本發(fā)明涉及細(xì)胞因子的用途技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及重組的人源TNFα在制備藥物中的用途。

背景技術(shù)：

器官移植是治療器官功能衰竭的一種有效治療方案，但是人類器官供體的缺少是其主要限制。由于病理學(xué)、解剖學(xué)、經(jīng)濟學(xué)和倫理學(xué)方面的因素，豬被認(rèn)為是解決器官缺乏的一個最適宜的供體來源。但是，免疫排斥反應(yīng)是異種移植的主要障礙。促炎細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要的作用，所以我們推測一些促炎細(xì)胞因子在異種移植中有重要的病理學(xué)作用。然而，這些細(xì)胞因子在異種移植中的作用仍然不清楚。

在炎癥反應(yīng)、凝血反應(yīng)和細(xì)胞存活或者死亡中，內(nèi)皮細(xì)胞具有重要調(diào)節(jié)作用。內(nèi)皮細(xì)胞功能性紊亂與多種疾病有關(guān)，例如，腫瘤轉(zhuǎn)移、動脈硬化和持久的慢性炎癥。由于內(nèi)皮細(xì)胞是被免疫細(xì)胞最先識別的，所以它們是最重要的一道防御線。在異種移植中，它們在炎癥反應(yīng)和凝血反應(yīng)中具有重要作用的細(xì)胞。同時它們在同種和異種移植損傷中具有關(guān)鍵性的作用，作為異種移植研究領(lǐng)域中的相關(guān)研究的主要靶細(xì)胞。

在異種移植的反應(yīng)過程中，會產(chǎn)生許多促炎細(xì)胞因子。在豬-人的器官移植過程中，人源細(xì)胞因子是否能夠刺激來自豬供體的細(xì)胞或者器官是一個需要弄清楚的問題。在各種異種移植的模型中，包括豬－狒狒的模型中，其他一些重要的細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素(IL-17)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的表達量也有所增加。這些細(xì)胞因子的生物學(xué)功能和它們的促炎反應(yīng)在各種生理學(xué)中作用也都已經(jīng)報到了?？墒沁@些促炎細(xì)胞因子在異種移植中的效果仍然不清楚。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了弄清上述促炎細(xì)胞因子在異種移植中的效果，我們用這些細(xì)胞因子去刺激豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)。我們檢測了一些信號通路的激活情況和下游基因的表達，例如粘附分子(內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(E-selectin)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1))，趨化因子(白細(xì)胞介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1))，促炎因子(IL-6)和促凝血反應(yīng)有關(guān)的基因(組織因子)。并且對豬白細(xì)胞抗原I(SLA-I)和豬白細(xì)胞抗原II(SLA-II DR)也進行檢測。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα以不同的通路激活豬內(nèi)皮細(xì)胞。在豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，人源的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα與來源于豬的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα作用效果一致。人源的細(xì)胞因子rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα可以誘導(dǎo)粘附分子(E-selectin、VCAM-1和ICAM-1)、趨化因子(IL-8和MCP-1)、促炎因子(IL-6)和促凝血反應(yīng)有關(guān)的基因(組織因子)的表達，而人源的細(xì)胞因子rhIL-6可以增加趨化因子MCP-1和促凝血因子(組織因子)的表達。人源的細(xì)胞因子rhIL-1β和rhTNFα可以上調(diào)表達豬白細(xì)胞抗原I(SLA-I)而人源的細(xì)胞因子rhIL-17或rhIL-6都不能。雖然人源的細(xì)胞因子rhIL-17不能使E-selectin、VCAM-1、ICAM-1、IL-8、MCP-1、IL-6和組織因子的表達量增加很多，但是它與人源的細(xì)胞因子rhTNFα的協(xié)同作用下，顯著增加E-selectin、IL-6和IL-8的表達量。另外，在豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，托珠單抗(tocilizumab)不能阻止由人源的IL-6激活的STAT3信號通路。發(fā)明人認(rèn)為人源的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα在異種移植中具有重要的病理學(xué)作用，能夠成為潛在的治療靶點。并且人源的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα可以作為激活相關(guān)信號通路、誘導(dǎo)或上調(diào)相關(guān)基因表達的活性分子。進而，這些人源的細(xì)胞因子可以作為制備相關(guān)藥物的活性成分。相關(guān)藥物可以是包括人源的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β或TNFα作為活性成分，以及任選地藥物載體——例如水等溶劑的藥物組合物。

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種重組的人源TNFα在制備藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種重組的人源TNFα在制備激活豬內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB和MAPKs信號通路的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種重組的人源TNFα在制備上調(diào)豬內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子表達的藥物中的用途。

進一步地，上述粘附分子包括內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(E-selectin)、VCAM-1和ICAM-1。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種重組的人源TNFα在制備上調(diào)豬內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6表達的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種重組的人源TNFα在制備誘導(dǎo)豬內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子表達的藥物中的用途。

進一步地，上述趨化因子是IL-8。

進一步地，上述趨化因子是單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供一種重組的人源TNFα在制備上調(diào)豬內(nèi)皮細(xì)胞中組織因子表達的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供一種重組的人源TNFα在制備誘導(dǎo)豬內(nèi)皮細(xì)胞中SLA-I表達的藥物中的用途。

進一步地，上述豬內(nèi)皮細(xì)胞是豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)重組的人源TNFα能夠激活豬內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB和MAPKs信號通路、上調(diào)豬內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子、IL-6和組織因子表達以及誘導(dǎo)豬內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子和SLA-I表達，因此重組的人源TNFα可以作為實現(xiàn)這些功能的藥物的活性成分。

附圖說明

圖1顯示在PAEC中，IL-17、IL-1β和TNFα激活NF-κB和MAPK，而IL-6激活STAT3。(A)將PAEC暴露于rpIL-6(20ng/ml)或rhIL-6(20ng/ml)(指定的時間)，并將HUVEC暴露于rhIL-6(20ng/ml)(指定的時間)。裂解物通過針對p-STAT3、STAT3、p-AKT和肌動蛋白的抗體進行免疫印跡分析。p-STAT3和p-AKT的定量分析顯示在右側(cè)。(B)將PAEC暴露于rpIFNγ(40ng/ml)或rhIFNγ(40ng/ml)，將HUVEC暴露于rhIFNγ(40ng/ml)。裂解物通過針對p-STAT1、STAT1和肌動蛋白的抗體進行免疫印跡分析。p-STAT1的定量分析顯示在右側(cè)。(C-E)將PAEC暴露于rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)(C)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)，rpTNFα(100ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)(E)，HUVEC暴露于rhIL-17(100ng/ml)(C)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)或rhTNFα(20ng/ml)(E)。通過用所示抗體免疫印跡分析裂解物。p-P65、p-IκBα、p-P38和p-JNK的定量分析顯示在右側(cè)。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖2顯示在PAEC中，IL-17、IL-1β和TNFα增加粘附分子和促炎細(xì)胞因子IL-6的表達。PAEC不作處理或者使用rpIL-6(20ng/ml)或rhIL-6(20ng/ml)(A)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)(B)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)(C)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)(E)處理2、6或12小時。通過實時PCR檢測E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖3顯示在HUVEC中粘附分子(E-selectin、VCAM-1和ICAM-1)和IL-6被人IL-6、IFNγ、IL-1β和TNFα誘導(dǎo)。HUVEC不作處理或者使用rhIL-6(20ng/ml)(A)，rhIFNγ(40ng/ml)(B)，rhIL-17(100ng/ml)(C)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)或rhTNFα(20ng/ml)(E)處理2、6或12小時。通過RT-PCR分析E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖4顯示在PAEC中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα誘導(dǎo)IL-8和MCP-1的表達。(A-B)PAEC不作處理或者使用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過實時PCR檢測IL-8(A)或MCP-1(B)的mRNA水平。(C-D)PAEC不作處理或者使用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理24小時，其中直方柱從左到右依次對應(yīng)右側(cè)的分子。通過ELISA測量上清液中豬IL-8(C)或MCP-1(D)的蛋白水平。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖5顯示在HUVEC中，人IL-6、IFNγ、IL-17、IL-1β和TNFα調(diào)節(jié)IL-8和MCP-1的mRNA水平。(A-B)HUVEC不作處理或者使用rhIL-6(20ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過RT-PCR分析IL-8(A)和MCP-1(B)的mRNA水平。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖6顯示在PAEC中，組織因子的mRNA水平由IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα誘導(dǎo)。PAEC未經(jīng)處理或用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過實時PCR檢測組織因子的mRNA水平。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖7顯示人IL-6、IL-1β和TNFα誘導(dǎo)HUVEC中組織因子的表達。HUVEC未經(jīng)處理或用rhIL-6(20ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過RT-PCR分析組織因子的mRNA水平。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，**p<0.01,***p<0.001。

圖8顯示在用IL-1β和TNFα處理的PAEC中，SLA-1，而不是SLA-II DR增加。(A-B)PAEC未經(jīng)處理或用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理24小時，其中直方柱從左到右依次對應(yīng)右側(cè)的分子。通過流式細(xì)胞儀檢測SLA-I(A)或SLA-II DR(B)的表達。通過幾何平均熒光強度(Gmean)評價SLA-1或SLA-II DR與PAEC結(jié)合的程度。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，***p<0.001。

圖9顯示在PAEC中IL-17和TNFα協(xié)同誘導(dǎo)E-selectin、IL-6和IL-8表達。PAEC用rhIL-17(100ng/ml)，rhTNFα(2ng/ml)或rhIL-17+rhTNFα處理0、2或6小時的PAEC。通過實時PCR檢測E-selectin、VCAM-1、ICAM-1、IL-6、IL-8、MCP-1或組織因子mRNA的誘導(dǎo)。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。其中直方柱從左到右依次對應(yīng)右側(cè)的分子。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖10顯示在PAEC中，托珠單抗不抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3活化。(A-B)PAEC或HUVEC用低濃度(100ng/ml)(A)或高濃度(500ng/ml)(B)托珠單抗預(yù)處理30分鐘或不處理，然后PAEC用rpIL-6(20ng/ml)或rhIL-6(20ng/ml)處理0、15或30分鐘，HUVEC用rhIL-6(20ng/ml)處理0、15或30分鐘。裂解物使用針對p-STAT3和STAT3的抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析。p-STAT3的定量分析顯示在圖像下。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具體實施方式

下面通過具體實驗結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。

1.實驗材料

1.1實驗儀器

37℃CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraus)

超凈工作臺(蘇凈集團安森公司)

細(xì)胞/顆粒計數(shù)儀(BECKMAN COULTER)

熒光顯微鏡(Carl ZEISS)

蛋白電泳儀(BIO-RAD)

流式細(xì)胞儀(BD)

常溫和冷凍離心機(Eppendorf)

純水裝置(Millipore)

超低溫冰箱(Haier)

搖床(Thermo Fisher)

實時定量PCR儀(ABI 7900)

自動沖片機(Danaford ML 400)

真空泵(上海精宏)

1.2原代細(xì)胞和細(xì)胞系

實驗中主要用到兩種細(xì)胞原代豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，其中PAECs由中國野生型五指山小型豬主動脈分離而得。

1.3細(xì)胞因子和抗體

重組人的IL-17、重組人和豬的IL-6、IFNγ、IL-1β及TNFα均購自美國R&D Systems公司。重組豬的IL-17購自美國Kingfisher Biotech Inc公司。pP65、P65、p-IκBα、IκBα、p-JNK、JNK、P38、p-P38、p-STAT1、STAT1、p-STAT3、STAT3和β-Actin抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。FITC-標(biāo)記的SLA class I(SLA-I)和SLA class II DR(SLA-II DR)抗體均購自美國Bio-rad公司。豬的IL-8ELISA試劑盒購自美國Abcam公司(Cambridge,MA,USA)。豬的MCP-1ELISA試劑盒購自RayBiotech Inc(Norcross,GA,USA)。

本發(fā)明中，相關(guān)細(xì)胞因子或蛋白的英文縮寫前面的符號的含義說明如下：r一般是指重組，例如rhIL-17表示重組的人源IL-17；h一般是指人源，例如rhIL-17表示重組的IL-17是人源的；p一般是指豬源，例如rpIL-17表示重組的豬源IL-17。英文縮寫IFN表示干擾素，例如IFNγ表示γ干擾素；TNF表示腫瘤壞死因子，例如TNFα表示腫瘤壞死因子α。

1.4其它試劑

Tocilizumab購自美國Genentech公司。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)、胎牛血清(FBS,Cat.No.0025)、青霉素/鏈霉素溶液(P/S，Cat.No.0503)以及內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(ECGS,Cat.No.1052)均購自美國Sciencell公司。蛋白酶抑制劑Cocktail購自Roche公司。TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺和過硫酸氨均購自Sigma-Aldrich公司。100×青霉素-鏈霉素濃縮液和非必需氨基酸購自Gibco公司。胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司。0.45um硝酸纖維素膜(PVDF)購買自Millipore公司。胰酶Trypsin(EDTA)購自Gibco公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。磷酸緩沖液(phosphate bufferd saline,PBS)購自Hyclone公司。ECL反應(yīng)試劑盒購自Millipore公司。異丙醇、甲醇、三氯甲烷購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)購自Sigma公司。DEPC購自上海生工公司。

2.實驗方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

實驗中培養(yǎng)的細(xì)胞系用含10％胎牛血清、1％P/S和1％ECGS的ECM培養(yǎng)基。溫度37℃及5％二氧化碳飽和濕度。

2.2蛋白免疫印跡

采用冷的PBS(磷酸鹽緩沖液，phosphate-buffered saline)清洗PAECs和HUVECs細(xì)胞后收集細(xì)胞，用含10mM NaF,1mM Na₃VO₄,1mM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30min，采用10％SDS-PAGE凝膠分離蛋白。分離蛋白后進行轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(美國Millipore公司)，然后用含5％脫脂牛奶及0.1％Tween 20的TBST(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.6)溶液室溫下封閉1h。封閉后清洗PDVF膜，加入一抗在4℃孵育過夜，TBST清洗后加入二抗，在室溫下孵育1h，用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑(美國Millipore公司)顯影。采用ImageJ軟件計算總蛋白和actin條帶灰度，磷酸化蛋白的表達水平以相對灰度值表示。

2.3熒光實時定量PCR

采用(美國Invitrogen)試劑提取PAECs和HUVECs的總RNA，用500ngRNA和Transcript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA樣品。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(中國大連Takara公司)。檢測E-selectin,VCAM-1,ICAM-1,IL-6,IL-8,MCP-1及tissue factor的水平。這些基因的表達以均以GAPDH作為內(nèi)參，以2^-ΔΔCt方法計算。在ViiA 7Real-Time PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上進行cDNA的擴增，核苷酸引物的序列如表1所示。PCR條件為：95℃，1min；95℃，10s，60℃，34s 40個循環(huán)；95℃15s,60℃15s,95℃15s。

表1

2.4酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)

分別采用rpIL-6(20ng/ml)、rhIL-6(20ng/ml)、rpIFNγ(40ng/ml)、rhIFNγ(40ng/ml)、rpIL-17(100ng/ml)、rhIL-17(100ng/ml)、rpIL-1β(20ng/ml)、rhIL-1β(20ng/ml)、rpTNFα(20ng/ml)及rhTNFα(20ng/ml)刺激PAEC 24h后，收集細(xì)胞上清液，用pIL-8、pMCP-1ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中豬的IL-8(pIL-8)和MCP-1(pMCP-1)蛋白濃度。

2.5流式細(xì)胞術(shù)

收集PAECs并用PBS清洗一次，取1×10⁶個細(xì)胞用100μl含1％BSA的PBS溶液重懸，用FITC標(biāo)記的SLA-I及SLA-II DR抗體進行染色，同種型匹配(Isotype-matched)抗體作為陰性對照，在4℃避光條件下孵育30min。用PBS清洗一次，用100μl含1％BSA的PBS溶液重懸細(xì)胞后，用BD流式細(xì)胞儀進行檢測，SLA-I、SLA-II與PAECs的結(jié)合程度以幾何平均熒光強度表示。

2.6統(tǒng)計學(xué)分析

展示的數(shù)據(jù)是平均值(Mean)，誤差范圍是標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。不同組間的差異用雙尾Student’s t test進行分析。P值小于0.05的視為統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

3.實驗結(jié)果

3.1.在PAECs中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα激活了不同的信號通路

人源IL-17、IL-1β和TNFα主要激活NF-κB和MAPKs信號通路，人源IL-6和IFNγ則分別激活STAT3和STAT1通路。然而，這些人源的細(xì)胞因子在PAECs中能激活哪些信號通路仍然不清楚。

利用重組的人源和豬源細(xì)胞因子刺激PAECs或HUVECs細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)在PAECs或者HUVECs中，rhIL-6能夠顯著的激活pSTAT3；在PAECs中，rpIFNγ能夠激活pSTAT1，然而rhIFNγ不能激活(圖1A-B)。在PAECs中，rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα上調(diào)了p-P65，pIκBα、p-P38和p-JNK(圖1C-E)。在PAECs中，rhIL-6和rpIL-6激活的p-STAT3水平幾乎一致(圖1A)。rhIL-17激活的p-P65和pIκBα水平比rpIL-17略高(圖1C)；rhIL-1β激活的p-JNK水平略低于rpIL-1β(圖1D)；然而這些差異都沒有顯著性。

這些結(jié)果表明，在PAECs中，人源的IL-17、IL-1β和TNFα能夠顯著的激活NF-κB和MAPKs信號通路，人源的IL-6能夠激活STAT3通路，然而人源的IFNγ并不能激活STAT1信號通路，這個結(jié)論與先前的報道一致。另外，在PAECs中，人源的IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα激活的信號通路水平與豬源的細(xì)胞因子基本一致，表明豬源和人源的IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα具有很高的同源性并且功能保守。

3.2.在PAECs中，IL-17、IL-1β和TNFα上調(diào)了粘附分子和IL-6的表達

接下來在PAECs中，我們想研究粘附分子(內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(E-selectin)、VCAM-1和ICAM-1)及促炎分子IL-6的表達是否受這些細(xì)胞因子的調(diào)控。令人意外的是我們發(fā)現(xiàn)rpIFNγ上調(diào)了VCAM-1和ICAM-1的表達，然而rpIL-6、rhIL-6和rhIFNγ并不能上調(diào)這些基因的表達(圖2A-B)。rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα能夠顯著上調(diào)E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的表達(圖2C-E)。在PAECs中，rhIL-1β或rhTNFα處理兩小時，E-selectin的mRNA水平上調(diào)超過100倍(圖2D-E)。在HUVECs中，rhIL-6提高了ICAM-1和IL-6的表達但沒有上調(diào)E-selectin和VCAM-1(圖3A)。在rhIFNγ處理的HUVECs中，VCAM-1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平明顯上調(diào)，但E-selectin的水平?jīng)]變(圖3B)。在HUVECs中，rhIL-1β和rhTNFα同樣上調(diào)了E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的表達，然而IL-17并沒有上調(diào)任何基因，這個結(jié)果與之前的信號結(jié)果一致(圖3C-E，圖1C)。

3.3.在PAECs中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα誘導(dǎo)了趨化因子的表達

另外，在PAECs中，我們還檢測了這些細(xì)胞因子是否影響趨化因子(IL-8和MCP-1)的表達。rhIL-6上調(diào)了MCP-1的mRNA表達但是沒有上調(diào)IL-8(圖4A-B)。rpIFNγ上調(diào)了MCP-1的表達而且還微弱下調(diào)IL-8的表達，rhIFNγ并沒有調(diào)控MCP-1和IL-8的表達水平(圖4A-B)。在PAECs中，rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα誘導(dǎo)MCP-1的mRNA表達水平大約2-6倍，rhIL-1β和rhTNFα則大大的上調(diào)了IL-8的表達水平(圖4A-B)。

我們利用ELISA的方法檢測上清中的IL-8和MCP-1的蛋白水平，結(jié)果與mRNA水平保持一致(圖4C-D)。在HUVECs中，rhIL-6和rhIFNγ上調(diào)了MCP-1的表達但是下調(diào)了IL-8的表達(圖5A-B)。rhIL-1β和rhTNFα極大的增加了IL-8和MCP-1的mRNA表達水平(圖5A-B)。

3.4.在PAECs中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα上調(diào)了組織因子的表達

凝血失調(diào)是導(dǎo)致異種器官移植失敗的一個重要原因。組織因子通過一系列的分子級聯(lián)反應(yīng)使得凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶進而促進凝血反應(yīng)的發(fā)生。在PAECs中，IL-6、IL-1β和TNFα使組織因子的mRNA表達水平提高了2-3倍，然而IL-17誘導(dǎo)的水平非常低(圖6)。rpIFNγ或者rhIFNγ并不能誘導(dǎo)組織因子的表達(圖6)。在HUVECs中，rhIL-6、rhIL-1β和rhTNFα提高了組織因子的mRNA表達水平，然而rhIL-17和rhIFNγ不能上調(diào)組織因子的表達(圖7)。

3.5.在PAECs中，IL-1β和TNFα誘導(dǎo)了SLA-I的表達

利用人源或者豬源的細(xì)胞因子處理PAECs 24小時，利用流式細(xì)胞術(shù)分析SLA-I和SLA-II的表達水平。人源和鼠源的IL-1β、TNFα以及rpIFNγ提高了SLA-I的表達，然而IL-6、IL-17或rhIFNγ不能誘導(dǎo)SLA-I的表達。然而除了rpIFNγ外，其它細(xì)胞因子都不能誘導(dǎo)SLA-I的表達(圖8)。

3.6.在PAECs中，IL-17和TNFα通過協(xié)同效應(yīng)上調(diào)E-selectin、IL-8和IL-6的表達

據(jù)我們所知，在鼠源或人源系統(tǒng)中，IL-17和TNFα協(xié)同誘導(dǎo)的基因表達水平比它們各自單獨誘導(dǎo)的基因水平之和要高。在豬源系統(tǒng)中，rhIL-17和rhTNFα是否具有協(xié)同效應(yīng)仍不可知。我們發(fā)現(xiàn)，在PAECs中，rhIL-17和rhTNFα誘導(dǎo)的E-selectin、IL-8和IL-6的表達水平明顯高于rhIL-17和rhTNFα單獨誘導(dǎo)的水平之和(圖9)。雖然IL-17單獨誘導(dǎo)的基因表達水平不高，然而通過與TNFα的協(xié)同作用可顯著提高基因的表達水平。

3.7.在PAECs中，tocilizumab不能阻斷IL-6激活的STAT3通路

Tocilizumab是人源IL-6受體的人源化單克隆抗體，在人源系統(tǒng)中，它可以阻斷IL-6介導(dǎo)的下游信號通路的激活進而抑制其炎癥效應(yīng)。在HUVECs中，tocilizumab(100ng/ml)抑制了rhIL-6介導(dǎo)的STAT3的激活，在一個高濃度(500ng/ml)的情況下基本完全阻斷了IL-6介導(dǎo)的STAT3的激活(圖10A-B)。令人吃驚的是，在PAECs中，tocilizumab(100ng/ml或500ng/ml)處理組或非處理組，rhIL-6或rpIL-6激活的STAT3水平?jīng)]有明顯差異(圖10A-B)。造成這種結(jié)果的原因可能是人源和鼠源IL-6受體的結(jié)構(gòu)差異，特別是tocilizumab與受體結(jié)合位點處的結(jié)構(gòu)差異?；谶@些結(jié)果，我們預(yù)測tocilizumab在異種移植中抑制免疫排斥的效果不如病人中的效果好。

4.討論

雖然這些促炎細(xì)胞因子在各種疾病和同種移植中具有重要的病理學(xué)作用，但是在異種移植中它的病理學(xué)作用仍然不清楚。在豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)人源的細(xì)胞因子IL-17、IL-1β和TNFα可以激活NF-κB和MAPKs信號通路，而人源的細(xì)胞因子IL-6可以激活STAT3信號通路。人源的細(xì)胞因子IL-17、IL-1β和TNFα不僅能夠誘導(dǎo)粘附分子(E-selectin、VCAM-1和ICAM-1)、促炎因子(IL-6)和趨化因子(IL-8和MCP-1)，而且也能誘導(dǎo)組織因子。在人源細(xì)胞因子IL-1β或TNFα豬白細(xì)胞抗原I(SLA-I)的表達量也有所增加，但是在人源細(xì)胞因子IL-17中不能。在豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，人源細(xì)胞因子IL-6只能增加MCP-1和組織因子mRNA的水平?？墒?，人源細(xì)胞因子IFNγ對豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞沒有作用?；谖覀兊脑囼?，我們認(rèn)為人源的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα在異種移植中對炎癥反應(yīng)和促凝血反應(yīng)有重要的作用。

Batten等人認(rèn)為人源細(xì)胞因子IL-1β對豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞沒有作用，然而我們發(fā)現(xiàn)它能夠刺激豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生某些變化。他們發(fā)現(xiàn)在500U/ml人源細(xì)胞因子rhIL-1β處理1天、2天、3天或者6天后，在豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，E-selectin和VCAM-1的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有增加，而在我們的試驗中發(fā)現(xiàn)，用20ng/ml人源細(xì)胞因子rhIL-1β處理豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞2h后，E-selectin和VCAM-1的mRNA水平可以增加10-400倍。另外我們發(fā)現(xiàn)，人源細(xì)胞因子rhIL-1β可以顯著激活NF-κB和MAPKs信號通路，以及其他的炎癥相關(guān)基因，趨化因子，組織因子和SLA-I。但是豬白細(xì)胞抗原II(SLA-II DR)是沒有變化的，這個結(jié)論與Batten等人報道的結(jié)論是一致的。我們認(rèn)為導(dǎo)致這樣兩種不同結(jié)果原因可能與不同的處理時間或者人源細(xì)胞因子IL-1β的不同濃度有關(guān)。

IL-17是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的一種特異性的細(xì)胞因子，與自身免疫疾病，癌癥和各種炎癥紊亂反應(yīng)有關(guān)。在之前的研究中，人源細(xì)胞因子IL-17能夠激活PAECs下游信號通路，例如NF-κB、JNK和P38或上調(diào)表達下游粘附因子，促炎基因，趨化因子和組織因子。雖然有些基因的表達在人源細(xì)胞因子IL-17刺激下表達并不是很大，但是當(dāng)它與人源細(xì)胞因子rhTNFα共同作用下，能夠明顯擴大其影響效果。人源細(xì)胞因子IL-17通過加強mRNA的穩(wěn)定性。在牛皮癬疾病中，Andrea Chiricozzi等人鑒定了160個基因，例如CCL20，CXCL1，IL-17C，IL-8等都能通過協(xié)同作用上調(diào)表達。利用基因芯片分析和RT-PCR在另外196個基因表達中這兩個細(xì)胞因子具有協(xié)同作用。在之前研究中，我們發(fā)現(xiàn)在人源細(xì)胞因子IL-17和rhTNFα的協(xié)同作用下，可以誘導(dǎo)E-selectin、IL-6和IL-8的表達。我們預(yù)測除了這三個基因外，在豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，會有更多的基因受到這種協(xié)同作用的影響。基因芯片技術(shù)是一種比較好的方法去研究這些問題。在異種移植中，人源細(xì)胞因子rhIL-17和rhTNFα能夠擴大促炎反應(yīng)?？笽L-17和抗TNFα藥物聯(lián)合使用會對異種移植臨床治療具有一定的治療效果。

IL-6是一種在炎癥反應(yīng)、癌癥、免疫調(diào)控和造血過程中具有廣泛的生物學(xué)功能的多效細(xì)胞因子。它主要激活JAK/STAT3的信號通路。在我們的研究中，人源化細(xì)胞因子IL-6能夠激活STAT3信號通路和誘導(dǎo)MCP-1和組織因子的表達。同樣，IL-6在急性和慢性炎癥反應(yīng)中具有重要的作用。它也能促進多形核中性白血球(PMN)向單核粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。并且我們發(fā)現(xiàn)人源細(xì)胞因子IL-6能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1。這種現(xiàn)象可能支持多形核中性白血球(PMN)向單核粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。IL-6也是一種能夠平衡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞。另外，IL-6在T細(xì)胞具有抗凋亡作用。我們認(rèn)為在異種移植中，通過招募單核粒細(xì)胞，平衡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞以及促進T細(xì)胞的存活，人源細(xì)胞因子IL-6可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。更加有趣的是，托珠單抗(tocilizumab)，一種抗IL-6受體的特異性抗體，不能阻斷由人源細(xì)胞因子IL-6激活的STAT3信號通路。并且建議在體外模型或者豬－狒狒的異種移植模型中，使用其他藥品，例如單抗藥物sarilumab和siltuximab是否能夠阻斷IL-6信號。

另外，我們發(fā)現(xiàn)人源細(xì)胞因子rhTNFα能夠顯著激活NF-κB和MAPKs信號通路，然后調(diào)節(jié)下游基因的表達。豬源rpIFNγ明顯能夠激活下游基因和STAT1，而人源細(xì)胞因子rhIFNγ不能。

在PAECs中，趨化因子MCP-1和IL-8能夠與一些粘附分子E-selectin、ICAM-1和VCAM-1一起，與特異性的內(nèi)細(xì)胞相互作用并且招募它們到炎癥反應(yīng)位點。IL-6也被認(rèn)為是促炎反應(yīng)中的最重要的細(xì)胞因子與促炎反應(yīng)相關(guān)基因的表達是一個放大免疫反應(yīng)最重要的途徑。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)人源細(xì)胞因子rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα能夠誘導(dǎo)這些基因的表達，以及人源rhIL-6能夠增加MCP-1的表達。這些結(jié)果顯示人源細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα在異種移植中能夠促進炎癥反應(yīng)，它們可以被聯(lián)合藥物所抑制。

T細(xì)胞反應(yīng)在異種移植的細(xì)胞免疫反應(yīng)中有重要的作用。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)對T細(xì)胞的激活是十分重要的。豬白細(xì)胞抗原II(SLA-II)主要負(fù)責(zé)CD4⁺T細(xì)胞的激活，而SLA-I主要對CD8⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性。顯性負(fù)Ⅱ類反式激活(Dominant negative class II transactivator)轉(zhuǎn)基因豬能夠降低這類T細(xì)胞的反應(yīng)，而在豬白細(xì)胞抗原I(SLA-I)缺陷性豬的外周血中CD4^-CD8⁺T細(xì)胞的數(shù)量有所減少。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，人源細(xì)胞因子TNFα和IL-1β能夠誘導(dǎo)豬白細(xì)胞抗原I(SLA-I)，但是人源細(xì)胞因子IL-17和IL-6不能。豬白細(xì)胞抗原II(SLA-II)只能被豬源rpIFNγ激活，而其他的細(xì)胞因子則不能。這些發(fā)現(xiàn)顯示，人源細(xì)胞因子TNFα和IL-1β處理的PAECs更容易被CD8⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞識別。在豬－狒狒異種移植的模式中，會經(jīng)常發(fā)生凝血紊亂，成為移植成功的一個重要壁壘。凝血反應(yīng)是一個非常緊密的調(diào)控過程。組織因子引起的凝血酶原向凝血酶轉(zhuǎn)變的一個分子聯(lián)機反應(yīng)，它能夠啟動外源性凝血級聯(lián)反應(yīng)。Ahrens等人認(rèn)為，與野生型的豬相比，下調(diào)組織因子的豬能夠減少凝血酶的形成和增加凝血的時間。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，人源細(xì)胞因子IL-6、IL-1β或者TNFα能夠誘導(dǎo)組織因子的表達，而人源細(xì)胞因子rhIL-17可以微弱的上調(diào)表達組織因子。這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在豬－狒狒異種移植的模式中，人源細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNFα和IL-17能夠促凝血反應(yīng)。因此，在異種移植中，阻斷這些細(xì)胞因子可以緩解凝血紊亂反應(yīng)。

綜上所述，在我們的研究中我們發(fā)現(xiàn)：(1)人源細(xì)胞因子IL-6、IL-17、TNFα和IL-1β能夠以不同的方式激活PAECs；(2)激活的PAECs在不同程度上調(diào)控粘附因子、趨化因子、促炎基因IL-6、SLA-I和凝血因子，這些基因在異種移植中能夠影響炎癥和凝血反應(yīng)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民醫(yī)院

<120> 重組的人源TNFα在制備藥物中的用途

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