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抗人PD?1的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:12639581閱讀:1808來源:國知局
抗人PD?1的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和診療領(lǐng)域,具體涉及一種抗人PD-1的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。



背景技術(shù):

程序性細胞死亡因子(programmed cell death 1,PD-1)是一種共刺激分子,屬于CD28/CTLA4家族。PD-1通過與程序性細胞死亡因子配體1或者2(programmed cell death ligand 1 or 2,PD-L1或PD-L2)結(jié)合后,招募并激活蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶等激活信號通路,對T細胞免疫起到負相調(diào)節(jié)的功能。PD-1還可以通過抑制輔助性T細胞間接影響體液免疫或者直接通過與B細胞上的PD-L結(jié)合影響抗體分泌。PD-1/PD-L1信號異??梢砸痼w內(nèi)免疫微循環(huán)失去穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致自身免疫性疾病或者腫瘤發(fā)生。

商品化抗PD-1單克隆抗體功能也比較單一,或只能做免疫印跡實驗,或只能做免疫組化、流式等實驗,浪費人力物力和時間,不利于開展科研實驗和臨床試驗。比如Abacamanti-PD1 antibody(ab36151)用于ELISA與WB,而常見地,Abacam anti-PD1 antibody【J43】(ab95791)用于Flow Cyt。

抗原的表位分為線性表位和空間表位,免疫印跡(western blot)檢測的是抗原的線性表位,而免疫組化檢測的有可能是線性表位也有可能是空間表位,這兩個實驗往往需要購買和使用多種單克隆抗體。

本發(fā)明旨在提供一種既可以靶向結(jié)合人的PD-1蛋白也同時能夠作為ELISA、Westernblot、免疫組化等應(yīng)用的PD-1單克隆抗體,大大節(jié)約科研的成本和時間。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

第一方面,本發(fā)明提供了一種抗人PD-1的單克隆抗體,所述抗人PD-1的單克隆抗體具有的特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域,既可以靶向結(jié)合人的PD-1蛋白也可以同時能夠用于ELISA、Westernblot、免疫組化等實驗。

本發(fā)明的示例性抗人PD-1的單克隆抗體列于文中的表1和表2。本發(fā)明提供的抗人PD-1的單克隆抗體包括重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR))。表1列出了本發(fā)明提供的抗人PD-1的單克隆抗體的HCVR、LCVR的氨基酸序列,及其在序列表中的序列號。表2列出了編碼本發(fā)明所述的HCVR、LCVR氨基酸序列對應(yīng)的核苷酸序列,及其在序列表中的序列號。

本發(fā)明提供的抗人PD-1的單克隆抗體的氨基酸序列包括:至少一條HCVR氨基酸序列、至少一條LCVR氨基酸序列;具體HCVR和LCVR優(yōu)選為任一選自表1的氨基酸序列。

編碼本發(fā)明提供的抗人PD-1的單克隆抗體的核苷酸序列包括:至少一條HCVR核苷酸序列、至少一條LCVR核苷酸序列;具體HCVR和LCVR優(yōu)選為任一選自表2的核苷酸序列。

表1 序列表中的氨基酸序列

在本發(fā)明一實施例中,抗人PD-1的單克隆抗體2D1-1是經(jīng)過篩選出的最佳效果的抗人PD-1的單克隆抗體。

在本發(fā)明一些實施例中,表1各序列具體為:

SEQUENCE NO.1(2D1.HCVR)的氨基酸序列為(三處下劃線處的序列先后依次為CDR1、CDR2、CDR3):QVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWIKQRPGQGLEWIGRIAPGSGSTYYNEMFKGKATLTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDS AVYFCARLGQYYAMDYWGQGTTLTVSS;

SEQUENCE NO.2(2D1.LCVR)的氨基酸序列為(三處下劃線處的序列先后依次為CDR1、CDR2、CDR3):DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVY FCSQSTHVPYTFGGGTKLELKR。

表2 序列表中的核苷酸序列

在本發(fā)明一些實施例中,表2各序列具體為:

SEQUENCE NO.3(2D1.HCVR)的核苷酸序列為(三處下劃線處的序列先后依次為CDR1、CDR2、CDR3):CAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGAGATGATCTGGTAAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATTAACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATAGGACGTATTGCTCCTGGAAGTGGTAGTACATACTACAA TGAAATGTTCAAGGGCAAGGCAACACTGACCGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAGCTCAGCAGCCTGTCATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGACTGGGACAATACTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA;

SEQUENCE NO.4(2D1.LCVR)的核苷酸序列為(三處下劃線處的序列先后依次為CDR1、CDR2、CDR3):GACATTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTC TGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTAT TTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG;

具體地,SEQUENCE NO.3-4分別對應(yīng)編碼SEQUENCE NO.1-2的氨基酸序列。

鑒于序列同源性,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是,如下實施方案應(yīng)納入本發(fā)明保護范圍:

在本發(fā)明一些實施例中,所述的HCVR為與表1中所示任一HCVR氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的氨基酸序列。

在本發(fā)明一些實施例中,所述的LCVR為與表1中所示任一LCVR氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的氨基酸序列。

在本發(fā)明一些實施例中,所述的編碼HCVR的序列為與表2中所示任一HCVR核苷酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的核苷酸序列。

在本發(fā)明一些實施例中,所述的編碼LCVR的序列為與表2中所示任一LCVR核苷酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的核苷酸序列。

可以理解的,由于“核苷酸序列”具有堿基簡并、突變等情況,行業(yè)內(nèi)普通技術(shù)人員可調(diào)整某些堿基的種類,所述的堿基變化雖然導(dǎo)致了密碼子的變化,但不會引起密碼子翻譯的氨基酸的變化,很常見的,亮氨酸的密碼子就具有多種密碼子,比如:UUA、UUG、CUU。

在本發(fā)明一個實施例中,HCVR(VH)和LCVR(VL)之間還連接有連接肽,連接肽的氨基酸序列為(GGGGS)n(n=1-4)、(GGS)4或(Gly)n(n=6-8),但不限于此。該連接肽主要采用了以甘氨酸和絲氨酸為主構(gòu)成的多肽序列,其中,甘氨酸是分子量最小、側(cè)鏈最短的氨基酸,可增加側(cè)鏈的柔韌性;絲氨酸是親水性最強的氨基酸,可增加肽鏈的親水性。

在本發(fā)明一些實施例中,所述抗人PD-1的單克隆抗體的N段具有免疫球蛋白κ鏈信號肽的氨基酸序列。

本發(fā)明提供的所述抗人PD-1的單克隆抗體的N端加上了免疫球蛋白輕鏈κ鏈的分泌信號肽,從而保證抗體的表達并分泌到宿主細胞外。

第二方面,本發(fā)明還提供了一種如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體的制備方法,該方法包括:將第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體的核苷酸序列用于構(gòu)建表達所述的抗人PD-1的單克隆抗體的重組表達載體;導(dǎo)入宿主細胞;在表達條件下,培養(yǎng)宿主細胞,表達,分離純化,獲得所述抗人PD-1的單克隆抗體。

第三方面,本發(fā)明還提供了如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體按下述一種或多種方法進行應(yīng)用:

(1)將所述抗人PD-1的單克隆抗體單獨進行應(yīng)用;

(2)將所述抗人PD-1的單克隆抗體與化療、放療、手術(shù)、生物治療、免疫治療中的一種或幾種聯(lián)合應(yīng)用。

在本發(fā)明一些實施例中,應(yīng)用(1)中,采用體內(nèi)投遞的方式將所述抗人PD-1的單克隆抗體直接投遞到患者體內(nèi)進行治療。

在本發(fā)明一些實施例中,應(yīng)用(1)中,先通過體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將所述抗人PD-1的單克隆抗體與免疫效應(yīng)細胞混合,然后將所述混有抗人PD-1的單克隆抗體的免疫效應(yīng)細胞輸回患者體內(nèi)實施治療。

在本發(fā)明一些實施例中,應(yīng)用(1)或(2)中,向患者施用如上抗人PD-1的單克隆抗體或含抗人PD-1的單克隆抗體的藥物組合物,可向患者施用多于一次。

在本發(fā)明一些實施例中,應(yīng)用(1)或(2)中,所述的投遞的方式為靶向投遞,包括但不限于采用可靶向投遞的liposome脂質(zhì)體(或其多聚體)等行業(yè)常用載體進行投遞。

通過向包括人的哺乳動物施用本發(fā)明第一方面提供的抗體或第四方面提供的藥物組合物,可預(yù)防或治療腫瘤或其他PD-1的相關(guān)疾病,比如PD-1表達異?;蛭蓙y相關(guān)的疾病。

第四方面,本發(fā)明提供了一種藥物組合物,包括至少一種如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體,及可藥用的載劑、賦形劑或稀釋劑。

本發(fā)明提供的藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法制成藥物制劑。制劑過程中,優(yōu)選將抗體與載體混合或用載體稀釋,或裝入容器形式的載體中。當(dāng)載體作為稀釋劑時,其可以為固體、半固體或液體,用作用于抗體的囊泡、賦形劑或培養(yǎng)基。因此,制劑可以是片劑、丸劑、粉劑、袋裝劑、膠囊、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣溶膠、軟和硬明膠膠囊、注射用無菌溶液、無菌粉劑等形式。合適的載體、賦形劑或稀釋劑的實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。制劑還可以包括填充劑、抗凝血劑、潤滑劑、潤濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。

第五方面,本發(fā)明提供了一種診斷試劑,包括至少一種如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體,及診斷劑,所述的診斷劑包括但不限于熒光團、發(fā)色團、染料、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光分子、順磁性離子或自旋捕獲試劑。

第六方面,本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體在ELISA、Western blot、免疫組化檢測PD-1抗原中的應(yīng)用。

第七方面,本發(fā)明提供了一種核酸分子,編碼如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體的氨基酸序列;在某些實施方式中,所述的核酸分子編碼的氨基酸序列,為與如第一方面所述抗人PD-1的單克隆抗體的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的氨基酸序列。

第八方面,本發(fā)明提供了一種表達如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體的重組載體;在某些實施方式中,所述的重組載體具有本發(fā)明第七方面提供的任一核酸分子序列。

在本發(fā)明一些實施例中,所述的載體為質(zhì)粒載體。具體地,所述重組載體是在空質(zhì)粒的多克隆位點中插入本發(fā)明第七方面提供的任一核酸分子序列獲得,具體插入方法可采用常規(guī)的基因克隆,也可采用無縫克隆(Seamless cloning)。

在本發(fā)明一些實施例中,所述的重組載體還包含表達目的多肽(本發(fā)明中為抗人PD-1的單克隆抗體)所需的所有必要元件的基因表達系統(tǒng),通常其包括以下元件:啟動子、編碼多肽的基因序列,終止子;此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等;這些元件是操作性相連的。

如本文所用,所述的“可操作地連接”是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如:啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo),從而,啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。優(yōu)選地,所述信號肽為免疫球蛋白κ鏈信號肽。優(yōu)選地,所述標(biāo)簽為His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽和Flag標(biāo)簽中的至少一種。以上的信號肽和標(biāo)簽種類為本發(fā)明人的優(yōu)選方式,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體需要選擇合適的信號肽和標(biāo)簽。

第九方面,本發(fā)明提供了一種具有如第八方面所述載體的宿主細胞(優(yōu)選為真核細胞或包括人在內(nèi)的哺乳動物細胞);還提供了將如第八方面所述載體導(dǎo)入宿主細胞中的方法;還提供了通過在允許產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)具有所述載體的宿主細胞,并分離力所產(chǎn)生的抗體的方法。

第十方面,本發(fā)明提供了一種檢測試劑盒,包括固體檢測支持物,所述的固體檢測支持物包含至少一種如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體。在一些實施方式中,所述固體支持物是可連接大分子如抗體、蛋白質(zhì)、多肽、肽、多核苷酸的固體表面,如磁性珠、膠乳珠、微量滴定板孔、玻璃平板、尼龍、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅顆粒、硝酸纖維素膜等。

第十一方面,本發(fā)明提供了一種在待測樣品中檢測異常細胞的方法,其包括使所述樣品與至少一種如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體相接觸。在一些實施方式中,所述的樣品來自經(jīng)切除的腫瘤床。

如本發(fā)明所述,“異常細胞”是具有對于該細胞類型為非典型特征(包括非典型生長、非典型位置處的典型生長或針對非典型靶標(biāo)的典型作用)的任何細胞。這樣的細胞包括癌細胞、良性增生細胞或發(fā)育異常細胞或炎性細胞。

在本發(fā)明一些實施例中,采用如第十一方面所述的方法對移植前捐贈的組織或器官進行篩選,以提供基本不含PD-1的組織或器官。

在本發(fā)明一些實施例中,采用如第十一方面所述的方法對血液供給品進行篩選,以提供基本不含PD-1的血液供給品。

第十二方面,如第一方面所述的抗人PD-1的單克隆抗體或如第八方面所述的重組載體在制備診斷、預(yù)防、治療PD-1相關(guān)疾病的試劑或藥物中的應(yīng)用。

如本發(fā)明所述的,所述的“PD-1疾病”包括但不限于PD-1表達異?;蛭蓙y相關(guān)疾病,比如,PD-1抗原陽性的腫瘤或癌癥。

商品化抗PD-1單克隆抗體功能也比較單一,或只能做免疫印跡實驗,或只能做免疫組化、流式等實驗,浪費人力物力和時間,不利于開展科研實驗和臨床試驗。

本發(fā)明提供的抗人和鼠的PD-1單克隆抗體既可以靶向結(jié)合人的PD-1蛋白也能夠作為ELISA、Western blot、免疫組化等科研試劑,應(yīng)用性極強。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1提供的單克隆抗體的制備方法流程圖;

圖2為本發(fā)明實施例1提供的間接ELISA測定抗血清效價結(jié)果;

圖3為本發(fā)明實施例2提供的Western Blot檢測PD-1抗體與PD-1的結(jié)合的結(jié)果;

圖4為本發(fā)明實施例3提供的PD-1單抗與細胞表面的PD-1分子結(jié)合的流式檢測結(jié)果;

圖5本發(fā)明實施例4提供的PD-1蛋白與對應(yīng)抗體的相互作用分析流程示意;

圖6本發(fā)明實施例4提供的PD-1蛋白與對應(yīng)抗體的相互作用分析實驗條件優(yōu)化后的實驗結(jié)果。

具體實施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明實施例中無特別說明外,所用試劑及耗材均為市售商品。

實施例1 單克隆抗體的制備

本發(fā)明實施例1提供的單克隆抗體的制備方法流程圖如圖1所示。

結(jié)合圖1,本發(fā)明實施例1提供了一種單克隆抗體的制備方法,包括以下步驟:

(1)動物免疫

1)每只老鼠標(biāo)記后,斷尾取血約20ul,-20度保存作為免疫前對照。

2)以本發(fā)明PD-1抗原(2ug/ul)為免疫抗原免疫Balb/c小鼠,100μg/kg體重,共注射六只。首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑,頸背部皮下多點注射,每個注射點注射30-50ul左右混有佐劑的抗原,每只小鼠注射6-8個點為宜;

間隔1周進行二免和三免,方法劑量同一免;

取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化,繼續(xù)四免、方法劑量同一免,四免一周后尾部采血檢測血清效價及抑制,待檢測符合要求時腹腔沖擊免疫一次,3天后取脾細胞。

(2)細胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾細胞,按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合,采用間接競爭ELISA測定細胞上清液,篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化,直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

(3)細胞凍存和復(fù)蘇

取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成5×l06個/ml的細胞懸液,分裝于凍存管,在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管,立即放入37℃水浴中速融,離心去除凍存液后,移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。

(4)單克隆抗體的制備與純化

采用體內(nèi)誘生法,將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入弗氏不完全佐劑0.5ml/只,7天后腹腔注射雜交瘤細胞5×l06個/只,7天后采集腹水。用親和層析柱進行腹水純化,獲得PD-1抗原的2D1株單克隆抗體,紫外分光光度計測定蛋白濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

間接ELISA測定抗血清效價。以包被抗原的最佳濃度包板,陽性血清及陰性血清(作為陰性對照)從1:4000起倍比稀釋,同時以PBS作空白對照:

試劑:包被緩沖液(pH9.6,0.05M碳酸鹽緩沖液),0.015M,pH7.4的PBS-T洗滌緩沖液,封閉液,終止液。

⑴包被:將抗原用包被緩沖液作系列稀釋25ng/well,每個板孔加入100μL,37℃孵育3h,甩凈孔內(nèi)液體,PBS-T洗滌三次;

⑵封閉:每孔加入200μL 5%的脫脂奶粉,37℃孵育1h,甩凈孔內(nèi)液體,PBS-T洗滌三次;

⑶孵育一抗:每孔加入100μL細胞培養(yǎng)上清,37℃孵育1h,甩凈孔內(nèi)液體,PBS-T洗滌三次;

⑷孵育二抗:每孔加入100μL稀釋度為1:8000的羊抗鼠IgG-HRP二抗,37℃孵育30min,甩凈孔內(nèi)液體,PBS-T洗滌五次;

⑸顯色:每孔加入100μL TMB底物,避光反應(yīng)10min;

⑹終止:每孔加入50μL 2mol/L硫酸;

⑺酶標(biāo)儀測定OD450。

結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,本發(fā)明實施例制備的2D1株單克隆抗體表現(xiàn)出較高的特異性和靈敏性。

實施例2 Western Blot檢測PD-1抗體與PD-1的結(jié)合

本發(fā)明實施例2提供了一種Western Blot檢測PD-1的2D1株單克隆抗體與PD-1的結(jié)合的方法,包括:

試劑:HRP標(biāo)記山羊抗小鼠lgG(H+L),PD-1免疫血清,實施例1制備的2D1單克隆抗體。

1)12%分離膠,3%濃縮膠配制。

2)樣本預(yù)處理:40ul樣本+10ul上樣緩沖液混合均勻,100℃熱處理5min上樣;上樣順序:蛋白預(yù)染marker,PD-1;電泳的條件:首先跑濃縮膠,80V,30min,然后分離膠,120V,50min,直至染料離底部1cm處停止電泳。

3)轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件:電泳條件為100V,4℃,90min。

4)封閉,適量5%脫脂奶粉加入膜中,室溫搖床孵育1h。

5)一抗孵育:抗PD-1鼠單克隆抗體,稀釋度1:8000,37℃孵育1h。PBST洗5次,每次5min。

6)二抗孵育:HRP標(biāo)記山羊抗小鼠lgG(H+L),稀釋度1:8000,室溫搖床孵育30min。PBST洗5次,每次5min。

7)曝光:在暗室中向膜上加入曝光底物,于暗盒中曝光,然后將膠片放入顯影液中顯影5min,再在定影液中漂洗幾次晾干即可。結(jié)果如圖3所示,由圖3可知,本發(fā)明實施例制備的P-2D1單克隆抗體可與PD-1高效結(jié)合,其中,PC為PD-1小鼠免疫血清,2D1為實施例1制備的2D1單克隆抗體。

實施例3 流式檢測2D1單克隆抗體與細胞表面的PD-1分子的結(jié)合

本發(fā)明實施例3提供了一種流式檢測實施例1篩選的PD-1單抗與轉(zhuǎn)染了PD-1基因的293T細胞表面的PD-1分子的結(jié)合的方法,包括:

試劑:同型對照IgG,PE-抗鼠IgG二抗

實驗步驟:

1.收集293T細胞細胞,確定細胞總數(shù)。

2.用冰冷PBS(3%FBS)重懸細胞成約1-5x106個細胞每毫升。

3.每管加入100uL的細胞懸液。

4.加入0.1-10ug/ml的一抗(2D1雜交瘤細胞株上清,含有本發(fā)明實所述的2D1單抗),4度避光孵育30min;設(shè)置對照組,等比例加入陰性血清。

5.400g離心5min并用冰冷PBS(3%FBS)重懸細胞。

6.用PBS(3%FBS)稀釋二抗至最佳濃度,并重懸細胞,4度避光孵育30min。

7.洗滌細胞三次,每次400g離心5min并用冰冷PBS(3%FBS)重懸細胞。

8.將細胞懸液立即放于4度避光保存,流式分析。結(jié)果如圖4所示,曲線-1、2分別為PD-1 2D1單抗、對照組的結(jié)果,由圖4可知,本發(fā)明實施例提供的PD-1 2D1單抗與293T細胞細胞表面的PD-1分子的靶向結(jié)合效率較高。

實施例4 驗證PD-1蛋白與對應(yīng)抗體的相互作用

本發(fā)明實施例5采用Bio-rad公司ProteOn XPR36相互作用平行分析系統(tǒng)對實施例1所篩選的PD-1單抗與對應(yīng)抗體的相互作用進行檢測,并獲得親和力,包括:

芯片修飾:傳感芯片表面用50mM NaOH和8mM CHAPS分別在橫向和縱向兩個方向沖洗兩遍,然后縱向連續(xù)注入3針PBS,流速設(shè)為100μl/min。

通道用0.05M sulfo-NHS和0.02M EDAC活化,條件為30μl/min,6分鐘。將5μl Undecylamine(十一胺)和495l DMSO(二甲基亞砜)混合后用pH 5.0的醋酸鈉溶液稀釋20倍?;旌弦河靡埔浩鞔荡蚧靹?,直至澄清。Undecylamine(0.05%v/v)以30μl/min,注入到通道,持續(xù)6分鐘。最后將通道用1M鹽酸乙醇胺去活化,條件是30μl/min,6分鐘。隨后芯片表面用50mM NaOH縱向流過芯片以穩(wěn)定基線。

A蛋白(100μg)按照已有文獻的描述的制備成終濃度22μM的PBS溶液。芯片表面用PBS以100μl/min橫向注入30秒沖洗。沖洗3-4次后A蛋白以100μl/min橫向注入,結(jié)合1分鐘,解離10分鐘。測定動力學(xué)數(shù)據(jù)時,A蛋白以一系列濃度(300、150、75、37.5、18.75nM)注入通道,僅留一個通道注入緩沖液。

將抗體偶聯(lián)到L6通道,以interspot作為陰性參照位點(圖5種的箭頭所指處)。以濃度梯度(300、150、75、37.5、18.75nM)和緩沖液作為參照,橫向流過抗體。示意圖如圖5所示:

檢測結(jié)果:

1:條件優(yōu)化結(jié)果

每個相互作用都需要優(yōu)化實驗條件,以獲得最優(yōu)的實驗條件。針對本次實驗,按照試劑盒操作,優(yōu)化以下條件:

pH值選擇、偶聯(lián)濃度選擇。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果(反應(yīng)過程中抗原抗體的響應(yīng)值)發(fā)現(xiàn):pH4.5最符合本次實驗,偶聯(lián)抗體濃度為20ug。

2:抗體偶聯(lián)結(jié)果(包括活化、固定和封閉三個過程,按照試劑盒操作,評估反應(yīng)過程中抗原抗體的響應(yīng)值)顯示,抗體偶聯(lián)量最優(yōu)為:1600RU。

3:蛋白與抗體相互作用檢測結(jié)果:

經(jīng)過抗原濃度優(yōu)化與實驗條件優(yōu)化后測得:

實驗條件優(yōu)化:將流速調(diào)整為:75ul/min,相互作用時間調(diào)整為220sec,抗原起始濃度為150nM,解離時間仍為600sec,再生條件:0.85%磷酸。

實驗條件優(yōu)化后實驗結(jié)果如圖6所示:

通過軟件扣除陰性對照interspot信號值,再扣除空白參照緩沖液的信號值,擬合后實驗結(jié)果為:抗原與抗體的親和力KD=1.34E-10。

圖6中,橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間,縱坐標(biāo)為反應(yīng)過程中抗原抗體的響應(yīng)值。ka:2.20E+05 1/Ms kd:2.94E-051/s KD:1.34E-10M,各曲線由上至下依次對應(yīng)L6A1、L6A2、L6A3、L6A4、L6A5、L6A6,其中抗體偶聯(lián)到L6通道,L6A1-L6A6分別對應(yīng)L6通道第1到6行。

實驗所得PD-1抗體具有高親和力,同時能用于ELISA、Western Blot、免疫組化等科研使用。

實施例5 可變區(qū)核苷酸檢測

本發(fā)明實施例5對實施例1所篩選的PD-1單抗的可變區(qū)核苷酸進行檢測,包括:

1.總RNA的提取

1)培養(yǎng)2D1細胞至鋪滿瓶底的80%~90%時,收集5*106個細胞到1.5ml離心管,2000xg,離心5min,棄上清。

2)按每管加入1ml Trizol,反復(fù)吹打細胞,室溫放置5min。

3)每管加入200ul氯仿,劇烈震蕩15s,室溫放置3min。

4)10000xg,4度離心15min,此時樣品分為三層,無色水相,中間層和有機相。轉(zhuǎn)移無色水相于新的1.5ml離心管,加入500ul異丙醇,室溫放置10min。

5)10000xg,4度離心10min,棄上清,加入1ml 75%的乙醇,并劇烈渦旋。

6)7500xg,4度離心5min,棄上清,室溫晾干沉淀5min左右。

7)用DEPC水溶解RNA,55℃~60℃水浴中孵育10min。

2.單鏈cDNA的合成

將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)分兩步進行

1)在PCR管中,RNA 10ul,RNA水21ul,用槍頭反復(fù)吹打均勻,70度保溫5min,之后立即冰上放置,防止RNA復(fù)性。

2)以上體系中加入以下試劑,反應(yīng)體系如下:

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

3.PCR擴增VH、VL

1)根據(jù)鼠抗體輕鏈重鏈可變區(qū)第一骨架區(qū)和J段序列,分別設(shè)計擴增重鏈可變區(qū)引物(FH:gAggTgMWgcTKVWgSAgTcTggA,RH:gAcDgTgASHRDRgTBccTKSRccccA)和輕鏈可變區(qū)引物(FL:gAHRTYgTKMTSAcMcARWcTMcA,RL:KATYTccARYYTKgTSccHBcDccgAA),取cDNA擴增VH和VL基因。

表2 VH-PCR反應(yīng)體系

表3 VL-PCR反應(yīng)體系

PCR擴增程序:94℃預(yù)變性5min,(94℃變性50s,52℃復(fù)性35s,72°延伸50s,30cycles),72℃延伸5min。4℃保留。

2)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定、送測序公司測

瓊脂糖凝膠電泳鑒定,電泳純化產(chǎn)物送測序公司測序。獲得2D1單克隆抗體重鏈可變區(qū)核苷酸序列及2D1單克隆抗體輕鏈可變區(qū)核苷酸序列。

具體地,2D1單克隆抗體重鏈(2D1.HCVR)可變區(qū)核苷酸序列如下SEQUENCE NO.3所示(三處下劃線處的序列先后依次為CDR1、CDR2、CDR3):

CAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGAGATGATCTGGTAAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATTAACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATAGGACGTATTGCTCCTGGAAGTGGTAGTACATACTACAATGAAATGTTCAAGGGCAAGGCAACACTGACCGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAGCTCAGCAGCCTGTCATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGACTGGGACAATACTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA;

具體地,2D1單克隆抗體輕鏈(2D1.LCVR)可變區(qū)核苷酸序列如下SEQUENCE NO.4所示(三處下劃線處的序列先后依次為CDR1、CDR2、CDR3):

GACATTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院

<120> 抗人PD-1的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Gln Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg

<210> 3

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggttcagc ttcagcagtc tggagatgat ctggtaaagc ctggggcctc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga ttaactggat aaaacagagg 120

cctggacagg gccttgagtg gataggacgt attgctcctg gaagtggtag tacatactac 180

aatgaaatgt tcaagggcaa ggcaacactg accgtagaca catcctccag cacagcctac 240

attcagctca gcagcctgtc atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagactggga 300

caatactatg ctatggatta ttggggtcaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354

<210> 4

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacattgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggag ctgaaacgg 339

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