本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種分泌抗人IL-37單克隆抗體的雜交瘤細胞株、抗人IL-37單克隆抗體及其應用。
背景技術(shù)：
：IL-37屬于白細胞介素-1（inteleukin-1,IL-1）家族成員。IL-1家族共有11個成員，都具有β-三葉草結(jié)構(gòu)，可以與免疫球蛋白樣受體結(jié)合,家族中的大多數(shù)因子為促炎細胞因子，少部分屬于受體拮抗劑，可以通過阻斷受體與配體結(jié)合減輕炎性反應。2000年，Kumar等發(fā)現(xiàn)一種未成熟的前體肽IL-1H4，于2001年被Eleanor發(fā)現(xiàn)其為IL-1家族的第7個細胞因子，命名其為IL-1F7，至2010被正式更名為IL-37。人類IL-37基因存在于2號染色體上，其分子量是17～24kD，結(jié)構(gòu)與IL-1家族其它成員相似，由12條管狀線組成，分為五個亞型IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d、IL-37e，其中IL-37b是占主導的亞型。IL-37b由218個氨基酸組成，在N端存在一個前導序列，并含有一個caspase-1切割位點，其前體分子被casepase-1酶切后產(chǎn)生成熟的IL-37b。IL-37b在人類的多種組織中都有表達，如淋巴結(jié)、肝臟、皮下脂肪、胸腺、骨髓、胎盤、肺、睪丸、子宮、結(jié)腸腫瘤。在一些細胞系中也發(fā)現(xiàn)了IL-37b的表達，如THP-1、U937、A431、IMTLHKG-1、HL60、HPBMC、HPT-4、NHDC等。IL-37b主要具有抗炎和免疫抑制作用，主要通過與細胞核內(nèi)的Samd3結(jié)合形成復合體調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄來抑制炎癥因子的釋放，也能與IL-18受體結(jié)合抑制IFN-γ的合成，并對TLR后信號傳導和DC細胞活性產(chǎn)生抑制作用，參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展，如：肝炎、腫瘤、結(jié)核、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、結(jié)腸炎、肥胖癥等。目前認為IL-37不但可以在胞內(nèi)發(fā)揮其生物學功能，也可以分泌至細胞外作用于其他細胞或細胞因子而發(fā)揮作用。但是其對于免疫性疾病和感染性疾病的具體調(diào)節(jié)機制仍不十分清楚，因此，進一步闡明IL-37與炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)病機制，可以為疾病的治療提供新思路和新靶點，高親和力、高特異性的單抗無疑是研究IL-37功能的重要工具。免疫分析作為一種特殊的檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于人類和動物。在免疫分析測定中，抗體是一個核心試劑，決定了測定的特異性和敏感性。盡管近些年來一些小分子物質(zhì)開始用于臨床診斷及治療，如單鏈可變區(qū)片段、核酸適配體、肽配體等，然而，單克隆抗體仍是最佳選擇，且與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有特異性高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。這也使其成為診斷試劑的最好選擇。ELISA法作為免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作，檢測成本較低等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本。因此，也適合于血清流行病學調(diào)查。目前市面上有兩家公司出售IL-37單克隆抗體，LSBio與Abcam各有一株，主要應用于免疫組織化學（immunohistochemical,IHC）、WesternBlot（WB）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）、和免疫熒光流式細胞術(shù)（FlowcytometerAnalysis,FCM）等，如在肝癌患者中，通過IHC檢測到肝癌組織IL-37表達顯著的升高，且表達水平與腫瘤大小呈負相關(guān)。同樣的，可以通過WB來評估IL-37在細胞以及組織中表達的變化。ELISA主要用于檢測血清、體液中的可溶性IL-37表達水平，這對于疾病篩查排除診斷是十分重要的。迄今商品IL-37單抗較少應用到FCM檢測，因為沒有流式標記抗體，需要先孵育IL-37單抗，再孵育相應二抗才能進行檢測?？梢?，目前IL-37的單克隆抗體種類較少，應用范圍有限，不足以滿足實驗研究的需要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性高、親和力高的抗人IL-37單克隆抗體、能分泌產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞株以及該抗體在免疫檢測領(lǐng)域和臨床藥物中的應用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：提供一種分泌抗人IL-37單克隆抗體的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCCNO：C201683。本發(fā)明還提供一種抗人IL-37單克隆抗體，其所述抗人IL-37單克隆抗體是由上述雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生的。本發(fā)明還提供一種人IL-37的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包括：a）重組人IL-37蛋白標準品；b）鼠抗人IL-37單克隆抗體；c）兔抗人IL-37多克隆抗體；d）HRP標記的羊抗兔IgG；e）酶標板；所述鼠抗人IL-37單克隆抗體是由保藏號為CCTCCNO：C201683的雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生的。優(yōu)選的，所述的一種人IL-37的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括以下試劑：f）TMB顯色液；g）終止液；h）包被緩沖液；i）洗滌液；j）封閉液；k）稀釋液。優(yōu)選的，所述包被緩沖液為pH9.6、濃度為0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，所述洗滌液為PBST洗滌液，所述封閉液為含有體積百分比為5%的脫脂奶粉的PBST溶液，所述稀釋液為含有體積百分比為3%的脫脂奶粉的PBST溶液.本發(fā)明的抗人IL-37單克隆抗體在制備用于治療由人IL-37介導的自身免疫系統(tǒng)疾病的藥物中的應用。所述自身免疫系統(tǒng)疾病選自胰腺炎、炎性肌病、顯微鏡下多血管炎、自身免疫性再生障礙性貧血、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性肝炎、韋格納氏綜合征、腸憩室病、強直性脊柱炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化癥、銀屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、異位性皮炎、白癜風、移植物抗宿主病、皮膚T細胞淋巴瘤、腎小球性腎炎、IgA腎病、高敏移植患者、抗磷脂綜合征、葡萄膜炎和哮喘、I型糖尿病炎性腸病、類風濕型關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或銀屑病。本發(fā)明的抗人IL-37單克隆抗體在制備用于治療炎癥性疾病的藥物中的應用。所述炎癥性疾病為登革熱病、結(jié)核病或炎癥性腸病。本發(fā)明的有益效果是：（1）本發(fā)明的雜交瘤細胞株能夠分泌產(chǎn)生一種特異性高、親和力高的抗人IL-37單克隆抗體，該抗體能夠識別人IL-37的原核表達產(chǎn)物，人IL-37的真核表達產(chǎn)物，及天然表達的人IL-37蛋白。因此，利用該單克隆抗體可以通過IHC、WB、ELISA、FCM等免疫學方法簡便、快速、準確地檢測出人IL-37蛋白的表達水平；（2）本發(fā)明的雜交瘤細胞株具有良好的傳代能力并能大量擴增培養(yǎng)，能穩(wěn)定在體外分泌抗體，并且分泌抗體的能力隨著培養(yǎng)代次增加沒有下降，誘生腹水的能力也不隨傳代次數(shù)的增加而改變；（3）本發(fā)明的抗人IL-37單克隆抗體與市面出售的抗體具有不同的結(jié)合位點，增加了抗體的種類；（4）本發(fā)明的抗人IL-37單克隆抗體可用于制備雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，并通過雙抗夾心ELISA檢測方法，能夠簡單、快速、準確地檢測出人血清中IL-37蛋白的表達水平，因此可用于臨床樣本檢測，為疾病輔助診斷提供依據(jù)；（5）本發(fā)明的抗人IL-37單克隆抗體在臨床上可用于制備治療由人IL-37介導的自身免疫系統(tǒng)疾病和炎癥性疾病的藥物。附圖說明圖1是鼠抗人IL-37多抗的血清效價檢測結(jié)果。圖2是重鏈（H2），輕鏈（L2）PCR產(chǎn)物測序結(jié)果以及重鏈、輕鏈超變區(qū)結(jié)構(gòu)分析。圖3是鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于WB的檢測結(jié)果。圖4是鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于FCM間接法的檢測結(jié)果。圖5是鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于FCM直接法的檢測結(jié)果。圖6是鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于IHC的檢測乳腺癌組織中IL-37表達的檢測結(jié)果。圖7是間接ELISA測定兔抗人IL-37多抗的血清效價檢測結(jié)果。圖8是WB檢測鼠抗人IL-37多抗特異性的檢測結(jié)果。圖9是鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于ELISA法檢測IL-37工作曲線圖。圖10是鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于ELISA法檢測血漿標本IL-37含量檢測圖。具體實施方式結(jié)合以下實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1：抗體的制備、鑒定及純化1．免疫原的制備與動物免疫使用實驗室保存的含有IL-37基因片段的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，IPTG誘導大腸桿菌大量表達目的蛋白，超聲破碎大腸桿菌后，使用鎳柱純化，得到可溶性IL-37b蛋白。準備2只6周雌性BALB/c小鼠，用人IL-37b蛋白按照表1的方案免疫接種小鼠，總的來說，使用弗氏完全佐劑乳化的150μg純化重組IL-37b進行腹腔注射來初次免疫接種小鼠，14天后進行第二次免疫，初次免疫接種后，每只小鼠以周為間隔經(jīng)腹腔途徑再接受三次含弗氏不完全佐劑乳化的150μg純化重組IL-37b。第四次免疫接種后7天，經(jīng)尾靜脈對所述小鼠采血并從血中分離血清以分析其與IL-37結(jié)合的能力（見圖1）。表1動物免疫方案天數(shù)操作劑量佐劑接種部位1初次免疫200μgCFA腹腔注射14第一次加強免疫200μgIFA腹腔及皮下多點注射21第二次加強免疫200μgIFA腹腔及皮下多點注射28第三次加強免疫200μgIFA腹腔及皮下多點注射35沖擊免疫200μg無腹腔注射2．細胞融合及陽性克隆細胞篩選從兩只小鼠中選擇效價較高的BALB/c小鼠采集并采集脾細胞，進行細胞融合，脾細胞與骨髓瘤細胞的融合比例為4：1。融合生長7天后，用重組IL-37b蛋白作為特異性抗體標靶，通過間接ELISA識別產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞上清（結(jié)果見表2）。表2間接ELISA法篩選陽性細胞克隆號OD值克隆號OD值2A3OVER1C43.49312A113.71211C6OVER2B4OVER1C9OVER2B10OVER1C10OVER2D1OVER1D4OVER2E32.94711D63.95232E93.95971D10OVER2F11.74161E71.38642F5OVER1E112.60782F123.82751F93.98922H103.71361F102.53892H12OVER1G12.56381A5OVER1G2OVER1B83.98911G7OVER1C11.75191G9OVER3．抗體的特異性及亞型鑒定（1）pcDNA3.1-il37-GFP轉(zhuǎn)染293T細胞轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化293-T細胞并計數(shù)，細胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。對于每孔細胞，使用50μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋0.8μg-1.0μgDNA。50μlDMEM培養(yǎng)基稀釋1μl~3μlLIPO2000試劑。LIPO2000稀釋后，在5min內(nèi)同稀釋的DNA混合?；旌舷♂尩腄NA和稀釋的LIPO2000。在室溫保溫20分鐘。直接將復合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37℃，5％的CO2中保溫4~5h后更換生長培養(yǎng)基。24h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染后的細胞表達真核IL-37b蛋白，轉(zhuǎn)染成功的細胞在熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，得到的真核表達IL-37-GFP融合蛋白用于以下WB與FCM對抗體的特異性鑒定。（2）WB鑒定抗體特異性收獲轉(zhuǎn)染了48h的293-T細胞，離心，去上清，加入2×的上樣緩沖液，煮沸后上樣。電泳于4℃進行。濃縮膠90v15min，分離膠120v1h。制備足夠的轉(zhuǎn)移緩沖液，取下凝膠，浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中15-30min，濾紙在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30s。膜在甲醇中潤濕15s，在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡5min。轉(zhuǎn)膜裝置至于冰水中，220v1h。轉(zhuǎn)好的膜使用8％的脫脂奶粉，室溫封閉2h。去除封閉液，使用PBST洗滌3次，每次10min。使用封閉液分別稀釋制備得到的IL-37b抗體，4℃孵育過夜。去除一抗，使用PBST洗滌3次，每次10min。加入使用封閉液稀釋的二抗，室溫孵育1h后。暗室壓片曝光。（3）使用FCM鑒定抗體特異性收取轉(zhuǎn)染24h的293T細胞,細胞放入流式管中，加入3mlPBS洗液，離心500g5min，去上清。（PBS洗液成分：需加入2％FBS或者2％BSA，0.01％的疊氮化鈉。）加入破膜劑，每管250μl，混勻，4℃孵育20min。加入3mlPBS離心500g5min，去上清。每管加入100μl洗液，分別加入制備的IL-37b單克隆抗體，混勻后，4℃孵育30min。使用3mlPBS洗滌兩次，加入帶有APC標記二抗，混勻，4℃孵育30min。PBS洗滌兩次。加入200ml1％的甲醛溶液，固定，放入4℃待檢測。（4）抗體亞型鑒定使用抗體亞型鑒定試劑盒，按照廠商說明書鑒定抗體的亞型。經(jīng)鑒定，單克隆抗體1C6的亞型為IgG1，輕鏈為κ鏈。4．抗體超變區(qū)基因擴增和序列分析（1）抗體超變區(qū)基因擴增①1C6單克隆細胞株復蘇：使用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待細胞長至1×106細胞/ml時準備提取RNA，使用前一天細胞進行半換液，以維持細胞良好的生長狀態(tài)。②1C6單克隆細胞株RNA的提?。杭毎肞BS洗滌，1ml胰酶消化，4mlDMEM培養(yǎng)基中和胰酶的消化，1200r/min，離心5min，棄上清，加入4mlTRIZOL重懸，混勻后分別放入EP管中（1ml/支），反復吹打來裂解細胞至均一透亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在室溫條件下孵育5min，以使核蛋白體完全分解。每支EP管加入200μl氯仿(1/5倍TRIZOL量)，震蕩15s，室溫放置5min，4度，12000g（離心機需提前降溫）離心15min。吸取上清液置新的無酶EP管中，加入與TRIZOL等量的異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min，棄上清，加入與TRIZOL等量的75%無水乙醇進行洗滌，上下顛倒混勻，7500g，離心5min，棄上清,倒扣在濾紙上,室溫靜置待乙醇揮發(fā)。用20ul的DEPC水溶解RNA沉淀，用核酸定量檢測儀檢測RNA含量為480ng/ul。③逆轉(zhuǎn)錄：冰上操作，在無菌EP管內(nèi)加入逆轉(zhuǎn)錄酶2μl，mRNA1μl（480ng），無酶水補足10μl，渦旋混勻，42℃反應1小時，95℃加熱5分鐘，然后置于冰上。④PCR擴增抗體重鏈超變區(qū)基因、輕鏈超變區(qū)基因：根據(jù)PUBMED上已有的IgG1kappa鏈超變區(qū)mRNA序列設(shè)計引物如下：重鏈上游（SEQIDNO：1）：5'-GTCCAGAGTGAAGTGAAGCTTGAGG-3'；重鏈下游（SEQIDNO：2）：5'-CTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3'；輕鏈上游（SEQIDNO：3）：5'-ACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTC-3'；輕鏈下游（SEQIDNO：4）：5'-GCAGCTGTGATACCCAAAGTAAGAC-3'。進行PCR擴增，采用50μl反應體系，共擴增4管，總量200μl。即加入2×Taq酶0.25μl，10×Buffer5μl，dNTP4μl，上下游引物各2μl，模板2μl，無菌水補足50μl。反應條件如下，①94℃，1min；②94℃，30S；③65℃，30s；④72℃，30s；②-④，30個循環(huán)；⑤72℃，10min；⑥4℃,+∞。⑤2%瓊脂糖凝膠電泳：Marker上樣2.5μl加1μl的核酸Ⅱ型染料，PCR產(chǎn)物共4管分別吸取5μl上樣，加1μl的上樣緩沖液和1μl的核酸Ⅱ型染料，110v，40min，進行電泳。⑥凝膠回收DNA：擴大PCR產(chǎn)物上樣量,每孔50μl，共上樣200μl，進行凝膠電泳，使用TaKaRa膠回收試劑盒，在紫外燈下切下含有目的DNA部分的凝膠，具體步驟參照試劑說明書?；厥蘸鬁y得的重鏈DNA含量為60ng/μl，輕鏈DNA含量為40ng/μl。（2）質(zhì)粒構(gòu)建①將膠回收產(chǎn)物與T載體連接，連接體系為T4連接酶1μl，T載體0.5μl，目的片斷2μl，10×T4緩沖液1μl，ddH2O補足10μl，16℃連接過夜。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α：轉(zhuǎn)化平板制備，向鋪好的含有AMP的固體培養(yǎng)基表面加入16μl的IPTG（50mg/ml），40μl的x-gal（20mg/ml），均勻涂開后置于37℃避光1h。取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl的感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃水浴90sec，立即置于冰浴中2-3Min，其間不要搖動離心管。向離心管中加入500μl37℃預熱的LB培養(yǎng)基，150rpm，37℃震蕩培養(yǎng)45min后混勻菌液吸取250μl加入到上述平板中，均勻涂開后置于37℃，培養(yǎng)12-16h。觀察菌落情況。③菌落鑒定：分別挑選重鏈和輕鏈4個白色菌落加入到5ml含AMP的LB液體培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)，16h后吸取2ml菌液提取質(zhì)粒，具體步驟參照質(zhì)粒小提取試劑盒說明書，測定提取的質(zhì)粒濃度后進行PCR擴增，反應體系，條件同上，進行2%瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶。輕鏈僅有一個菌落重組成功。（3）菌液測序（見圖2結(jié)果）抗體重鏈和輕鏈測序結(jié)果以及抗體重鏈和輕鏈超變區(qū)序列分析，其中圖中方框內(nèi)所示的序列，分別表示的是重鏈和輕鏈的三個超變區(qū)。5．抗體的純化（1）腹水的制備選取雜交瘤細胞株1C6（進行融合細胞培養(yǎng)時共用了4塊96孔板，這里指的是第1塊板的C行6列孔中的細胞），取8~10周兩只BALB/c雌鼠，注射弗氏不完全佐劑致敏，0.5ml/只。三天后，注射使用0.5mlPBS懸浮的1C6融合細胞，1×106/只，一周后，每天觀察小鼠狀態(tài)和腹水產(chǎn)生情況。小鼠中度腹脹時第一次收獲腹水，實施穿刺抽取術(shù)，用18號針頭，傾斜呈45°角刺入下腹部腹中線的右側(cè)引流，避開上腹部的臟器和中線附近的血管。每次收集腹水合并在一起。1500g離心腹水10min以沉淀并移除腹水中的細胞。將腹水上清液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中并凍存在-20℃。（2）抗體的純化純化前，解凍腹水，用高速離心機離心使其澄清，純化前去除脂質(zhì)。使用蛋白G層析介質(zhì)純化，檢測腹水前后的效價并驗證純化后的抗體純度。實施例2：雜交瘤細胞的鑒定及保存本發(fā)明的雜交瘤細胞株的保藏信息為：保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址：武漢大學；保藏日期：2016年5月；命名：雜交瘤細胞株1C6；保藏號為CCTCCNO：C201683。1．雜交瘤細胞克隆不同代次的抗體分泌能力的穩(wěn)定性分析首先對1C6雜交瘤細胞進行傳代，分別取第一代，第二代，第五代，第七代，第十代雜交瘤（初始細胞密度為細胞在培養(yǎng)瓶底部鋪滿）培養(yǎng)時間滿兩天后的上清樣本，對細胞分泌上清進行ELISA鑒定，分別取每代細胞的上清樣本作為一抗，以獲得的IL-37原核純化蛋白包板，進行ELISA，每組別均做8個重復孔，其余步驟如上操作，分析結(jié)果顯示OD450平均值分別為3.576854，3.902718，3.8062735，3.518442，3.602658從統(tǒng)計學分析五個代次的分泌抗體能力無統(tǒng)計學上的差異；說明本發(fā)明獲得一株能穩(wěn)定體外分泌抗體的雜交瘤細胞（命名為1C6），同時說明隨著培養(yǎng)代次增加而分泌抗體的能力不下降。2．抗人IL-37單克隆抗體建株與凍存通過有限稀釋將在間接ELISA方法中產(chǎn)生陽性結(jié)果的雜交瘤細胞亞克隆至少兩到三次，直至到使用間接ELISA進行篩選，整個96孔板的細胞上清都為陽性為止。篩選過程中的陽性孔都要在10％生長培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)雜交瘤細胞克隆，并在37℃和5~6％CO2的條件下維持在1×105和5×105細胞/ml之間。細胞數(shù)足夠時。將細胞冷凍在70％血清、20％DMEM、10％DMSO中并存放在液氮中。實施例3：抗人IL-37單克隆抗體的應用一、鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于WB（一）試劑及配制1、電極緩沖液（1×電極緩沖液配制）：Tris堿3.03g，甘氨酸18.8g，SDS1.0g，雙蒸水調(diào)至體積為1L，pH8.3；2、轉(zhuǎn)移緩沖液：甘氨酸2.9g，Tris堿5.8g，SDS0.37g，甲醇200ml，加ddH2O定容至1000ml，pH8.3；3、TBST（Tris-Hcl，Nacl）緩沖液：6gTris堿，9gNacl，雙蒸水500ml，HclpH7.5，定容1L，加1mlTween-20；4、封閉液：8％脫脂奶粉；5、30％丙烯酰胺儲存液：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加雙蒸水至100ml；6、濃縮膠緩沖液：1mol/LTris堿，pH6.8；7、分離膠緩沖液：1mol/LTris堿，pH8.8；以上試劑均用雙蒸水配制；8、預染蛋白Marker；9、PVDF蛋白印跡轉(zhuǎn)移膜；10、HRP標記的羊抗鼠IgG；11、發(fā)光液；12、通用顯影粉；13、酸性定影粉；（二）實驗步驟：1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（1）配膠：12%膠分離膠10ml；蒸餾水2.0ml，30%Acr-Bis(29:1)4.0ml，1MTris,pH8.83.8ml，10%SDS0.1ml，10%過硫酸銨0.1ml，TEMED0.004ml；5%濃縮膠3ml：蒸餾水2.1ml，30%Acr-Bis(29:1)0.5ml，1MTrispH6.80.38ml，10%SDS0.03ml，10%過硫酸銨0.03ml，TEMED0.003ml。（2）灌膠：將配制好的分離膠溶液緩慢加入到裝配好的板中，加至距離短板頂端約3cm處時停止，在膠液表面上小心加入厚約0.5cm的水層，大約30min聚合完畢。30min后，將濃縮膠加入板中至頂部，插入梳子，凝膠聚合1h左右。（3）樣品制備：48小時后，收集轉(zhuǎn)染的細胞，把細胞及培養(yǎng)基一起收集到15ml離心管中，1500rpm離心3min，棄上清，1mlPBS重懸，移入1.5mlEP管，用PBS洗滌兩次，2500rpm，4℃離心5min，盡量去除所有殘留上清，每孔細胞加70μl2×上樣緩沖液，混勻后煮沸5min。（4）電泳：電泳于4℃進行，旁置冰塊降溫。濃縮膠90v15min，當?shù)鞍兹繅撼梢粭l線時，換成電壓120v跑分離膠1h，盡量將蛋白跑開。2.轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)到PVDF膜上（1）制備足夠的轉(zhuǎn)移緩沖液以充滿轉(zhuǎn)移槽，另外準備200ml用于平衡凝膠和膜以及潤濕濾紙。（2）從玻璃板上取下凝膠，去除多余凝膠，保留目的蛋白條帶。（3）將凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中15-30min。濾紙在轉(zhuǎn)移緩沖液中至少浸泡30s。（4）準備膜：在甲醇中潤濕膜15s，保證膜由不透明變成半透明，小心將膜放入雙蒸水中浸泡2min，小心將膜放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少5min。（5）按照黑板、海綿、濾紙、凝膠、膜、濾紙、海綿、白板的順序組裝轉(zhuǎn)移夾層。（6）將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽中，確保正負極正確，加入足夠的轉(zhuǎn)移緩沖液，保證液面完全高于濾紙高度。（7）轉(zhuǎn)膜裝置至于冰水中，200v1h。3.封閉（1）轉(zhuǎn)好的膜小心放入PBST中漂洗，3次，每次5min。（2）加入8％的脫脂奶粉，室溫封閉2h。4.抗體雜交（1）去除封閉液，使用PBST洗滌3次，每次10min。使用封閉液稀釋IL-37單克隆抗體，根據(jù)Abcam商品化IL-37單克隆抗體說明書，WB的建議濃度為1μg~5μg/ml，本次試驗一抗的抗體濃度分別選擇0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml。加入抗體，4℃孵育過夜。（2）去除一抗，使用PBST洗滌3次，每次10min。加入使用封閉液稀釋的二抗，室溫孵育1h后，使用PBST洗滌3次，每次10min。洗滌結(jié)束后吸干液體，準備顯色。5.加底物顯色剪切好膠片，在暗室中將顯色液均勻平鋪在膜上，每張膜約使用200μl顯色液，靜置顯色，在暗室中進行膠片曝光。6.結(jié)果實驗結(jié)果如圖3所示（圖中M:ProteinMarker；1：一抗1C6使用濃度為0.5μg/ml；2：一抗1C6使用濃度為1μg/ml；3：一抗1C6使用濃度為2μg/ml；4：一抗1C6使用濃度為5μg/ml），純化后的抗體有良好的特異性，目的條帶分子量在42KD左右，可以與真核表達的IL-37特異性結(jié)合，抗體濃度改變時并不影響實驗結(jié)果，且當抗體濃度為0.5μg/ml時，仍然可用。二．鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于FCM間接法（一）試劑及配制1、PBS洗液：PBS中加入2％BSA,0.01％的疊氮化鈉；2、破膜劑；3、一抗：鼠抗人IL-37單克隆抗體；4、二抗：APC標記的羊抗鼠IgG；5、固定液：1%的甲醛溶液；（二）實驗步驟1、收取細胞：收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-37-GFP的293-T細胞與培養(yǎng)基一起放入流式管中，1×106個細胞/管，加入3mlPBS洗液500g離心5min，棄上清，加入3mlPBS洗液一次，棄上清，扣干；2、破膜：按照每管250μl的量加入破膜劑，充分混勻，4℃孵育20min。加入3mlPBS洗液震蕩混勻，500g離心5min，棄上清，扣干；3、孵育一抗：每管加100μl洗液，根據(jù)Abcam商品化IL-37單克隆抗體說明書，F(xiàn)CM的建議濃度為1μg/106個細胞，本次試驗中，純化抗體的使用濃度分別選擇0.125μg、0.25μg、0.5μg、0.75μg、1μg/106個細胞。分別加入相應濃度的IL-37單克隆抗體，震蕩混勻，4℃孵育30min。加3mlPBS洗液重復洗滌兩次，500g離心5min，棄上清，留取最后一滴液體；4、孵育二抗：加入APC標記的羊抗鼠IgG二抗，震蕩混勻，4℃孵育20min。加3mlPBS洗液重復洗滌兩次，扣干。每管加入200ml1%的甲醛溶液，固定，放入4℃待測。5、結(jié)果：如圖4所示，其中圖A：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的293-T細胞；圖B：轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-il37-GFP的293-T細胞；圖C：一抗?jié)舛葹?.125μg/106個細胞，抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率為76.3%；圖D：一抗?jié)舛葹?.25μg/106個細胞，抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率為88.3%；圖E：一抗?jié)舛葹?.5μg/106個細胞，抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率為96.6%；圖F：一抗?jié)舛葹?.75μg/106個細胞，抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率為97.7%；圖G：一抗?jié)舛葹?μg/106個細胞，抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率為98.2%。其中，圖C中，圖C1：轉(zhuǎn)染后的293-T細胞孵育抗體后，胞內(nèi)抗原與抗體的結(jié)合比例；圖C2示：轉(zhuǎn)染后的293-T細胞未孵育抗體與孵育相應濃度抗體后的對比結(jié)果；圖C2中的1表示未加入抗體的陰性對照，圖C2中的2表示加入相應濃度的抗體后；以上圖D、E、F、G圖中的表示方法均與圖C相同。由此圖4結(jié)果可知，隨著抗體濃度的增加，抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率依次為76.3%、88.3%、96.6%、97.7%、98.2%?？梢?，當抗體濃度為1μg/106個細胞時，幾乎所有細胞均可以與抗體結(jié)合。三．鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于FCM直接法（一）試劑及配制1、PBS洗液：PBS中加入2％BSA,0.01％的疊氮化鈉；2、破膜劑；3、抗體：AlexaFluor?647熒光標記的鼠抗人IL-37單克隆抗體；4、固定液：1%的甲醛溶液；（二）實驗步驟1、收取細胞：收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-37-GFP的293-T細胞與培養(yǎng)基一起放入流式管中，1×106個細胞/管，加入3mlPBS洗液500g離心5min，棄上清，加入3mlPBS洗液一次，棄上清，扣干；2、破膜：按照每管250μl的量加入破膜劑，充分混勻，4℃孵育20min。加入3mlPBS洗液震蕩混勻，500g離心5min，棄上清，扣干；3、孵育抗體：每管加100μl洗液，考慮到抗體標記的比例不能達到100%，因而加大抗體的實際使用濃度?？贵w濃度選擇2μg/106個細胞。加入抗體，震蕩混勻，4℃孵育30min。加3mlPBS洗液重復洗滌兩次，500g離心5min，棄上清，扣干。每管加入200ml1%的甲醛溶液，固定，放入4℃待測；4、結(jié)果：如圖5所示，其中圖A：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的293-T細胞；圖B：轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-il37-GFP的293-T細胞；圖C：抗體濃度為2μg/106個細胞，抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率為90.1%其中，圖C中，圖C1：轉(zhuǎn)染后的293-T細胞孵育抗體后，胞內(nèi)抗原與抗體的結(jié)合比例；圖C2：轉(zhuǎn)染后的293-T細胞未孵育抗體與孵育相應濃度抗體后的對比結(jié)果；圖C2中的1表示未加入抗體的陰性對照，2表示加入相應濃度的抗體后。由此可知，標記的抗體與細胞內(nèi)抗原結(jié)合良好，其與胞內(nèi)抗原的結(jié)合率為90.1%。四．鼠抗人IL-37單克隆抗體應用于IHC（一）免疫組化（IHC）組成成分：1.固定液：4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；配制：4g多聚甲醛溶于80ml0.1M的磷酸（PB）緩沖液中，加熱至60度左右助溶,滴加少許NaOH使溶液變清亮,最后定容至100ml,充分混勻調(diào)價PH，4度保存；2.防脫劑：多聚賴氨酸；3.抗原修復液：0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）；配制：檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0.4g，加蒸餾水定容至1000ml；4.3%甲醇-H2O2溶液（(作用阻斷過氧化物酶）：30%H2O2和80%甲醇溶液配制而成；5.顯色劑：DAB試劑盒、蘇木素染液；6.山羊抗血清（封閉液，封閉非特異性染色）；7.抗體稀釋液（稀釋一抗，二抗，三抗）；8.一抗：鼠抗人IL-37單克隆抗體（單克隆1C6細胞株分泌）；9.二抗：生物素標記的兔抗鼠IgG；10.三抗：鏈霉素親生物素蛋白-過氧化物酶溶液；11.PBS（0.01M磷酸鹽緩沖液，pH7.4)（配試劑，洗滌使用）；配制：NaCl8g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·12H2O3.48g，KCl0.2g，溶于800mLH2O中，加去離子水定容至1000mL；12.0.1MPB（配試劑使用），配制：Na2HPO4·12H2O：14.5g；NaH2PO4·2H2O：1.5g13.其它試劑包括：二甲苯、梯度濃度乙醇、中性樹膠，石蠟。（二）采用SP法進行染色：首先，乳腺癌組織經(jīng)固定，脫水，透明，包埋，切片，貼片，烤片等步驟進行切片制作過程，然后進行以下步驟：1.石蠟切片4um厚，用防脫片劑多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，置烤箱60℃，60min；2.切片脫蠟至水，PBS洗3×3min；3.高溫高壓抗原修復：取足量0.01M檸檬酸緩沖液于壓力鍋中，加熱至沸騰，將切片置入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱到工作溫度和壓力后開始計時。1.5min后壓力鍋離開熱源，1min后自來水輕淋鍋體冷卻至室溫，取出切片，蒸餾水沖洗2次，洗2×3min；4.滴加3﹪甲醇-過氧化氫阻斷過氧化物酶，室溫孵育15min，冷PBS洗3×5min；5.滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余血清，不用沖洗；6.滴加按一定濃度稀釋的1C6一抗（1：200抗體稀釋液稀釋），同時以PBS代替一抗作空白對照，4℃冰箱孵育過夜；7.冷PBS洗3×5min，滴加生物素標記的二抗（按說明書稀釋），室溫孵育10min；8.冷PBS洗3×5min，滴加鏈霉素親生物素蛋白-過氧化物酶溶液（三抗，按說明書稀釋），室溫孵育10min；9.冷PBS洗3×5min，DAB顯色，蒸餾水1ml，加顯色試劑盒內(nèi)A、B、C試劑各一滴，充分混勻，室溫下避光顯色3-10min（在顯微鏡下控制顯色時間），蒸餾水洗滌;10.蘇木素輕度復染，自來水返藍15min，逐級脫水，透明，封片。（三）結(jié)果判斷：1.每一批免疫組化均設(shè)有已知陽性對照和用PBS代替一抗的空白對照，陽性表達定位于細胞膜或細胞質(zhì)，均呈棕黃色或棕褐色顆粒樣分布。每一切片隨機選擇3個視野（×200），在顯微鏡（×400）下計數(shù)每個視野100個腫瘤細胞中陽性細胞的比例，非癌組織則計數(shù)著色區(qū)100個細胞中陽性細胞的比例，取3個視野的平均百分數(shù)為判定結(jié)果。光學顯微鏡下觀察（見圖6），根據(jù)棕黃色陽性信號的強弱和面積判斷結(jié)果：陽性細胞﹤10﹪為陰性表達；10﹪～50﹪為陽性表達；﹥50﹪為強陽表達。結(jié)果判斷：按陽性細胞百分率計分：陽性細胞﹤10﹪計0分；10﹪～50﹪計1分；﹥50﹪計2分。2.按染色強弱計分：淡黃色計0分；黃色計1分；棕黃色計2分。兩項合并得0～1分為陰性；2～3分為陽性；4分為強陽性。五．人IL-37雙抗體夾心ELISA檢測方法人IL-37的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒組分：重組人IL-37蛋白標準品，鼠抗人IL-37單克隆抗體，兔抗人IL-37多克隆抗體，HRP標記的羊抗兔IgG，TMB顯色液（Thermo公司），H2SO4終止液（Solarbio公司），包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6，Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸餾水定容至1L，4℃保存），PBST洗滌液(1000mlPBS+500ulTween20)，5%脫脂奶粉（封閉液，5g奶粉+100mlPBST），3%脫脂奶粉（反應用稀釋液，3g奶粉+100mlPBST），96孔corning可拆卸酶標板。其中：包被緩沖液用于在96孔可拆卸酶標板上包被鼠抗人IL-37單克隆抗體；5%脫脂奶粉用于單抗包板之后的封閉環(huán)節(jié)；3%脫脂奶粉用于稀釋反應物，如蛋白標準品，多抗，二抗，檢測血清；PBST洗滌液用于ELISA反應每一步的洗滌；96孔可拆卸酶標板用于包被單克隆抗體；重組IL-37蛋白標準品，倍比稀釋后分別與單克隆抗體和多克隆抗體之間結(jié)合形成夾心復合物，通過加入HRP-羊抗兔IgG和酶適應性底物TMB后，H2SO4終止反應，通過吸光度值的變化得出Ag-Ab反應的標準曲線。檢測原理：利用抗原或抗體可通過多種機制吸附于酶標板的特點，將單克隆抗體用包被緩沖液稀釋到一定濃度后加入到96孔板中，每孔100ul，4℃包被過夜。次日用5%脫脂奶粉37℃封閉2小時，封閉掉酶標板底部未包被上抗體的部分，消除非特異性吸附。加入標準品或檢測血清利用抗原抗體間特異性結(jié)合原理使其與包被單抗結(jié)合后吸附于固相載體表面，洗滌去除孔中未結(jié)合的抗原，然后加入多克隆抗體，該抗體同樣可以和抗原特異性結(jié)合，形成單抗-抗原-多抗的雙抗夾心復合物，最后加入針對多克隆抗體Fc段的HRP-羊抗兔IgG，結(jié)合后該單抗-抗原-多抗-HRP-羊抗兔IgG復合物共同吸附于載體表面，加入酶適應性底物TMB，避光反應15min，酶催化底物顯色，最后加入H2SO4終止顯色，酶標儀檢測各孔吸光度值，通過吸光度值的大小來反應各孔中抗原的含量。5.1重組IL-37蛋白的誘導表達和多克隆抗體的制備（1）蛋白的表達與純化，免疫接種將含有IL-37質(zhì)粒的大腸桿菌菌種按1:100接種于含有Kana的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖菌過夜，12h~16h后，按照1:100的比例將搖好的菌液接種到500ml含Kana的LB培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)至菌液OD值在0.55左右，取1ml菌液保留，作為空白對照，剩余菌液加入終濃度為1mmol/L的IPTG母液，繼續(xù)搖菌約3h，取1ml菌液保留，作為誘導后對照，剩余菌液在10000g，離心20min，收集菌體沉淀，將該菌體沉淀在超聲破碎儀上超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀樣品，以誘導前和誘導后樣品對為對照，進行SDS-PAGE電泳，分析得出該蛋白為可溶性蛋白，同時利用Ni-NAT親和層析柱純化得到目的蛋白。使用超濾離心管去咪唑與濃縮，用1×PBS來作為最后的蛋白儲存液，BCA法測定蛋白含量，并調(diào)整濃度為1.0mg/mL，分裝凍存保存于-80℃，作為免疫原。準備2只雌性新西蘭白兔，利用制備好的IL-37b蛋白免疫兔子,取1ml蛋白用等體積弗氏完全佐劑混合研磨乳化，制備成免疫原，第一周在兔雙后腿足跖處注射抗原，每側(cè)0.5ml。第二周同樣取1ml蛋白用等體積弗氏不完全佐劑混合研磨乳化后在兔雙后腿腘窩淋巴結(jié)處注射抗原，每側(cè)0.5ml。第3-4周免疫時無需加入佐劑，直接取1ml蛋白分別在背部進行多點注射和大腿肌肉注射。末次免疫后1周于耳緣靜脈取血，用間接ELISA法檢測血清效價為一號兔子為1:128000，二號兔子為1:10000。以下選擇一號兔所得多抗進行試驗（見圖7）。（2）多克隆抗體的純化與鑒定使用飽和硫酸銨法對多抗進行初步純化，透析袋透析，BCA法檢測兔多抗?jié)舛葹?.45μg/μL，具體步驟按照說明書進行。WB檢測抗體特異性，用表達IL-37真核質(zhì)粒PcDNA3.1,轉(zhuǎn)染293T細胞后48h，收集細胞煮沸法裂解細胞得到IL-37蛋白，用該蛋白上樣進行電泳，上樣量分別為5μl，10μl，20μl。然后用兔多克隆抗體（1:8000稀釋）孵育，再加入羊抗兔二抗（1:5000）孵育后暗室曝光，結(jié)果顯示在42KD出有條帶產(chǎn)生，證明該多抗可以和真核表達IL-37蛋白結(jié)合（見圖8）。5.2．間接ELISA方法的建立（1）酶標抗體工作濃度的確定：兔多抗以（1:4000、1:6000、1:8000、1:10000）不同濃度包被96孔板，4℃過夜，5%脫脂奶粉37℃封閉2小時，同時將HRP標記的羊抗兔IgG抗體進行一系列稀釋(1：3000、1：5000、1：6000、1：8000）選取A450值接近1.0時的酶標抗體濃度1:5000為最佳工作濃度。（2）抗原抗體工作濃度的確定：采用棋盤滴定法確定，將鼠抗人IL-37單克隆抗體（濃度1.8mg/mL，BCA法檢測）稀釋為1:100、1:200、1:400包被與ELISA板上。加入強陽性抗原（46.875μg/L，3%脫脂奶粉稀釋）和陰性對照（3%脫脂奶粉），同時各濃度梯度抗原均設(shè)置一個復孔。將兔抗人IL-37多克隆抗體稀釋為1:6000、1:8000、1:10000。選擇強陽性抗原液的A450值在1.0左右，陰性參考的A450值小于0.1的條件作最適條件，據(jù)此選擇包被單抗1:200稀釋，多克隆抗體1:6000稀釋為最佳工作濃度。（3）封閉液的確定：分別用5%脫脂奶粉和1%BSA做封閉液，進行不同封閉液封閉效果的對比。按夾心ELISA具體步驟進行實驗。反應后比較各組的陰陽對照孔A450值，計算P/N(陽性孔與陰性孔A450比值)，以確定最佳封閉液為5%脫脂奶粉。（4）封閉時間的選擇：分別采取37℃封閉2h，4℃封閉過夜。按夾心ELISA具體步驟進行實驗。反應后比較各組的陰陽對照孔A450值，計算P/N(陽性孔與陰性孔A450比值)，得出二者之間無明顯差異，因此為節(jié)約時間選擇37℃封閉2小時。（5）測定范圍的確定：將純化的IL-37蛋白(0.6μg/μL)1:200稀釋后進一步倍比稀釋，如1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800直到1:409600進行測定，標準品濃度為1.465μg/L時測得的P/N值小于2.1，繪制標準曲線，確定線性范圍為1.465~46.875μg/L，最小檢出濃度為1.465μg/L（見圖9）。（6）重復性測定：①批內(nèi)重復試驗即在同一批包被的酶標板內(nèi)對46.875μg/L（1:12800稀釋）純化的IL-37蛋白進行20次平行檢測，測其A450，計算CV值。②批間重復試驗：分5次檢測46.875μg/L純化抗原，每次設(shè)4個重復孔，測其A450，計算CV值。得出批內(nèi)誤差為6.6%，批間誤差為11.1%（見表3）。表3重復性試驗結(jié)果批內(nèi)重復性試驗批間重復性試驗A450平均值（）2.112.23A450標準差（SD）0.140.26變異系數(shù)（CV%）0.0660.1175.3．間接ELISA方法的應用（1）IL-37真核質(zhì)粒PcDNA3.1-il37-GFP轉(zhuǎn)染293T細胞48h后，熒光顯微鏡觀察綠色熒光數(shù)量，同時使用細胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白700μg，利用上述ELISA方法檢測293T細胞表達的IL-37含量為250μg/L，占細胞總蛋白的百分比35.7%，該結(jié)果熒光顯微鏡所得初步結(jié)果一致。（2）正常人40例，登革熱病人40例，結(jié)核病人20例，進行血漿IL-37含量檢測，取各標本血漿100μl，用上述建立好的ELISA方法，檢測血漿IL-37的含量，每孔均設(shè)置一個復孔，同時使用IL-37純化蛋白作為標準品，梯度稀釋至最低檢測限，由圖10可知，該試劑盒可以用于炎癥性疾病檢測。同樣的原理，該試劑盒還可以用于檢測由人IL-37介導的自身免疫系統(tǒng)疾病。由此，本發(fā)明的抗人IL-37單克隆抗體可用于制備雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，并通過雙抗夾心ELISA檢測方法，能夠簡單、快速、準確地檢測出人血清中IL-37蛋白的表達水平，因此可用于臨床樣本檢測，為疾病輔助診斷提供依據(jù)。本發(fā)明的抗人IL-37單克隆抗體在臨床上可用于制備治療由人IL-37介導的自身免疫系統(tǒng)疾病和炎癥性疾病的藥物。最后應當說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。當前第1頁1 2 3