大腸桿菌bl21(de3)，獲得三種重組大腸桿菌bl21(de3)-kstd，bl21(de3)-kstd3，bl21(de3)-kstdm。實(shí)施例3：制備重組菌株的細(xì)胞裂解液將實(shí)施例2中的各重組菌株分別接種于5ml液體培養(yǎng)基(甘油10g/l、酵母提取物10g/l、磷酸氫二銨1.5g/l、磷酸氫二鉀0.5g/l、磷酸二氫鉀0.5g/l、吐溫802.5g/l、無水硫酸鎂10g/l、硫酸亞鐵0.5g/l、硫酸鋅0.2g/l，ph7.2-7.3；固體培養(yǎng)基添加15g/l瓊脂粉)中30℃過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移至50ml新鮮液體培養(yǎng)基中，在30℃、200r/min培養(yǎng)至od600為0.5-0.6，然后添加終濃度為0.1g/l的氫化可的松在30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，收集菌體用ph為6-8的pbs緩沖液(kh2po4/k2hpo4)洗滌并重懸至od600為2.0。將重懸后的菌體細(xì)胞在500w功率下超聲破碎，以每破碎5s間歇5s的方式進(jìn)行，共20min，全程冰上操作，如果破碎后的細(xì)胞出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，應(yīng)重復(fù)超聲操作，獲得所述重組菌株的細(xì)胞裂解液。實(shí)施例4：重組菌株細(xì)胞裂解液的生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)1、反應(yīng)過程向?qū)嵤├?中的各細(xì)胞裂解液中加入終濃度為1g/l的底物9β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，2.5mm的pms和7％的乙醇，在30℃、200r/min搖床上進(jìn)行反應(yīng)，獲得β,11β-環(huán)氧-17α,21-二羥基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。2、底物i、過渡產(chǎn)物ⅱ/ⅲ和產(chǎn)物ⅳ的檢測(cè)反應(yīng)液混勻后，迅速吸取適量，用稀釋劑(乙腈∶水＝5∶5)稀釋10倍后經(jīng)0.25μm濾膜過濾，取濾液上紫外液相檢測(cè)。色譜條件：色譜柱：bdshypersilc18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；檢測(cè)器：waters2489uv/vis；泵：waterse2695；流動(dòng)相：乙腈∶水＝3∶7；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm；流速1.2ml/min。定量方法：使用相同的色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)反應(yīng)液中目標(biāo)物質(zhì)定量。用生成產(chǎn)物的摩爾數(shù)除以底物的摩爾數(shù)即可得生成物的轉(zhuǎn)化率。3、結(jié)果對(duì)分枝桿菌重組菌株ms136-kstd，ms136-kstd3，ms136-kstdm細(xì)胞裂解液的轉(zhuǎn)化特性進(jìn)行研究，考察其對(duì)ⅰ的轉(zhuǎn)化效率，用hplc法檢測(cè)產(chǎn)物ⅳ的生成情況，同時(shí)以導(dǎo)入pmv261空白載體的出發(fā)菌株(即ms136)細(xì)胞裂解液作對(duì)照。如圖3所示，1g/l底物ⅰ在ph7.0(pbsph值)的分枝桿菌細(xì)胞裂解液中反應(yīng)45h后，重組菌株ms136-kstd，ms136-kstd3和ms136-kstdmⅳ的轉(zhuǎn)化率分別為60.6％，69.5％和78.4％，出發(fā)菌株ⅳ的轉(zhuǎn)化率為56.8％，最多提高了38.9％。以上數(shù)據(jù)表明過表達(dá)kstd基因(特別是kstdm)后，可實(shí)現(xiàn)ⅳ大量積累，顯著提高其轉(zhuǎn)化率。對(duì)大腸桿菌重組菌株bl21(de3)-kstd，bl21(de3)-kstd3，bl21(de3)-kstdm細(xì)胞裂解液的轉(zhuǎn)化特性進(jìn)行研究，考察其對(duì)ⅰ的轉(zhuǎn)化效率，用hplc法檢測(cè)產(chǎn)物ⅳ的生成情況。如圖4所示，1g/l底物ⅰ在ph7.5(pbsph值)的大腸桿菌細(xì)胞裂解液中反應(yīng)45h后，重組菌株bl21(de3)-kstd，bl21(de3)-kstd3，bl21(de3)-kstdmⅳ的轉(zhuǎn)化率分別為48.7％，71.6％和79.5％。大腸桿菌bl21(de3)本身并不能將底物ⅰ轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物ⅳ，而本發(fā)明重組大腸桿菌能夠?qū)崿F(xiàn)生物轉(zhuǎn)化并具有較高的轉(zhuǎn)化率。實(shí)施例5：重組菌株細(xì)胞裂解液的ph值的影響在制備重組菌株細(xì)胞裂解液時(shí)所采用的緩沖液的ph不同會(huì)影響底物ⅰ的轉(zhuǎn)化。本實(shí)施例對(duì)比了重組菌株ms136-kstdm細(xì)胞裂解液ph值分別為6，6.5，7，7.5，8時(shí)ⅳ的轉(zhuǎn)化率，反應(yīng)條件為底物投料量1g/l反應(yīng)45h(參照實(shí)施例4)。由圖5可知，ph7.5最佳，此時(shí)ⅳ的轉(zhuǎn)化率達(dá)到92.8％。實(shí)施例6：底物ⅰ轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物ⅳ的機(jī)理研究1、比較全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法與細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化法(1)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法：將mycobacteriumsp.ms136(未經(jīng)重組)細(xì)胞接種于5ml液體培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接到另一裝有50ml液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，30℃、200r/min培養(yǎng)5h(od600達(dá)到0.5-0.6)，添加終濃度為0.1g/l的誘導(dǎo)劑氫化可的松，30℃200r/min培養(yǎng)24h。10000rpm離心5min收集菌體，用ph7.0的0.2m磷酸鹽緩沖液(pbs)洗滌兩次后重懸菌體至od600達(dá)到2.0。取50ml細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶中，加入1g/lⅰ、2.5mmpms和7％乙醇，30℃、200r/min反應(yīng)。(2)細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化法：參照實(shí)施例3和4方法，區(qū)別在于使用未經(jīng)重組的出發(fā)菌株mycobacteriumsp.ms136。(3)結(jié)果表2中，利用分枝桿菌ms136全細(xì)胞轉(zhuǎn)化1g/l底物ⅰ反應(yīng)45h，底物ⅰ只殘余5％的量，對(duì)產(chǎn)物ⅱ的轉(zhuǎn)化率為60.3％，反應(yīng)體系中檢測(cè)不到產(chǎn)物ⅳ的積累；表明分枝桿菌ms136菌株有可能將底物ⅰ水解后進(jìn)一步代謝，導(dǎo)致產(chǎn)物ⅳ無法積累。而細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化1g/l底物ⅰ反應(yīng)45h，底物ⅰ殘余量為20％，反應(yīng)體系中產(chǎn)物ⅳ轉(zhuǎn)化率為56.8％。由圖6可知，1g/l底物ⅳ在細(xì)胞裂解液中反應(yīng)45h后，ⅳ剩余0.94g/l，說明以ⅳ為底物時(shí)，細(xì)胞裂解液不能將其進(jìn)一步降解。表2全細(xì)胞與細(xì)胞裂解液以ⅰ為底物的轉(zhuǎn)化情況轉(zhuǎn)化45h全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化法ⅰ(g/l)0.0520.204ⅱ(g/l)0.5190.054ⅲ(g/l)ntntⅳ(g/l)nt0.4852、研究分枝桿菌細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化底物ⅰ的反應(yīng)機(jī)制(1)1g/l底物ⅰ在ph7.0的分枝桿菌細(xì)胞裂解液中反應(yīng)，分別在2h，5h，10h，21h，33h、45h和76h取樣，檢測(cè)產(chǎn)物的生成情況。如圖7所示，產(chǎn)物ⅳ隨時(shí)間不斷增加，45hⅳ的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值56.8％，而ⅱ的轉(zhuǎn)化率始終較低。在產(chǎn)物中始終未檢測(cè)到ⅲ，說明分枝桿菌細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化ⅰ的反應(yīng)順序是ⅰ、ⅱ、ⅳ。(2)1g/l底物ⅰ在ph7.0的pbs中反應(yīng)，只有產(chǎn)物ⅱ的生成，45h后，ⅱ的轉(zhuǎn)化率為6.7％(如圖8)。說明ⅰ轉(zhuǎn)化為ⅱ(c-21脫乙?；磻?yīng))是自發(fā)進(jìn)行的，而ⅱ轉(zhuǎn)化為ⅳ(c1,2脫氫反應(yīng))是需要分枝桿菌或本發(fā)明分枝桿菌重組菌的催化作用。(3)分枝桿菌細(xì)胞裂解液分別以ⅰ和ⅱ為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，如圖9所示，45hⅳ的轉(zhuǎn)化率幾乎相同(分別是56.8％和57.3％)。以上數(shù)據(jù)說明在分枝桿菌細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)化ⅰ的反應(yīng)中：1)反應(yīng)順序?yàn)棰∽园l(fā)水解形成ⅱ，ⅱ經(jīng)催化為ⅳ；2)從ⅱ到ⅳ的c1,2催化反應(yīng)是關(guān)鍵步驟。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>天津大學(xué)<120>一種重組菌株及其應(yīng)用和制備9-氟甾體激素前體的方法<130>mp1708696<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1200<212>dna<213>人工序列<400>1catatgatgaccaccgaaaccgctggtatccgtgaaatcgacaccggtgacctgccggac60cgttacgctcgtggttggcactgcctgggtccggttaaagactacctggacggtaaacca120cacggtgttgaaatcttcgacactatgctggttgtgttcgcagactctgaaggtgaactg180aaagttctggacggttactgccgtcacatgggtggtaacctggctcagggtaccatcaaa240ggtgacaccgttgcttgcccgttccacgactggcgttggggtggtgacggtaaatgcaaa300ctggttccgtacgctaaacgtaccccgcgtctggctcgtacccgtgcttggcacaccgac360gttcgtggtggtctgctgttcgtttggcacgaccacgaaggtaacccgccgcagccggaa420gttcgtatcccggaaatcccggaattcgcttctgacgactggaccgactggcgttggaac480accatgctgatcgaaggttctaactgccgtgaaatcatcgacaacgttaccgacatggct540cacttcttctacatccactacggtctgccgacctacttcaaaaacgttttcgaaggtcac600atcgcttctcagtacctgcacaacgttggtcgtccggacgttaacgacctgggtaccacc660tacggtgaagctcacctggactctgaagctagttacttcggtccgtctttcatgatcaac720tggctgcacaacaactacggtggtttcaaagctgaatctatcctgatcaaccgtcactac780ccggtttcgcaggacagcttcgttctgcagtggggtgttatcgttgaaaaaccgaaaggt840ctggacgaaaaaaccaccgacaaactggctcgtgttttcacagagggtgtaagcaaaggt900ttcctgcaggacgttgaaatctggaaacacaaaacccgtatcgacaaaccgctgctggtt960gaagaagacggtgctgtttaccagatgcgtcgttggtaccagcagttctacgttgacgtt1020gctgacgttaccccggacaccaccgaccgtttcgaaatggaagttgacaccaccatcgct1080aacgaaaaatggcacgttgaagttgaagaaaacctgaaactgcagcaggacgctgctgaa1140caggacgctgctgaacagggtgaaccgcagaaagaatctgctcagccgtcttaaggatcc1200<210>2<211>1560<212>dna<213>人工序列<400>2catatgatgtctgactctgacctggaattcgacgttatcgttgctggttctggtggtggt60ctggctggtgcttacaccgctgctcgtgaaaacctgtctgttctgctggttgaagctacc120gacctgttcggcggcaccaccagcttctctggtggtggcggtatgtggttcccgtgcaac180ccggttctgcagcgtgctggtaccgacgacaccatcgacaaagctctgacctacttccac240gctgttgttggtgaacgtaccccgcgtgaactgcaggacgcttacgttcgtggtggtgct300aaactgatcgaatacctggaacaggacccggctttcgaattcaccgctctgccgtggccg360gactactacggtaccgctccggaagctcgtaccgacggttaccgtcacaccatcccgctg420ccggttccggacgctgctctgggtaaatacgctggtctggttcgtggtccgctggacacc480gaacgtctgggtgctgaagctccggacctgctggttggtggtcgtgctctggttggtcgt540ttcctggctgctctggacaaactgccgaccgttacctgctggctgaacgctccgctggtt600gacctgatcaccgaaaacggtcgtgttgttggtgctgttatcgaacgtgacggtgctccg660gttcgtgttaccacccgtcgtggtgttctgctggcttctggtggtttcgaacagaacgct720gaaatgcgtgctgaatacggtgttccgggtcacgctaccgactctatgggtggtccgggt780tctaccggtcgtgctcaccgtgctgctatcgctgttggtgctgacgttgacctgatggac840caggcttggtggtctccgggtatgacccacccggacggtcgttctgctttcgctctgtgg900ttcaccggtggtatcttcgttaaccagcagggtcgtcgtttcgttaacgaatctgctccg960tacgaccgtatcggtcgtgacatcatcgaccagatgcagaacggttctacccgtctgccg1020ttctggatgatctacgacaaccgtgacggtgacatcccgccggttaaagctaccaacgtt1080tctatggttgaaccggaaaaataccgtaccgctggtctgtggcactctgctgacaccctg1140gctgaactggctggtgctatcggtgttccggctgctgaactggaagctaccgttgctcgt1200tacaacgaactggctgctaccggtatcgacgacgacttcggtcgtggtggtgaagcgtat1260gaccgtgcgttctctggtggtgagtctccgatggttccgctggacaccccgccgtaccac1320gctgctgttttcggtctgtctgacctgggtaccaaaggtggtctgcgtaccgacacccac1380gctcgtgttctggacgctgacggtgctgctatcccgggtctgtacgctgctggtaacacc1440atggctgctgtttctggtaccacctacccgggtggtggtaacccgatcggtgcttctatg1500ctgttctctcacctggctgctctggacatggctacccagtcttctgctgaataaggatcc1560<210>3<211>1713<212>dna<213>人工序列<400>3catatgatgttctacatgaccgctcaggactactctgttttcgacgttgttgttgttggt60tctggtgctgctggtatggttgctgctctgaccgctgctcaccagggtctgtctaccgtt120gttgttgaaaaagctccgcactacggtggttctaccgctcgttctggtggtggtgtttgg180ataccgaacaacgaagttctgcagcgtgacggtgttaaagacaccccggctgaagctcgt240aaatacctgcacgctatcatcggtgacgttgttccggctgaaaaaatcgacacctacctg300gaccgttctccggaaatgctgtctttcgttctgaaaaactctccgctgaaactgtgctgg360gttccgggttactctgactactacccggaaaccccgggtggtaaagctaccggtcgttct420gttgaaccgaaaccgttcaacgctaaaaaactgggtccggacgaaaaaggtctggaaccg480ccgtacggtaaagttccgctgaacatggttgttctgcagcaggactacgttcgtctgaac540cagctgaaacgtcacccgcgtggtgttctgcgttctatcaaagctggtgttcgttctgtt600tgggctaacgctaccggtaaaaacctggttggtatgggtcgtgctctgatcgctccgctg660cgtatcggtctgcagaaagctggtgttccggttctgctgaacaccgctctgaccgacctg720tacctggaagacggtgttgttcgtggtatctacgttcgtgaagctggtgctccggaatct780gctgaaccgaaactgatccgtgctcgtaaaggtgttatcctgggttctggtggtttcgaa840cacaaccaggaaatgcgtaccaaataccagcgtcagccgatcaccaccgaatggaccgtt900ggtgctgttgctaacaccggtgacggtatcgttgctgctgaaaaactgggtgctgctctg960gaactgatggaagacgcttggtggggtccgaccgttccgctggttggtgctccgtggttc1020gctctgtctgaacgtaactctccgggttctatcatcgttaacatgaacggtaaacgtttc1080atgaacgaatctatgccgtacgttgaagcgtgccaccacatgtacggtggtcagtacggt1140cagggtgctggtccgggtgaaaacgttccggcttggatggttttcgaccagcagtaccgt1200gaccgttacatcttcgctggtctgcagccgggtcagcgtatcccgaaaaaatggatggaa1260tctggtgttatcgttaaagctgactctgttgctgaactggctgaaaaaaccggtctggct1320ccggacgctctgaccgctaccatcgaacgtttcaacggtttcgctcgttctggtgttgac1380gaagacttccaccgtggtgaatctgcttacgaccgttactacggtgacccgaccaacaaa1440ccgaacccgaacctgggtgaaatcaaaaacggtccgttctacgctgctaaaatggttccg1500ggtgacctgggtaccaaaggtggtatccgtaccgacgttcacggtcgtgctctgcgtgac1560gacaactctgttatcgaaggtctgtacgctgctggtaacgtttcttctccggttatgggt1620cacacctacccgggtccgggtggtaccatcggtccggctatgaccttcggttacctggct1680gctctgcacctggctggtaaagcttaaggatcc1713當(dāng)前第1頁12