本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高基因打靶的效率的方法及β-球蛋白基因位點的堿基原位修復方法。
背景技術(shù)：
TALEN技術(shù)是目前商業(yè)化最成功的技術(shù)，雖然將單個的TALEN模塊進行組裝需要大量的分子克隆和測序操作，十分繁瑣，但是很多商業(yè)公司可以提供組裝好的三聯(lián)密碼子TALEN模塊，甚至四聯(lián)密碼子TALEN模塊，這樣就大大縮短了構(gòu)建TALEN元件的實驗周期。不過也正是因為如此，絕大多數(shù)實驗室都難以自行完成TALEN技術(shù)的完整操作，對其推廣造成了障礙。
ZFN技術(shù)則是最早被廣泛使用的基因組定點修飾技術(shù)，各大平臺均比較完善，有很多可以直接使用的資源。然而由于其自身的三聯(lián)屬性，其設(shè)計比TALEN更為繁瑣，而且高度依賴于目標序列及其上下游序列，還具有脫靶率高及細胞毒性大等諸多限制性因素。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種提高基因打靶的效率的方法，包括以下步驟：
S10：確定基因原位修復的位點；
S20：引入CRISPR/Ca系統(tǒng)對編輯位點DNA進行切割造成DNA損傷，同時提供修復模板片段。
本發(fā)明還提供了一種β-球蛋白基因位點的堿基原位修復方法，包括以下步驟：
(1)在人類地中海貧血的β-球蛋白基因缺陷的多能干細胞中對β-球蛋白基因位點的堿基進行原位修復；
(2)靶向人β-球蛋白基因缺陷的載體誘導性多能干細胞的構(gòu)建；
(3)多能干細胞基因矯正效率的檢測；
(4)單鏈寡核苷酸ssODNs、spCas9-HF1載體β-地中海貧血的β-鏈球蛋白基因位點進行基因打靶修飾；
(5)提取DNA進行PCR分析。
在某些實施方式中，所述步驟(5)之后還包括測序進行驗證基因確定克隆的正確性的過程。
在某些實施方式中，所述步驟(5)中引物序列為：
F:5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’
R:5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’
Rwt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)。
在某些實施方式中，所述測序為高通量測序。
在某些實施方式中，所述步驟(2)中，具體過程為：從確診為中海貧血β-41/42球蛋白基因純合外顯子的患者獲取皮膚；從皮膚中分離成纖維細胞；對所得到的成纖維細胞進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞接種在基質(zhì)膠鋪墊的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；再將誘導性多能干細胞接種于基質(zhì)膠鋪墊的組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并每3～4天利用干細胞技術(shù)傳代一次。
在某些實施方式中，所述步驟(3)中，具體過程為：使用慢病毒pwpsld構(gòu)建EGFP表達雙熒光報告載體：pef1α-mcherry-2a-Δ41/42-egfp。
在某些實施方式中，所述步驟(4)中，具體過程為：
①取多能干細胞,spCas9/HF1載體，ssODN4進行轉(zhuǎn)染；
②轉(zhuǎn)染后放入Y-27632抑制劑12～48小時，加入小分子化合物L755507；
③轉(zhuǎn)染后36～72小時，分選表達綠色熒光的細胞。
在某些實施方式中，所述步驟①中取多能干細胞1×106個,spCas9/HF1載體8ug，ssODN4 2μg進行轉(zhuǎn)染。
在某些實施方式中，所述步驟②中轉(zhuǎn)染后放入10μM Y-27632抑制劑24小時。
本發(fā)明提供的一種提高基因打靶的效率的方法及β-球蛋白基因位點的堿基原位修復方法相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點在于：
1、經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)的缺陷主要原因在于：需要大量的分子克隆和測序操作，十分繁瑣，雖然很多商業(yè)公司提供組裝好的模塊，縮短了構(gòu)建實驗周期，絕大多數(shù)實驗室都難以自行完成TALEN技術(shù)的完整操作，對其推廣造成了障礙；
2、ZFN技術(shù)的三聯(lián)屬性，其設(shè)計比TALEN更為繁瑣，而且高度依賴于目標序列及其上下游序列，脫靶率高及細胞毒性大等限制性因素；
3、CRISPR/Cas技術(shù)有上下文依賴性，目前只能應(yīng)用于上游有PAM序列的靶位；
4、效率低、細胞毒性強；
基于以上現(xiàn)有基因修飾所存在的不足，單鏈寡核苷酸ssODNs和小分子化合物參與CRISPR/Cas9基因修飾系統(tǒng)后，在基因修飾效率、時效性、修飾的質(zhì)量得到了提高。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例的方式對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。
但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。
本發(fā)明提供了一種提高基因打靶的效率的方法，其包括以下步驟：
S10：確定基因原位修復的位點；
S20：引入CRISPR/Ca系統(tǒng)對編輯位點DNA進行切割造成DNA損傷，同時提供修復模板片段。
上述，基因打靶技術(shù)是一種按照DNA同源重組原理，以胚胎干細胞為主要操作對象，結(jié)合分子克隆與細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、篩選技術(shù)在細胞水平引入、改造、修飾特定遺傳信息的實驗手段。它是建立在胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù)(Embryonic stem cells，ESCs)和同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門新技術(shù)，該技術(shù)具有定位性強、打靶后的新基因可隨染色體穩(wěn)定遺傳等特點。
細胞基因組DNA都會不時出現(xiàn)雙鏈或單鏈斷裂等損傷，這主要是由細胞外界生存環(huán)境條件的改變、細胞內(nèi)部的氧化及物理損傷及細胞的DNA復制和減數(shù)分裂引起的。這種現(xiàn)象在我們?nèi)祟惣毎邪l(fā)生的頻率從數(shù)次到數(shù)千次不等，若細胞中的DNA損傷在細胞進入下一個細胞分裂前不能得到正確修復，就會導致細胞遺傳信息的改變，細胞分裂停止或是機體清除，因此我們生物機體在進化過程中發(fā)展出了DNA損傷修復系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)在真核細胞中，染色體DNA出現(xiàn)的單鏈斷裂和雙鏈斷裂可依兩條途徑進行自我修復：同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)。
基因打靶技術(shù)主要是借助于真核細胞自身的這種DNA損傷修復機制，根據(jù)相關(guān)基因在基因組的結(jié)構(gòu)和功能信息，借助分子克隆技術(shù)設(shè)計相應(yīng)同源打靶片段，將目的基因特異敲除或用其它基因替代失活，從而人為地修飾基因組，實現(xiàn)對靶基因的定點敲除或?qū)⒛康幕蚱味c整合到基因組的一項轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該技術(shù)除了可部分或完全中止某一基因的表達外，還包括引入新基因及引入定點突變。既可以使用突變基因或其它基因代替正?；颍部梢杂谜；虼嫱蛔兓?。
由于基因修飾技術(shù)近幾年取得了很大的突破，目前可以把基因打靶技術(shù)分為傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)和新型基因打靶技術(shù)；也可根據(jù)研究目的和打靶模式，將基因打靶技術(shù)分為：靶向基因敲除、條件性基因打靶、基因定位整合、基因靶向修飾、以及可以特異降低靶基因mRNA的小RNA干擾技術(shù)。
雖然常規(guī)的基因打靶技術(shù)可以實現(xiàn)基因的靶向修飾，但是由于同源重組概率很低，且篩選周期較長等原因使得這項技術(shù)的應(yīng)用受到很大的限制。盡管依靠細胞內(nèi)的自發(fā)同源重組建立的基因打靶技術(shù)在原核生物、酵母和小鼠胚胎干細胞(mESCs)中已得到了較好應(yīng)用，但由于其在其它細胞中同源重組發(fā)生的概率很低，應(yīng)用仍然存在較大困難，嚴重限制了這些物種中基因功能的深入研究。在過去的十年間，人工核酸酶(Engineered endonuclease，EEN)介導的基因組編輯技術(shù)的日漸成熟，將這一現(xiàn)狀徹底改變，使得研究人員可以操作各種細胞類型和生物的任何基因，使得這項技術(shù)被Nature Methods雜志評選為2011年度最受關(guān)注的技術(shù)成果。從技術(shù)的發(fā)展來看，這類酶主要包括3種：鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFn)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，以及CRISPR-Cas9技術(shù)。這種技術(shù)突破了傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)的限制，理論上能在任何物種基因組的能在內(nèi)源性序列上引入特異性修改，切除基因片段，定點整合目的基因以及進行堿基替換，使之成為在多種細胞類型和生物體內(nèi)進行高效、位點特異性的基因修飾的一個常用工具，在生物基因組改造、基因功能分析，動植物抗病育種等重大的基因組學問題的解決中將具有廣闊的應(yīng)用前景。
可以理解的是，CRISPR/Cas技術(shù)擺脫了合成并組裝具有特異性DNA識別能力蛋白模塊的繁瑣操作，其gRNA的設(shè)計和合成工作量遠遠小于TALEN和ZFN技術(shù)的DNA識別模塊的構(gòu)建過程，且毒性遠遠低于ZFN技術(shù)?；谝陨犀F(xiàn)由于的基因修飾所存在的不足，本發(fā)明利用單鏈寡核苷酸ssODNs和小分子化合物，結(jié)合CRISPR/Cas9基因修飾系統(tǒng)后，在β-地中海貧血誘導多能干細胞基因修復效率大大提高。
本發(fā)明還提供了一種β-球蛋白基因位點的堿基原位修復方法，包括以下步驟：
(1)在人類地中海貧血的β-球蛋白基因缺陷的多能干細胞中對β-球蛋白基因位點的堿基進行原位修復；
(2)靶向人β-球蛋白基因缺陷的載體誘導性多能干細胞的構(gòu)建；
(3)多能干細胞基因矯正效率的檢測；
(4)單鏈寡核苷酸ssODNs、spCas9-HF1載體β-地中海貧血的β-鏈球蛋白基因位點進行基因打靶修飾；
(5)提取DNA進行PCR分析。
上述，小分子化合物L755507可以明顯增強CRISPR-基因修飾效率，等位基因的糾正效率可以達到54％，單基因的修飾效率到達25.5％，脫靶和外顯子序列分析結(jié)果可以證實CRISPR/Cas9的效率。
根據(jù)本發(fā)明，以地中海貧血的多能干細胞(iPSCs)為研究對象，利用gRNAs、單鏈寡核苷酸ssODNs、小分子化合物參與到CRISPR/Cas9基因修飾系統(tǒng)進行β-地中海貧血的β-鏈球蛋白修復，得到成功，并且進一步應(yīng)用于臨床疾病治療的潛力。
進一步的，所述步驟(5)之后還包括測序進行驗證基因確定克隆的正確性的過程。
進一步的，所述步驟(5)中引物序列為：
F:5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’
R:5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’
Rwt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)。
進一步的，所述測序為高通量測序。
進一步的，所述步驟(2)中，具體過程為：從確診為中海貧血β-41/42球蛋白基因純合外顯子的患者獲取皮膚；從皮膚中分離成纖維細胞；對所得到的成纖維細胞進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞接種在基質(zhì)膠鋪墊的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；再將誘導性多能干細胞接種于基質(zhì)膠鋪墊的組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并每3～4天利用干細胞技術(shù)傳代一次。
進一步的，所述步驟(3)中，具體過程為：使用慢病毒pwpsld構(gòu)建EGFP表達雙熒光報告載體：pef1α-mcherry-2a-Δ41/42-egfp。
進一步的，所述步驟(4)中，具體過程為：
①取多能干細胞,spCas9/HF1載體，ssODN4進行轉(zhuǎn)染；
②轉(zhuǎn)染后放入Y-27632抑制劑12～48小時，加入小分子化合物L755507；
③轉(zhuǎn)染后36～72小時，分選表達綠色熒光的細胞。
進一步的，所述步驟①中取多能干細胞1×106個,spCas9/HF1載體8ug，ssODN4 2μg進行轉(zhuǎn)染。
進一步的，所述步驟②中轉(zhuǎn)染后放入10μM Y-27632抑制劑24小時。
為了便于理解本發(fā)明，下面合實施例來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細工藝設(shè)備和工藝流程才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
實施例1
ssODNs和spCas9-HF1糾正地貧的β-球蛋白基因缺陷的iPSCs
主要步驟：
⑴iPSCs 1×106,8ug spCas9/HF1載體，2μg ssODN4，Neon Transfection System(Thermo Fisher)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)；
⑵轉(zhuǎn)染后放入mTeSR1配制的10μM Y-27632抑制劑24小時，加入或者不加小分子化合物L755507；
⑶轉(zhuǎn)染后48小時，使用Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS)分選表達綠色熒光的細胞，然后放入6孔板繼續(xù)培養(yǎng)10天；
⑷TIANamp Genomic DNA kit(Tiangen)提取DNA進行PCR分析，需要100ng DNA模板和LA Taq(Takara)；
引物序列：
F：5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’(突變位點上游430bp)
R：5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’(突變位點下游243bp)
R wt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)
⑸測序進行驗證基因確定克隆的正確性，最后通過高通量測序進一步驗證。
實施例2
ssODNs和spCas9-HF1糾正地貧的β-球蛋白基因缺陷的iPSCs
主要步驟：
⑴iPSCs 1×106，8ug spCas9/HF1載體，2μg ssODN4，Neon Transfection System(Thermo Fisher)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)；
⑵轉(zhuǎn)染后放入mTeSR1配制的10μM Y-27632抑制劑12小時，加入或者不加小分子化合物L755507；
⑶轉(zhuǎn)染后36小時，使用Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS)分選表達綠色熒光的細胞，然后放入6孔板繼續(xù)培養(yǎng)10天；
⑷TIANamp Genomic DNA kit(Tiangen)提取DNA進行PCR分析，需要100ng DNA模板和LA Taq(Takara)；
引物序列：
F：5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’(突變位點上游430bp)
R：5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’(突變位點下游243bp)
R wt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)
⑸測序進行驗證基因確定克隆的正確性，最后通過高通量測序進一步驗證。
實施例3
ssODNs和spCas9-HF1糾正地貧的β-球蛋白基因缺陷的iPSCs
主要步驟：
⑴iPSCs 1×106，8ug spCas9/HF1載體，2μg ssODN4，Neon Transfection System(Thermo Fisher)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)；
⑵轉(zhuǎn)染后放入mTeSR1配制的10μM Y-27632抑制劑48小時，加入或者不加小分子化合物L755507；
⑶轉(zhuǎn)染后72小時，使用Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS)分選表達綠色熒光的細胞，然后放入6孔板繼續(xù)培養(yǎng)10天；
⑷TIANamp Genomic DNA kit(Tiangen)提取DNA進行PCR分析，需要100ng DNA模板和LA Taq(Takara)；
引物序列：
F：5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’(突變位點上游430bp)
R：5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’(突變位點下游243bp)
R wt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)
⑸測序進行驗證基因確定克隆的正確性，最后通過高通量測序進一步驗證。