本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體來說，涉及一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前針對(duì)彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤(DLBCL)的研究均基于細(xì)胞系及各種小鼠模型，具體來說有以下幾種：1)體外傳代的人DLBCL細(xì)胞系；2)在小鼠的B細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因過表達(dá)DLBCL相關(guān)的癌基因如Bcl-6和c-Myc等來誘導(dǎo)DLBCL樣腫瘤產(chǎn)生；3)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等方法感染小鼠骨髓細(xì)胞產(chǎn)生DLBCL腫瘤細(xì)胞,再移植到免疫缺陷型小鼠體內(nèi)的一種動(dòng)物模型。其中，這種以腫瘤細(xì)胞移植免疫缺陷型動(dòng)物制造DLBCL模型是最接近疾病本身的一種研究方法,但目前尚未見人原發(fā)DLBCL細(xì)胞在免疫缺陷型動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定傳代的報(bào)道。

人DLBCL腫瘤細(xì)胞系是原代細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代形成的，在連續(xù)傳代過程中，由于體外培養(yǎng)環(huán)境無法完全模擬體內(nèi)生物學(xué)環(huán)境會(huì)造成細(xì)胞的性狀發(fā)生較明顯的變化。此外，其他模型，如表達(dá)BCL-6和c-Myc等的小鼠模型，尚不能完全模擬人DLBCL細(xì)胞異質(zhì)性等特性，最終均會(huì)導(dǎo)致應(yīng)用研究的失真。

因此，我們需要一種新的方法用于真實(shí)反映DLBCL的疾病特征，為進(jìn)一步研究DLBCL細(xì)胞在體內(nèi)生物學(xué)行為及試制新的治療方法提供一種可靠的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種防錦綸沾色的錦/棉交織物染色方法，與現(xiàn)有整理方法相比，本發(fā)明由本發(fā)明的方法獲得的模型具有穩(wěn)定傳代型腔強(qiáng)的特點(diǎn)，并保持原代DLBCL的生物學(xué)特性，所以比目前廣泛應(yīng)用的其他模型具有更廣闊的應(yīng)用價(jià)值。穩(wěn)定傳代后成瘤周期短(約20天)，發(fā)病后小鼠生命體征穩(wěn)定時(shí)間長(≥22天),所以無論是在從事發(fā)病機(jī)制相關(guān)還是治療相關(guān)的研究中，均能很大程度上反應(yīng)病人體內(nèi)真實(shí)的狀況，使得研究成果的轉(zhuǎn)化有據(jù)可循，并且能夠更加快速地將研究的成果向臨床轉(zhuǎn)化，對(duì)進(jìn)一步開展有臨床應(yīng)用前景的研究有很大價(jià)值。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法，包括以下步驟：(1)接種：將彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤細(xì)胞接種至一NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合 免疫缺陷小鼠；(2)鑒定：明確腫瘤生長大于1～2cm或者在外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞存在后，收集腫瘤組織及細(xì)胞并進(jìn)行鑒定。

所述NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠因其既缺乏T和B淋巴細(xì)胞功能、又有先天免疫缺陷，且不易發(fā)生免疫逃逸的特點(diǎn)，成為是本領(lǐng)域常見的動(dòng)物模型，在醫(yī)藥領(lǐng)域常以NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠作為在體環(huán)境工具，用以進(jìn)行血液病學(xué)、腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。在本發(fā)明中，就是利用所述NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的特點(diǎn)，將其作為腫瘤重建的在體環(huán)境工具進(jìn)而進(jìn)行研究。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述(1)接種步驟采用皮下移植法，將所述彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤組織塊直接移植至小鼠肋腹部；或者將由所述彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤組織塊制得的懸液移植至小鼠肋腹部。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述皮下移植法包括：手術(shù)方法或皮下注射方法。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤組織塊是在無菌條件下將彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤組織剪切為1～2mm而獲得。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述懸液的制備方法包括：(1)在無菌條件下將彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤組織剪切為1～2mm而獲得組織塊；(2)將步驟(1)獲得的組織塊放入IV型膠原酶IMDM溶液中，并在37℃下消化，每1小時(shí)收集細(xì)胞一次，至少收集一次。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述IV型膠原酶IMDM溶液的濃度為1mg/ml。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述方法還包括：(3)傳代：前次接種后，在明確腫瘤生長大于1～2cm或者在外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞存在時(shí)，收集腫瘤組織及細(xì)胞并進(jìn)行接種傳代。

也就是說，在本發(fā)明中，采取兩種接種方法。因此，在本發(fā)明的一較優(yōu)實(shí)施例中，提供一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法，包括以下步驟：

(1)接種：

將新鮮的原代人DLBCL組織以物理方式切碎至1～2mm，以獲得DLBCL組織塊，通過手術(shù)將所述DLBCL組織塊皮下移植至NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的肋腹部；

(2)鑒定：

明確腫瘤生長大于1～2cm或者在外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞存在后，收集腫瘤組織及細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，同時(shí)可進(jìn)行接種傳代；

(3)傳代

傳代接種的方式與步驟(1)的方式相同。

或者，在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中，提供一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法，包括以下步驟：

(1)接種：

將新鮮的原代人DLBCL組織以物理方式切碎至1～2mm而獲得組織塊，將組織塊放入IV型膠原酶IMDM溶液中，并在37℃下消化，每1小時(shí)收集細(xì)胞一次，至少收集一次，從而獲得懸液；優(yōu)選地，收集三次；

通過皮下注射將獲得的懸液皮下移植至NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的肋腹部；

(2)鑒定：

明確腫瘤生長大于1～2cm或者在外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞存在后，收集腫瘤組織及細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，同時(shí)可進(jìn)行接種傳代；

(3)傳代

傳代接種的方式與步驟(1)的方式相同。

本發(fā)明還提供一種由上述方法制得的動(dòng)物模型在建立淋巴瘤干細(xì)胞基礎(chǔ)模型中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種由上述方法制得的動(dòng)物模型在治療淋巴瘤中的應(yīng)用。

異種移植的關(guān)鍵點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)對(duì)象的取材、處理手法和移植宿主的管理、飼養(yǎng)。本研究旨在原有的工作基礎(chǔ)上，通過多部位接種方式分別建立GCB型和ABC型的原代DLBCL體內(nèi)模型，這將是觀察DLBCL細(xì)胞在體內(nèi)與各種基質(zhì)細(xì)胞相互作用、探索DLBCL發(fā)病機(jī)理、區(qū)別DLBCL不同分子類型比較以及開發(fā)新型靶向治療藥物(如抗血管生成類藥物)等方面研究是非常好的研究模型。人們可能通過對(duì)該類模型的研究，對(duì)DLBCL的發(fā)病機(jī)理有更深入更真實(shí)的認(rèn)識(shí)，對(duì)于開發(fā)有效治療藥物有非常大的幫助。因此，該模型比目前廣泛應(yīng)用的其他模型具有更廣闊的應(yīng)用價(jià)值，無論是發(fā)病機(jī)制相關(guān)還是治療相關(guān)的，均能很大程度上反應(yīng)病人體內(nèi)真實(shí)的狀況，使得研究成果的轉(zhuǎn)化有據(jù)可循，并且能夠更加快速地將研究的成果向臨床轉(zhuǎn)化，對(duì)進(jìn)一步開展有臨床應(yīng)用前景的研究有很大價(jià)值。

由本發(fā)明的方法獲得的模型具有穩(wěn)定傳代型腔強(qiáng)的特點(diǎn)，并保持原代DLBCL的生物學(xué)特性，所以比目前廣泛應(yīng)用的其他模型具有更廣闊的應(yīng)用價(jià)值。穩(wěn)定傳代后成瘤周期短(約20天)，發(fā)病后小鼠生命體征穩(wěn)定時(shí)間長(≥22天),所以無論是在從事發(fā)病機(jī)制相關(guān)還是 治療相關(guān)的研究中，均能很大程度上反應(yīng)病人體內(nèi)真實(shí)的狀況，使得研究成果的轉(zhuǎn)化有據(jù)可循，并且能夠更加快速地將研究的成果向臨床轉(zhuǎn)化，對(duì)進(jìn)一步開展有臨床應(yīng)用前景的研究有很大價(jià)值。

附圖說明

圖1是人DLBCL細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤情況；

圖2A和圖2B是來源于人類DLBCL細(xì)胞在嚴(yán)重免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)中的植入情況；

圖3A和3B是各代腫瘤石蠟切片在顯微鏡下形態(tài)；

圖4A至4C是CY原代和各代動(dòng)物模型的腫塊組織CD20、CD3、CD10、Bcl-6、MUM1、Ki-67、Bcl-2免疫組化結(jié)果及比較；

圖5A至5C是ZML原代和各代動(dòng)物模型的腫塊組織CD20、CD3、CD10、Bcl-6、MUM1、Ki-67、Bcl-2免疫組化結(jié)果及比較；

圖6A是原代組織在石蠟切片中用FISH檢測(cè)IgH，IgH/Bcl-2；

圖6B是CY與ZML模型的腫瘤組織在免疫球蛋白重鏈重排檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說明，實(shí)施例旨在解釋而非限定本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1.一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法

在本實(shí)施例中，提供一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法，包括以下步驟：

(1)接種：

將新鮮的原代人DLBCL組織以物理方式切碎至1～2mm，以獲得DLBCL組織塊，通過手術(shù)將所述DLBCL組織塊皮下移植至NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的肋腹部；

(2)鑒定：

明確腫瘤生長大于1～2cm或者在外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞存在后，收集腫瘤組織及細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，同時(shí)可進(jìn)行接種傳代；

(3)傳代

傳代接種的方式與步驟(1)的方式相同。

實(shí)施例2.另一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法

在本實(shí)施例中，提供一種彌漫性大B細(xì)胞型淋巴瘤動(dòng)物模型的建立方法，包括以下步 驟：

(1)接種：

將新鮮的原代人DLBCL組織以物理方式切碎至1～2mm而獲得組織塊，將組織塊放入IV型膠原酶IMDM溶液中，并在37℃下消化，每1小時(shí)收集細(xì)胞一次，至少收集一次，從而獲得懸液；優(yōu)選地，收集三次；

通過皮下注射將獲得的懸液皮下移植至NOD/SCID嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的肋腹部；

(2)鑒定：

明確腫瘤生長大于1～2cm或者在外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞存在后，收集腫瘤組織及細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，同時(shí)可進(jìn)行接種傳代；

(3)傳代

傳代接種的方式與步驟(1)的方式相同。

實(shí)施例3.人DLBCL細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤情況

1.標(biāo)本信息

病例CY：患者為年輕女性，因胃鏡活檢診斷為淋巴瘤，2次CHOP后效果不佳，遂進(jìn)行胃大部切除術(shù)，病理診斷為非霍奇金淋巴瘤，彌漫大B型；隨后患者經(jīng)過7次RCHOP治療，療效不詳，總病程22個(gè)月。

病例ZML：患者為老年女性，因左髖骨穿刺病理診斷為非霍奇金淋巴瘤，彌漫大B型；隨后患者經(jīng)過8次RCHOP治療結(jié)合放療，療效為SD，在病程的第14個(gè)月PET提示復(fù)發(fā)并進(jìn)展，此后接受中藥和放射治療，第20個(gè)月進(jìn)行左腋下淋巴結(jié)活檢術(shù)病理證實(shí)疾病進(jìn)展，總病程21個(gè)月。

2.人DLBCL細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤情況

采用實(shí)施例1的建立方法和實(shí)施例2的建立方法，分別將兩例患者的腫瘤細(xì)胞在手術(shù)后立即移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)。所有移植小鼠體內(nèi)均可產(chǎn)生腫瘤，腫瘤發(fā)生率達(dá)到100％。兩例模型的成瘤情況詳見表1。

表1.人DLBCL細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤的發(fā)生數(shù)

備注：a.非同一天處死2只小鼠模型；b.小鼠模型仍在實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)中，未被處死

實(shí)施例4.流式細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)

在本實(shí)施例中，通過流式細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)，證明移植小鼠體內(nèi)形成的腫塊是來源于人的B細(xì)胞的腫瘤組織。

為了明確腫塊的性質(zhì)，申請(qǐng)人得到組織細(xì)胞懸液后通過7.AAD-設(shè)門來排除死細(xì)胞，Human CD45+/Mouse CD45.1-MHCI-為設(shè)門來排除鼠類細(xì)胞，然后得到>95％的人類細(xì)胞群。通過標(biāo)記CD19,CD20,CD3,CD5表面標(biāo)志，我們發(fā)現(xiàn)這群人類細(xì)胞為CD19+/CD20+/CD3-/CD5-細(xì)胞群體，證實(shí)我們得到的腫塊是來源于B細(xì)胞的腫瘤組織，且傳代后穩(wěn)定顯示表達(dá)B細(xì)胞標(biāo)志。請(qǐng)參見圖2A和2B，其中：圖2A中，以7.AAD-設(shè)門來排除死細(xì)胞(中圖)，Human CD45+/Mouse CD45.1-MHCI-為設(shè)門來排除鼠類細(xì)胞，然后得到>95％的人類細(xì)胞群體(右圖)。圖2B中，在人類細(xì)胞群中，通過標(biāo)記CD19,CD20,CD3,CD5表面抗原標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)這群人類細(xì)胞為CD19+/CD20+/CD3-/CD5-細(xì)胞群體，證實(shí)腫塊是B細(xì)胞來源惡性腫瘤。同時(shí)，兩例模 型的第一代和最后一代(CY目前最后一代是P4,ZML目前最后一代是P3)流式細(xì)胞學(xué)表達(dá)譜相似，證明模型不僅保留了原代腫瘤B細(xì)胞來源的性質(zhì)，而且可以穩(wěn)定傳代。

實(shí)施例5.組織病理學(xué)驗(yàn)證

在本實(shí)施例中，通過病理學(xué)驗(yàn)證，證明移植小鼠體內(nèi)形成的腫塊是淋巴細(xì)胞的腫瘤組織。

請(qǐng)參見圖1，其中，a是正常NOD/SCID小鼠(右)和DLBCL模型小鼠(左)外觀體型上的區(qū)別，箭頭所指為模型小鼠體內(nèi)隆起的腫塊；b是模型小鼠體外測(cè)量腫塊大小>3cm，箭頭所指為小鼠隆起的腫塊；c是處死小鼠后可見體內(nèi)形成的腫瘤組織，它常與周圍組織緊密粘連，累及皮膚、腹膜甚至腹膜內(nèi)組織。箭頭所指為腫瘤組織；d是分離取出的腫瘤組織為相互融合的實(shí)體腫瘤，呈團(tuán)塊狀，無完整包膜，腫瘤直徑為2～4.5cm，腫瘤切面呈粉白色，魚肉樣，組織內(nèi)可見少量血管。

在NOD/SCID小鼠體內(nèi)，DLBCL細(xì)胞移植后的腫瘤為實(shí)體腫塊，解剖觀察腫瘤呈團(tuán)塊狀，界限不清，無完整包膜，與小鼠鄰近組織粘連，不易分離。腫瘤直徑為3.5～4.5cm，腫瘤切面呈粉白色，魚肉樣，組織內(nèi)可見少量血管。(請(qǐng)參見圖1中c和d)

顯微鏡下顯示腫瘤細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞胞核大，超過正常淋巴細(xì)胞的二倍。多數(shù)瘤細(xì)胞核圓形、不規(guī)則或有核裂，染色質(zhì)分散，多個(gè)明顯的核仁(請(qǐng)參見圖3)，胞質(zhì)淺染，量中等。其中，圖3A是HE染色后CY原代及各代動(dòng)物模型腫塊組織的病理學(xué)表現(xiàn)(40倍)。圖3B是HE染色后ZML原代及各代動(dòng)物模型腫塊組織的模型組織病理學(xué)表現(xiàn)(40倍)。

腫塊免疫組織化學(xué)染色結(jié)果總結(jié)如表2。

表2. 2例動(dòng)物模型的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的免疫表型

CY和ZML原代腫塊組織表達(dá)B細(xì)胞抗原，在低倍鏡下可見CD20呈陽性、CD3呈陰性(表2，圖4A)；移植后動(dòng)物模型及傳代后各代腫塊組織也表達(dá)B細(xì)胞抗原，呈現(xiàn)出CD20陽性CD3陰性的結(jié)果(表2，圖4A和圖4C)。Bcl-2基因被認(rèn)為是與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后較為密切的基因。CY和ZML各代組織腫塊Bcl-2均呈陽性表達(dá)(表2，圖5A、5C)。

據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)傳代的過程有惡性增生的傾向^[12]，而兩例原代及各代動(dòng)物模型組織腫塊在Ki-67的表達(dá)上也呈現(xiàn)出陽性率增加的趨勢(shì)(CY模型Ki-67陽性率30～40％-->70～80％，ZML模型Ki-67陽性率50～60％-->60～70％)。

其中，圖4A是CY模型，20倍鏡下CD20呈陽性(左),CD3呈陰性(右)，黑框區(qū)域被放大至40倍(中)。

圖4C是CY模型20倍鏡下可見Ki-67陽性表達(dá)率隨傳代次數(shù)的增加而增加(從左起第1張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從左起第2張圖)；20倍鏡下Bcl-2呈陽性(從右起第2張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從右起第1張圖)。圖4A是CY模型20倍鏡下CD20呈陽性(左),CD3呈陰性(右)，黑框區(qū)域被放大至40倍(中)。圖4C是CY模型20倍鏡下可見Ki-67陽性表達(dá)率隨傳代次數(shù)的增加而增加(從左起第1張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從左起第2張圖)；20倍鏡下Bcl-2呈陽性(從右起第2張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從右起第1張圖)。圖5A是ZML模型20倍鏡下CD20呈陽性(左)、CD3呈陰性(右)，黑框區(qū)域被放大至40倍(中)。 圖5C是ZML模型20倍鏡下可見Ki-67陽性表達(dá)率隨傳代次數(shù)的增加而增加(從左起第1張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從左起第2張圖)；20倍鏡下Bcl-2呈陽性(從右起第2張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從右起第1張圖)。

實(shí)施例6.免疫病理學(xué)檢驗(yàn)

在本實(shí)施例中，通過免疫病理學(xué)證明：移植小鼠體內(nèi)形成的腫塊是DLBCL的腫瘤組織的不同分子亞型。腫塊免疫組織化學(xué)染色結(jié)果總結(jié)如表3。

表3. 2例動(dòng)物模型的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的免疫表型

由表格可知，CY原代腫塊組織CD10表達(dá)陰性而Bcl-6表達(dá)陽性，所以則需用MUM1來分類，而其MUM1表達(dá)陰性，所以為GCB DLBCL(表3，圖4B)；移植后動(dòng)物模型及傳代后各代腫塊組織也呈現(xiàn)CD10陰性，Bcl-6陽性和MUM1陰性，所以我們成功得到了GCB DLBCL動(dòng)物模型并能穩(wěn)定傳代(表3，圖4B)。ZML原代腫塊組織CD10、Bcl-6表達(dá)陰性而MUM1表達(dá)陽性性，所以為non-GCB DLBCL(表3，圖5B)；移植后動(dòng)物模型及傳代后各代腫塊組織也呈現(xiàn)CD10、Bcl-6陰性，MUM1陽性，因此成功得到了non-GCB DLBCL動(dòng)物模型并能穩(wěn)定傳代 (表3，圖5B)其中，圖5B顯示的是：CY模型20倍鏡下CD10(從左起第1張圖)、MUM1(從右起第1張)呈陰性、Bcl-6呈陽性(從左起第2張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從右起第2張圖)。圖5B顯示的是：ZML模型，20倍鏡下CD10(從左起第1張圖)、Bcl-6(從左起第2張)呈陰性、MUM1呈陽性(從右起第2張圖)，黑框區(qū)域被放大至40倍(從右起第1張圖)。

綜上所述，結(jié)合病理學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)果，腫瘤的病理類型符合非霍奇金淋巴瘤，彌漫大B細(xì)胞型。CY病例為GCB型DLBCL，ZML病例為non-GCB型DLBCL。在移植和傳代過程中，兩例病例的移植和傳代動(dòng)物模型不僅保留了原代腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)，而且能夠穩(wěn)定傳代并且符合生物學(xué)特性。

實(shí)施例7.腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)

在本實(shí)施例中，移植小鼠體內(nèi)形成的腫塊具有DLBCL常見的遺傳學(xué)改變。淋巴系統(tǒng)惡性疾病的診斷可由克隆性評(píng)估來支持，遵循與其他惡性腫瘤細(xì)胞起源于同一克隆的定律。98％的淋巴系統(tǒng)惡性疾病包括免疫球蛋白(Ig)(克隆性)和/或T細(xì)胞受體(TCR)重排。與其他一些類型的淋巴瘤不同，DLBCL并沒有統(tǒng)一的特異性細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志。根據(jù)DLBCL生物學(xué)行為與預(yù)后可以將其分成多個(gè)亞組，表明它仍然是一種異質(zhì)性疾病。與其他B細(xì)胞來源的NHL相似，大多數(shù)DLBCL病例有免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的重排。因此，我們運(yùn)用染色體核型分析、FISH和PCR方法，證實(shí)了腫塊為DLBCL在分子水平上的特性。

用位點(diǎn)特異的DNA探針對(duì)原代組織石蠟切片進(jìn)行分子熒光原位雜交(FISH)，正常細(xì)胞中有2個(gè)橘紅色和2個(gè)綠色信號(hào)。沒有t(14：18)易位的細(xì)胞，雜交后表現(xiàn)為兩個(gè)獨(dú)立分開的橘紅色熒光信號(hào)和兩個(gè)獨(dú)立分開的綠色熒光信號(hào)(202G)；但也可以出現(xiàn)三或四個(gè)信號(hào)，由于DNA的濃縮程度不同所致。存在有t(14：18)易位的細(xì)胞中出現(xiàn)一個(gè)橘紅色，1個(gè)綠色信號(hào)和一個(gè)融合后產(chǎn)生的黃色信號(hào)，或出現(xiàn)兩個(gè)融合后產(chǎn)生的黃色信號(hào)。本研究將大于7％的細(xì)胞出現(xiàn)黃色信號(hào)確定為有t(14；18)易位。熒光間期細(xì)胞分析結(jié)果顯示病例CY和病例ZML多數(shù)細(xì)胞有IgH基因重排信號(hào)(圖6A左列)。隨后，我們用各組混合引物以多重PCR方式檢測(cè)移植并傳代后CY P4 和ZML P3腫塊細(xì)胞單克隆重排的表達(dá)，并重復(fù)2次以上。結(jié)果顯示CY P4在FR2區(qū)段出現(xiàn)單克隆性的重排；ZML P3在FR1和FR2區(qū)段出現(xiàn)單克隆性的重排(圖6B)。

國外文獻(xiàn)報(bào)道，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中Bcl-2/IgH基因重排的陽性率可達(dá)30％^[13]，而BCL-2基因重排多見于DLBCL的GCB亞型，并有可能代表GCB亞型中一組具有獨(dú)特基因特征的疾病^[14]。我們運(yùn)用IgH/Bcl-2(雙色，雙融合)探針檢測(cè)到病例CY有IgH/Bcl-2基因重排，而病例ZML未發(fā)現(xiàn)有異常(圖6A左列)。

因此，從細(xì)胞遺傳學(xué)角度表明兩例原代腫瘤的分子分型為GCB和non-GCB DLBCL，且在動(dòng)物模型的腫塊組織上也具有DLBCL的惡性單克??；而單克隆的特異性片段和Bcl-2的表達(dá)是否在動(dòng)物模型上依舊成立需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析。

圖6A是原代組織在石蠟切片中用FISH檢測(cè)IgH，IgH/Bcl-2。圖6B是CY與ZML模型的腫瘤組織在免疫球蛋白重鏈重排檢測(cè)。結(jié)果顯示CY P4在FR2區(qū)段出現(xiàn)單克隆性的重排；ZML P3在FR1和FR2區(qū)段出現(xiàn)單克隆性的重排。

由本發(fā)明的方法獲得的模型具有穩(wěn)定傳代型腔強(qiáng)的特點(diǎn)，并保持原代DLBCL的生物學(xué)特性，所以比目前廣泛應(yīng)用的其他模型具有更廣闊的應(yīng)用價(jià)值。穩(wěn)定傳代后成瘤周期短(約20天)，發(fā)病后小鼠生命體征穩(wěn)定時(shí)間長(≥22天),所以無論是在從事發(fā)病機(jī)制相關(guān)還是治療相關(guān)的研究中，均能很大程度上反應(yīng)病人體內(nèi)真實(shí)的狀況，使得研究成果的轉(zhuǎn)化有據(jù)可循，并且能夠更加快速地將研究的成果向臨床轉(zhuǎn)化，對(duì)進(jìn)一步開展有臨床應(yīng)用前景的研究有很大價(jià)值。

本發(fā)明已由上述相關(guān)實(shí)施例加以描述，然而上述實(shí)施例僅為實(shí)施本發(fā)明的范例。必需指出的是，已公開的實(shí)施例并未限制本發(fā)明的范圍。相反地，包含于權(quán)利要求書的精神及范圍的修改及均等設(shè)置均包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。