專利名稱：彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCR Vβ13亞家族的Y基因序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一個T細胞受體(TCR)的核苷酸序列，特別是指一種彌漫性 大B細胞淋巴瘤(DLBL)相關抗原特異TCRVP13亞家族的Y基因序列。
背景技術：
近年來，非霍奇金淋巴瘤(NHL)發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢。據(jù)估計，21 世紀初，NHL將占侵襲性惡性腫瘤的4.4W，并占所有癌癥死亡數(shù)的4.8%。其 中彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)是最常見的NHL，約占30% 40%，其 中超過60歲的老年患者占70%。20多年來主要采用以CHOP方案(環(huán)磷酰胺、 多柔比星、長春新堿、潑尼松)為主的化療。但對部分老人有毒性作用，長期 生存率低。近期開展的靶向免疫治療如利妥昔單抗(CD20單抗)的出現(xiàn)雖然 取得了新的療效,但微小殘留病變的存在導致的疾病復發(fā)仍然是目前臨床治療 的棘手問題。多年來，各國學者一直在努力尋求更有效的治療方法。臨床腫瘤 學家對特異性的細胞免疫治療寄予厚望。Xue等于報道利用從白血病患分離出 能夠特異識別HLA-A2限制的WT1抗原表位的CTL，將CTL的TCR基因轉 染患者的T淋巴細胞，在小鼠試驗中顯示出轉染細胞的特異殺傷性。隨后Tsuji 等將從進一步證明了利用轉導WT1特異的TCR基因的Thl和Tcl顯示出HLA 限制的的殺傷作用，同時轉染的Thl細胞具有分泌大量IFN-y和IL-2的功能， 由于IFN-y和IL-2在遏制腫瘤中發(fā)揮重要的作用，因而可以通過該轉染相應 的TCR基因的方法對腫瘤的免疫治療發(fā)揮重要的作用。
目前利用腫瘤細胞相關抗原特異的TCR基因修飾正常T細胞(自體的或 供者源T細胞)，從而獲得具有殺傷相應腫瘤細胞的細胞毒T淋巴細胞(CTL)， 這是近年抗腫瘤特異性細胞免疫治療的一個重要發(fā)現(xiàn)?？乖禺怲CR修飾正 常T細胞而獲得特異抗腫瘤T細胞克隆的研究首先在黑色素瘤中展開，隨后 有多個研究擴展了該技術的應用，如特異性抗EB病毒陽性細胞的CTL、抗 WT1的CTL，個別已形成了 TCL產品用于臨床治療。制備CTL產品的關鍵 是明確腫瘤/白血病細胞的相關抗原，從而獲得抗原特異的TCR，進而誘導產
生特異抗白血病/腫瘤的T細胞克隆。目前國內外對淋巴瘤的研究主要集中在 T細胞型淋巴瘤，而對B淋巴細胞淋巴瘤的研究資料較少，主要原因可能是對 B淋巴細胞型淋巴瘤的相關抗原了解得較少有關。

發(fā)明內容
為了克服上述現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供彌漫性大 B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCR Vpl3亞家族的Y基因序列。
本發(fā)明從DLBL患者外周血中存在T細胞受體(TCR) Vp亞家族的克隆 性T細胞，經序列分析顯示其特異性TCR序列的高度可變區(qū)V-NDN-J區(qū)，即 互補決定區(qū)3 (CDR3),與抗原特異性識別結合的部位，表明該克隆性T細胞 所表達的TCR為DLBL相關抗原刺激所產生的特異性TCR，獲得了 DLBL相 關的TCR基因序列。
本發(fā)明公開了針對DLBL相關抗原的特異性TCR的基因序列，尤其是 TCR的高度可變區(qū)即CDR3，后者是T細胞表面受體識別抗原的特異區(qū)域， 針對于不同抗原，除了機體所選用的TCRVP亞家族T細胞不同，更為關鍵的 是其TCR基因的CDR3序列的差異，該部位決定了所屬T細胞所能識別的抗 原。本發(fā)明提供了一種識別DLBL相關抗原的TCR邪13基因序列，由于其 CDR3的特異性，僅來自于單一克隆的T細胞，是一高度特異的序列。同時， 根據(jù)CDR3的基因序列編碼的蛋白質，可用來了解DLBL的相關抗原肽，為 了解DLBL的生物學特性提供資料。
本發(fā)明的另一 目的在于提供上述基因序列的應用。
根據(jù)所獲得的DLBL相關抗原的特異性TCR的核苷酸序列，可以用于(1) 了解DLBL病人所存在的抗DLBL的TCR V卩13亞家族T細胞的情況，用于 評價病人的免疫功能狀態(tài)，(2)通過轉基因技術將DLBL相關抗原的特異性 TCR基因轉入正常T淋巴細胞中，使其強制表達這種特異性的TCR，改變T 細胞內源性TCR識別抗原的原有模式，具備分泌細胞因子和(或)特異殺傷 靶細胞的功能，經體外短期培養(yǎng)擴增即可產生足量的CTL，再回輸入患者體 內使其對DLBL細胞行使靶向細胞免疫效應。
本發(fā)明的目的通過下述技術方案來實現(xiàn) 一種彌漫性大B細胞淋巴瘤 (DLBL)相關抗原特異TCR Vp 13亞家族的Y基因序列，所述基因序列如下
所示CAAGACCCAGGCATGGGGCTGAAGCTGATTTATTATTCAGTTGGTGCTGG
TATCACTGATAAAGGAGAAGTCCCGAATGGCTACAACGTCTCCAGATCA
ACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGGAGTTGGCTGCTCCCTCCCAGA
CATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTATGACAGTCCGGAGACCCAGTAC
TTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTG
TTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCC
ACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGA
CCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGG
GGTCAGCACAo
其中，Y基因序列為402個bp: l-176bp為V區(qū)；177-186bp為NDN區(qū)， 其中178-182bp為D區(qū)；187-229bp為J區(qū)；230-402bp為C區(qū)。
上述彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)相關抗原特異TCR VP 13亞家族的 Y基因序列翻譯的蛋白質(134AA)如下
LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST。
注CDR3區(qū)包括V區(qū)的下游端、NDN區(qū)和J區(qū)的上游端。
上述彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)相關抗原特異TCRVp 13亞家族的 Y基因序列的制備方法，包括如下步驟
a. 收集DLBL患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個核細胞；
b. 提取外周血單個核細胞的RNA， RT-PCR合成cDNA第一鏈；
c. 在NCBI的Genebank中查找TCR p鏈的基因序列，并標出各亞家族的 V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位置；
d. 設計24個Vp特異性上游引物及Cp下游引物；
e. PCR擴增24個Vp亞家族TCR重排時產生的V-NDN-JC區(qū)；
f. CP-Fam標記PCR產物，基因掃描分析T細胞亞家族的表達和克隆性；
g. 將呈單克隆或寡克隆掃描圖的亞家族PCR產物進行切膠純化序列分析。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果 (1)本發(fā)明制備得到了一種獨特的DLBL抗原的相關TCR Vpl3基因序 列，該序列可以作為一種新的抗原識別TCR基因(主要變化區(qū)在于CDR3序
列)補充人類基因庫資料。
(2)該TCR基因可用于研究DLBL的特異性免疫診斷和治療。 上述彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCR Vpl3亞家族的基因序列
后， 一方面可用于進一步檢測病人體內所存在的TCR Vpi3亞家族T細胞的情
況，以評價其細胞免疫功能狀態(tài)，另一方面是應用在制備彌漫性大B細胞淋
巴瘤分子靶向過繼性免疫細胞治療研究方面。
前者的檢測所采用技術與上述檢測TCR基因的技術相同，通過不同時間
點的分析，可以了解病人所存在的TCRVP13亞家族T細胞的情況，用于了解
病人的免疫狀態(tài)。
后者主要通過轉基因技術將DLBL相關抗原特異的TCR基因修飾自體或 異基因正常T細胞，這些經過修飾的細胞就可提供對抗確定的腫瘤特異性抗 原的T細胞反應性，從而具備了發(fā)揮相應特異性識別殺傷DLBL細胞的細胞 毒活性，可以制備特異性抗DLBL細胞的CTL產品。國外有相關的動物實驗 研究提示這類技術有可能發(fā)揮特異性的免疫治療效果。本發(fā)明所提供的TCR 基因的應用最終目的是通過對DLBL患者進行特異性免疫治療，從而提高療 效，清除微小殘留病變，減少疾病治療后復發(fā)提高長期生存率，改善病人的生 存質量等，是具有很大的市場推廣應用價值和和較大的社會經濟效益。


圖1為DLBL相關抗原特異TCR Vpl3亞家族的基因掃描圖。 A為TCRVpl3亞家族單克隆圖；B為TCRV(313亞家族雙克隆圖；C為 TCRV卩13亞家族多克隆圖；D為TCRV卩13亞家族寡克隆圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方 式不限于此。
實施例
(一)抗原特異性TCR基因序列的分析 分析TCR Vp基因譜的CDR3的長度和堿基序列的方法很多，常用的方法 是利用RT-PCR—基因掃描方法分析TCR VP 24個亞家族的CDR3長度。首先
收集DLBL患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個核細胞，留取1*107個 PBMCs(外周血單個核細胞)提取RNA， RT-PCR合成cDNA。同時，在NCBI 的基因庫中査找出TCR |3鏈的基因序列，并標出各亞家族的V區(qū)及C區(qū)在基 因組中的位置。根據(jù)Vp24個亞家族基因的cDNA設計相應的24個Vp特異 性上游引物，并在CP區(qū)設一Q3下游引物，利用PCR技術擴增患者24個VI3 亞家族TCR重排時產生的V-NDN-JC區(qū)。如圖1所示，熒光素Fam標記各亞 家族PCR產物的CP區(qū)，基因掃描分析T細胞各亞家族的表達，根據(jù)不同位 置，高度和形態(tài)的峰，表示產物的大小、量和均一性，從而確定T細胞克隆 性(一般情況下，正常轉錄的每個VP亞家族包含8 10個峰，即8 10個不 同克隆的T細胞；主峰的出現(xiàn)表明相同大小cDNA的過度擴增，單峰表明產 物中DNA片斷大小相同，均存在寡克隆或單克隆T細胞群，三者分別提示產 物來自多克隆、寡克隆和單克隆的T細胞)?；驋呙杞Y果發(fā)現(xiàn)患者的Vp13 亞家族T細胞呈明顯單克隆；將Vpl3亞家族的PCR產物切膠純化，序列分 析發(fā)現(xiàn)了 Vpl3亞家族TCR的基因序列及其CDR3區(qū)(V-NDN-J區(qū))，即為與 淋巴瘤相關抗原特異性結合的部位。
彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)相關抗原特異TCR Vp 13亞家族的Y 基因序列的制備方法
1、 分離外周血單個核細胞
(1) 取淋巴細胞分離液(Ficoll，密度1.077) 4mL加入離心管內，將稀 釋后的抗凝外周血標本混懸液平鋪于分離液之上，以水平離心機，2000rpm， 離心15分鐘。
(2) 吸取中間單個核細胞層轉移至另一離心管內，再加入5mL1640液， 輕輕吹打，以1500rpm,離心洗滌10分鐘，棄上清，加入1640液至2mL，混 勻后計數(shù)，并用同樣的方法洗滌兩次，按2xl(f/mL調整細胞濃度備用。
2、 RNA提取(TRIzol試劑盒方法提取法)
(1) 將已加入TRIzol試劑—2(TC凍存的細胞取出，置冰上解凍，混勻后 加入0.2統(tǒng)氯仿，充分混勻，4°C， 14000rpm離心30分鐘。
(2) 吸取上層液至另一離心管，加入0.5mL異丙醇并混勻，室溫靜置IO 分鐘后4°C ， 14000 rpm離心30分鐘。
(3) 去上清，并用lmL75X乙醇(一2(TC)洗兩次(2 8t:， 14000rpm)， 每次混勻30秒后，離心IO分鐘。
(4) 去上清，再離心2 3分鐘，去除剩余的乙醇，置于超凈臺上自然干 燥1 1.5小時。加入超凈水(20 5(HiL)溶解。
(5) 于紫外線分光光度儀中檢測樣品的純度和含量，0.8%瓊脂糖凝膠電 泳檢測RNA的完整性和質量。
(6) RNA保存RNA樣品加入其0.1倍容積的3mol/LNaAC (醋酸鈉) 和2倍容積的乙醇后，保存于一80'C備用。
3、 cDNA合成
(1 )應用六聚體隨機引物和反轉錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。lpg RNA 加入16.5^iL預先配制的混合液其中包括7^L H20、 2^L10xPCR-Buffer、 2^L 0.lmmol/L DTT、 5pL 2.5mmol/L dNTP和0.5pL Rand.Hexmer。
(2) 于73°C 3分鐘后，置于冰中30秒。低溫高速離心30秒置于冰中2 3分鐘。
(3) 加入0.6|iL Rnasin G3U/pL)和0.5jjL Superscript (200U/mL)后， 低溫高速離心30秒。
(4) 室溫靜置10分鐘；42°C， 40分鐘以上；83°C， 5分鐘，—2(TC保存
備用o
4、 cDNA合成質量檢測
將所有樣本的cDNA經PCR檢測P2M基因(引物序列見表l)而確定其 合成質量?？偡磻w系20pL,其中上下游引物0.5nmol/L, dNTP 0.1mmol/L， Taq聚合酶l.OU， MgCL2 1.5mmol/L， 10xPCR緩沖液2pL， cDNA產物l^iL 和dH20，同時設置陽性和陰性對照。在德國BiometraPCR擴增儀中進行PCR反應。
反應條件94aC 1分鐘(首次3分鐘)，58°C 1分鐘，72°C 1分鐘(末次 6分鐘)，共35個循環(huán)，最后保存于4t!中。取8^LPCR產物以1.5% (w/v) 瓊脂糖凝膠進行電泳，p2M陽性者可進一步研究，陰性者視為無cDNA合成， 棄去不用。
5、 PCR擴增TCRVp24個亞家族
以24個TCR VP亞家族基因設計相應的特異性上游引物，并在Q3區(qū)設 計一下游引物(引物序列見表l)。 PCR按常規(guī)方法進行?？偡磻w系20ML， 其中含任一V卩引物(24個VP亞家族之一)和C卩引物0.5pmol/L，余同上。
反應條件94'C、 1分鐘(首次3分鐘)，60°C、 1分鐘和72°C、 1分鐘(末
次6分鐘)，共進行40個循環(huán)，最后PCR產物保存于4°C中。取8^L PCR產 物電泳分析結果。
6、 t細胞克隆性分析
(1) 標記PCR產物
IO^iL的反應體系含2.5mL未標記的pcr產物、0.15pmol/L Cp-fam引物、 1.5mmol/LMgCl2， O.lmmol/L dNTP， 0.75UTaq聚合酶，1^iL10xPCR緩沖液 和膽20。 PCR共進行35循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C、 l分鐘(首次3分鐘)， 66°C、 1分鐘和72'C、 l分鐘(末次6分鐘)，最后PCR產物保存于4t:中。
(2) 基因掃描樣品配制
熒光素標記的PCR產物(2pL)加入高質量的去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)與Genescan-500 LIZ分子量標準品按20 : 1比例配好的10^L混 合液中。
(3) 基因掃描(按操作指南進行)
1) 按操作指南準備好儀器并更換水和緩沖液。
2) 灌膠灌膠前2小時從4t:冰箱取出POP-4 (Performance Optimized Polymer-4)膠回溫1 2小時，把膠液抽進貯膠5mL針筒中(抽取的mL數(shù)約 為0.5+0.07 x做樣次數(shù))，倒置排出針筒內氣泡，裝緊針筒。
3) 上樣將備好的樣品于94-C變性4分鐘，然后立即放置冰上冷卻2分 鐘。變性后的樣品加入96孔板，直接裝載到3100遺傳分析儀進行電泳。
4) 運行自動進樣器會自動把樣品板移到要分析的4個樣品的位置，電 泳過程中CCD檢測器把熒光信號轉換為電信號并把它傳送給安裝了 3100數(shù)據(jù) 采集軟件的計算機工作站。
5) 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理完成后就存貯在計算機的數(shù)據(jù)庫里并以電泳信號 圖的形式顯示出來。電泳信號圖的X軸表示時間，Y軸表示相對熒光強度， 每個圖中同時畫出幾種用于標記DNA片斷的熒光素信號，電泳信號圖中的每 個峰代表一個DNA片斷。完成處理的數(shù)據(jù)被自動地從數(shù)據(jù)庫中提取并進行分 析。
6) 結果分析打開GeneMapper SoftwareTM v3.5，將保存于計算機硬盤 數(shù)據(jù)庫中的原始數(shù)據(jù)加進分析軟件，分析產物的長度和熒光素強度。
7、 核苷酸序列分析
(1) E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PCR產物1) 切膠將PCR產物全部加入1 2M的瓊脂糖凝膠的加樣孔，當電泳至 足以分離目的DNA時，于紫外燈下用干凈的手術刀切下含有目的條帶的瓊脂 糖凝膠塊，切下的凝膠塊置于1.5mL離心管中。
2) 按E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒說明進行PCR產物的純化，先加入500 Binding Buffer, 55 65°C孵育至凝膠塊完全溶解；凝膠溶解液加入HiBind DNA spin-column中高速離心去廢液后，再依次加入300 ^iL Binding Buffer、 700 SPW Buffer洗膜；高速離心甩干spin-column的濾膜后，加入30DNAElution Buffer (加于濾膜上)，室溫靜置5 min，高速離心1 min后可得純化的PCR產 物。
3) 取3 mL純化后的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察純化效果； 剩余的PCR純化產物真空冷凍干燥濃縮約20 min至10 左右。
(2) BigDye標記
用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit標記純化后的PCR產物， 反應體系為BigDye Terminator 1 pL、相應單向引物(2Mmol/L) 1.6 ^iL、純 化后PCR產物2.4 nL，反應條件96°C 1 min， (96°C 10 sec、 50°C 5 sec、 60°C 4 min) 25個循環(huán)。
(3) 測序
將標記好BigDye的5 體系的測序產物補水至20 pL，轉入1.5 ml的離 心管，再依次加入2 jjL 3 MNaAc(pH 5.2)、2 125 mMEDTA-Na2、50 95% 乙醇，旋渦振蕩后室溫下避光放置15 min; 5415型高速臺式離心機2800 g離 心20min，沿離心沉淀物的對側小心吸取上清并棄去，加入250 70%冰凍 乙醇，2800g離心5min，棄上清；將管蓋打開置于加熱板上，94 95°C 1 min 使其干燥。加入10 mL高質量的去離子甲酰胺，反復吹打混勻，轉入0.2 nL 的PCR管內，在PCR儀上95。C變性4 min，然后迅速置冰中冷卻至少4 min 后，裝載到3100DNA序列分析儀上進行毛細管電泳。
表1 RT-PCR實驗所涉及的弓I物序列
引物_&_
Vpl 5'-CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC V|32 5'-GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA V卩3 5'-CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC ， 5，-TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA V卩5_ 5，-AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC
V|365 ，-TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG
邪75 '曙CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC
Vp85 '-CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC
V卩95 '-TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC
V卩IO5，-CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC
V卩l(xiāng)l5 ，-TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA
，25 '-TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC
V|3135 ，-CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA
V卩145，-GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC
V(3155' -CAGGC AC AGGCTAAATTCTCCCTG
V卩165 ，-GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG
V卩175'-CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC
邪185 '-TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA
V卩195，-TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA
Vp205 '-AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC
邪215'-TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT
，25'-AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA
，35'-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA
，45 ，-CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC
cp5，-CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG
Cp-Fam5 '-Fam-CAC AGCGACCTCGGGTGGG
fc-M5'5，-TACACTGAATTCACCCCCAC
卩2-M3'5 ，-CATCCAATCCAAATGCGGCA
(二)抗原特異TCR基因轉導技術 1、重組質粒TCRV卩13 (Y) -pIRES的構建'
(1)目的基因的擴增 根據(jù)DLBL相關TCR Vpi3亞家族基因序列(包括完整的CDR3區(qū))設 計引物，擴增病人樣本中的TCR Vpl3基因序列的上游引物上帶有Xho I酶切 位點、下游引物上帶有EcoRI酶切位點(與真核表達載體pIRES中的插入位 點A的酶切位點相對應)。按BD Advantage 2 PCR試劑盒說明書進行PCR 反應PCR總反應體系50 ^L，其中含10XBD Advantage 2 PCRBuffer、上下 游引物各0.5 ]Limol/L、 dNTP Mix 0.2 mmol/L、 50XBD Advantage 2 Polymerase Mix、超純水和1 cDNA模板，同時設置陽性和陰性對照。反應條件94 °C 1 min (首次為3 min)、 60°C 1 min、 72 °C 2 min (末次為7 min)，共35 個循環(huán)。擴增產物用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳迸行鑒定。
(2)重組質粒的構建
A、 ￡2且八.凝膠回收試劑盒純化目的基因1^11￥卩13的？01產物(同第一 部分，步驟7);
B、 將真核表達載體pIRES與純化后的TCR Vpl3 PCR產物分別用Xho I酶 切，體系為①TCRVI313PCR產物28nL、 Tango buffer 8 pL、 Xho I內切 酶ljiL、超純水3pL;②pIRES載^4^L、 Tango buffer 8 fiL、 Xho I內切酶 lpL、超純水27nL;混勻后置于37。C水浴3h;
C、 純化XhoI酶切后的pIRES載體和TCRVpi3PCR產物；
D、 將已純化好的Xho I酶切后的pIRES載體和TCR V|313 PCR產物分別再 用EcoR I酶切，體系為①TCRV卩13 PCR產物(Xho I )28 nL、 TangoTMbuffer 8 nL、 EcoR I內切酶l nL、超純水3 juL;②pIRES載體(Xho I ) 28 pL、 Tango buffer8nL、 EcoR I內切酶l ^L、超純水3 ^L;混勻后置于37。C水浴3 h;
E、 雙酶切后的pIRES載體和TCRVpl3PCR產物進行連接反應體系為 10XT4bufferl pL、 T4DNA酶l^iL、雙酶切后的pIRES載體2 ^L、雙酶切后的 TCRVpl3 PCR產物6pL，混勻后置于16。C過夜；
F、 轉化①將連接產物(10pL)加入感受態(tài)大腸桿菌DH5a (1.5 mL離 心管，100pL菌液，一7(TC保存，北京Tiangen公司)中，輕輕混勻，置冰中 30min;②42。C熱休克90s，迅速置冰中3 min;③加入SOC培養(yǎng)基800 jiL，置 干燥恒溫振蕩箱中37i: 180 200rpm振搖60min;④菌液用玻璃推鋪于1.50/0 LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100ng/mL)上，置37。C孵箱過夜培養(yǎng)；
G、 隨機挑選10個菌落，分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中， 37°C 180rpm振搖培養(yǎng)過夜，PureLinkm超純質粒提取試劑盒抽提質粒(5415 型臺式高速離心機)①3000rpm室溫下離心菌液15min，去上清；②加入250 nL含RNase A的Resuspension Buffer,重懸細菌；③加入250 pL Lysis Buffer, 輕輕混勻，室溫下放置5min;④加入350 jxL Precipitation Buffer,立即振蕩混 勻；⑤以11400rpm離心10min后，將上清液轉移至Mini column中，11400rpm 離心lmin，去廢液；⑥加入700nL Wash Buffer, 11400 rpm離心l min，去廢 液；⑦再以11400rpm離心lmin后，將Mini column放入一新的1.5mL離心管中， 加入75nL預熱65。C的TE Buffer,室溫下放置3 min， 11400 rpm離心2 min，所 收集的溶液即為富含質粒溶液；
H、提取質粒DNA后用XhoI和EcoRl雙酶切鑒定，同時在pIRES載體的 IRES區(qū)設計一下游引物IRES-R (5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3')，結 合pIRES載體上游的T7公共引物(5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3')進行 PCR鑒定，PCR反應體積為25 nL，包括0.1mmol/LdNTP、 1.5UTaq聚合酶、 10XPCR緩沖液、1.5mmol/LMgCl2和超純水，引物濃度均為0.4nmol/L，以l : 500稀釋的質粒DNA 1 nL作為模板。PCR擴增條件為94'C 3 min， (94°C 30 s， 60°C lmin， 72°C 2min， 35個循環(huán))，72°C 5 min;酶切產物及PCR擴增產 物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。篩選出陽性克隆，再對其進行雙向測序鑒 定，證實為本發(fā)明特異基因序列(彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCR VJ313亞家族的Y基因序列)后擴增陽性克隆并提取質粒，從而獲得特異性CTL 相關的TCRVpi3-pIRES質粒。用紫外分光光度計測定重組質粒的濃度。
2、 脂質體介導的重組質粒TCRVpi3-pIRES轉染
(1)脂質體Lipofectamine頂2000轉染A549細胞株、Molt4細胞株 轉染A549細胞株①將處于對數(shù)生長期的A549細胞株以4X1()S個細胞 /孔的密度，加入2 mL無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基，接種6孔培養(yǎng)板； ②取TCRVpl3-pIRES重組質粒(4嗎)置于1.5mL離心管中，加入無血清 無抗生素的IMDM培養(yǎng)基至250 ^L，輕輕混勻；③取15 脂質體 Lipofectamine 2000置于1.5 mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM 培養(yǎng)基至250 pL，輕輕混勻后室溫下孵育5 min;④將②和③混勻后，室溫 下孵育20 min;⑤將④加入①的A549細胞培養(yǎng)基中(轉染平行2孔)，另 設1孔轉染pIRES空載體作為陰性對照，具體操作方法同轉染重組質粒；置 于37-C、 5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后全量換液為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后加 G418進行篩選(終濃度600 pg/mL)，每4天換一次培養(yǎng)基，同時加入相同 濃度的G418，在此篩選條件下培養(yǎng)20d可得到穩(wěn)定表達細胞系。轉染Molt4 細胞株將處于對數(shù)生長期的Molt4細胞株以2X10S個細胞/孔的密度接種6 孔板，取4 pg TCR V卩13-pIRES重組質粒和脂質體Lipofectamine 2000混合 后轉染Molt4細胞株，方法同轉染A549細胞株。
3、 重組質粒轉染后TCRVpl3基因表達的鑒定
(1) RT-PCR和實時定量PCR檢測TCR Vj313 mRNA的表達 轉染7天后，各孔收集3乂106細胞(A549細胞株需胰酶消化)，用TRIZol 試劑盒和SurperScriptII逆轉錄試劑盒分別提取總RNA、合成cDNA，經PCR擴
增管家基因p2M檢測cDNA的合成質量(同第一部分，步驟7);用相應的TCR V卩13引物以及相應的CP引物進行PCR擴增，轉染空載體組作為陰性對照，PCR 擴增體系和擴增條件同前所述。
(2)間接免疫熒光法和流式細胞儀檢測重組質粒的表達 轉染10天后，收集1X10嘲胞(A549細胞株需胰酶消化)，用0.1mol/L 的PBS洗滌細胞兩次后，標記大鼠抗人TCRVP單抗(一抗，1 : 100稀釋)， 37"孵育lh; PBS洗滌細胞三次后，標記FITC-兔抗大鼠IgG抗體(二抗，1 : 50稀釋)，37。C孵育lh; PBS洗滌細胞三次后，在熒光顯微鏡下觀察重組質粒 在轉染后細胞株中的表達情況；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVP13單抗標記， 37T:孵育30 min， PBS洗滌細胞一次后用流式細胞儀進行流式檢測重組質粒的 表達。
(3 )點印記雜交和Western Blot檢測TCR Vpl3蛋白的表達 轉染20天后，收集2乂106穩(wěn)定表達重組質粒的細胞，用RIPA蛋白提取試 劑盒提取總蛋白，真空冷凍干燥濃縮后考馬斯亮蘭法定量；同樣提取臍血細胞 (TCRVpl3亞家族表達均陽性)的蛋白作為陽性對照，轉染空載體的細胞的 蛋白為陰性對照。 1)點印記雜交
A、 取NC膜2cmX4cm，劃分小格，用微量加樣槍分別點膜，重組質粒組、 陽性對照組、陰性對照組的蛋白樣品分別點3次，每次l mL;進行2個平行反應；
B、 用bloeking Reagent封膜4 h后用wash buffer洗絳2次，每次—5 min;
C、 加入l : 500的大鼠抗人TCRVP13單抗(用blockingReagent稀釋)，4 °C孵育過夜后用wash buffer洗滌2次，每次5 min;
D、 加入l : 500的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫 孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5 min:
E、 將NC膜浸入DAB底物液(避光)顯色。 2) Western Blot
A、 SDS-PAGE電泳將轉染重組質粒組的濃縮蛋白樣品、陽性對照和陰 性對照分別加樣于15c/。SDS-PAGE膠(每孔上樣約100fig)，以PageRuler Prestained Protein Ladder為預染marker，進行3個平行反應；用恒壓60V電泳30 min后，改恒壓100Vlh;
B、 分離其中1個平行反應的SDS-PAGE膠，用考馬斯亮蘭染色后，用冰乙
酸甲醇洗脫液反復漂洗直至有清晰條帶顯出；
C、 轉膜PVDF膜預先用甲醇浸泡lmin,再浸泡到轉膜液中備用；切好 的濾紙和海綿也浸泡到轉膜液中IO min;將切下的另2個平行反應的SDS-PAGE 膠與相應的PVDF膜放入轉膜液中浸泡片刻；將海綿一濾紙一PVDF膜一 SDS-PAGE膠—濾紙—海綿依次放到陽極板上，膠大小==膜>濾紙；用4"C預冷 的轉膜液，恒壓40V，卯min (濕轉)；
D、 封膜用blockingReagent封膜4h后用washbuffer洗滌2次，每次5min;
E、 檢測人p-actin蛋白(內參照)的表達將其中1個平行反應的PVDF膜 加入l : 800的小鼠抗人卩-actin單抗(用blocking Reagent稀釋)，4。C孵育過夜 后用washbuffer洗滌2次，每次5min;加入l : 1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(用 blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h,用washbuffer洗滌3次，每次5min;
F、 檢測目的蛋白TCR邪13的表達將另1個平行反應的PVDF膜加入1 : 800的大鼠抗人TCRVP單抗(用blockingReagent稀釋)，4t:孵育過夜后用wash buffer洗滌2次，每次5min;加入l : 1000的HRP-兔抗大鼠lgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5min;
G、 化學發(fā)光法顯影在暗室中將PVDF膜轉入LumiGLO Working Reagent 中，室溫孵育3min;用鑷子將PVDF膜取出，瀝去多余的試劑；將PVDF膜放 入塑料薄膜中，要保iflEPVDF膜與塑料薄膜之間沒有氣泡；將含有PVDF膜的 塑料薄膜放AX線曝光暗盒中，壓上X線膠片(曝光30s)，常規(guī)顯影、定影后 得到顯影的X線膠片。
4、重組質粒TCRVP13，IRES轉染正常人T細胞，構建特異性CTL
(1) 重組質粒TCRVpi3-pIRES轉染正常人T細胞 將處于對數(shù)生長期的正常人T細胞以2 X106個細flfe/孔的密度接種6孔板，
取4 ng TCR V卩13-pIRES重組質粒和脂質體Lipofectamine 2000混合后轉染 正常人T細胞，操作方法同前所述，培養(yǎng)擴增后得到表達抗原特異性CTL相 關TCRVpl3基因的T細胞，并檢測驗證重組質粒的表達(方法同前)。
(2) 細胞毒活性實驗
以乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測試劑盒分別在轉染后 第1周、第3周進行細胞毒性試驗，操作按說明進行。分別以轉染重組質粒的 正常T細胞、轉染空載體的正常T細胞為效應細胞，以DLBL細胞株、Raji 細胞、Molt4細胞(陰性對照)為靶細胞，另設未轉染質粒的正常T細胞為空
白組。效靶比為10:1，靶細胞濃度1Xl(/個細E/孔，每組3個復孔；置U 型96孔培養(yǎng)板內，稍離心2500rpm30s,以促進效、靶細胞之間接觸，于37 °C、 5%032飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h;用1000 rpm離心5 min,吸取上清100 HL加入平底酶標板中，加入100 nLLDH底物反應液，室溫下避光作用30min， 每孔加50 hL 1 mol/L鹽酸終止酶促反應；Elx-800酶標儀測定光密(optical density, OD)值，測定波長490nm，參考波長670nm。
CTL細胞毒活性計算公式 CTL活性(％) -(實驗組OD值一效應細胞自然釋放組OD值一靶細胞自然 釋放組OD值)/ (最大釋放組OD值一靶細胞自然釋放組OD值)。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
SEQUENCE LISTING <110>暨南大學，廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院
<120>彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVe 13亞家族的Y基因序列 <130> 30 <160> 2
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCR V P
13亞家族的Y基因序列 <400> 1
caagacccag gcatggggct gaagctgatt tattattcag ttggtgctgg tatcactgat 60 aaaggagaag tcccgaa^g ctacaacgtc tccagateaa ccacagagga tttcccgctc 120 aggctggagt tggctgctcc ctcccagaca tctgtgtact tctgtgccag cagttatgac 180 agtccggaga cccagtactt cgggccaggc acgcggctcc tggtgctcga ggacctgaaa 240 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 300 caaaaggcca cactggtatg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 360 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca ca 402
<210> 2 <211> 134 <212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223>彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCR V P
13亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質 <400> 2Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Lys Leu lie Tyr Tyr Ser Val Gly Ala 15 10 15
Gly lie Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg
20 25 30
Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Glu Leu Ala Ala Pro Ser
35 40 45
Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Asp Ser Pro Glu Thr
50 55 60
Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys 65 70 75 80
Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu
85 90 95
lie Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe
100 105 110
Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val
115 120 125
His Ser Gly Val Ser Thr 130
權利要求
1、一種彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVβ13亞家族的Y基因序列，其特征在于所述基因序列如下CAAGACCCAGGCATGGGGCTGAAGCTGATTTATTATTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGATAAAGGAGAAGTCCCGAATGGCTACAACGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGGAGTTGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTATGACAGTCCGGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACA。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCR VP 13亞家族的Y基因序列，其特征在于所述彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異 TCRV卩13亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質如下YFCASSYDSPETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAWEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個針對彌漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原的特異性T細胞受體的核苷酸序列。通過RT-PCR基因掃描分析發(fā)現(xiàn)DLBL患者外周血中TCR Vβ13亞家族呈明顯單克隆，其PCR產物進行序列分析，發(fā)現(xiàn)了特異性TCR序列的V-NDN-J區(qū)，即互補決定區(qū)3，是和抗原特異性識別結合的部位，表明該克隆性T細胞的TCR為DLBL相關抗原刺激所產生的特異性TCR。它是通過TCR轉基因技術進行DLBL分子靶向的過繼性免疫治療的基礎和關鍵。該特異性TCR的核苷酸序列為進一步開展針對淋巴瘤的特異性細胞免疫治療的一個重要發(fā)現(xiàn)。
文檔編號C12N15/12GK101182518SQ20071003134
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月9日 優(yōu)先權日2007年11月9日
發(fā)明者葉靜梅, 尹青松, 萡 李, 李揚秋, 楊力建, 獲 譚, 陳少華 申請人:暨南大學;廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院