專利名稱：Eb病毒特異性tcr基因相關(guān)的重組質(zhì)粒及構(gòu)建抗ebv特異性ctl的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于血液腫瘤中抗病毒和抗腫瘤免疫技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種 EBV (EB病毒，Epstein Barr virus)特異性TCR (T細(xì)胞受體，T cell receptor) 基因相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCR Vpi重組質(zhì)粒，及其轉(zhuǎn)導(dǎo)正常T細(xì)胞獲得 抗EBV特異性CTL (cytotoxic T cells,細(xì)胞毒T細(xì)胞)的方法。
背景技術(shù)：
EB病毒(Epstein Barr virus, EBV)與淋巴組織的惡性腫瘤密切相關(guān)。誘 導(dǎo)產(chǎn)生抗EBVl中瘤細(xì)胞的EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T cells, CTL)，發(fā)揮其抗腫瘤或抗病毒特性，能有效地清除EBVl中瘤細(xì)胞，對(duì)于EB 病毒相關(guān)腫瘤的治療有著良好的應(yīng)用前景。但是，單純擴(kuò)增供者的特異性細(xì)胞 毒T細(xì)胞，往往來(lái)源受限或者量效不足；國(guó)外有利用導(dǎo)入自殺基因或基因修 飾樹(shù)突狀細(xì)胞作為瘤苗來(lái)進(jìn)行HSCT后腫瘤免疫治療，取得了一定成效，但操 作較為耗時(shí)繁瑣，難以推廣。
從正常人T細(xì)胞中誘導(dǎo)出特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞治療相應(yīng)的疾病在國(guó)外已 經(jīng)有所開(kāi)展，抗原特異細(xì)胞毒T細(xì)胞如EBV-CTL的應(yīng)用已進(jìn)行了小規(guī)模的I 期臨床研究；而體外TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)病人T細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞毒T細(xì)胞的可 行性已在黑色素瘤治療中得以證實(shí)，國(guó)外也有研究證實(shí)識(shí)別EB病毒抗原LMP 的TCR基因轉(zhuǎn)染后，可形成特異性抗EBV"細(xì)胞的細(xì)胞毒T細(xì)胞，但由于逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用而限制了應(yīng)用性。
誘導(dǎo)產(chǎn)生抗EBVl中瘤細(xì)胞的EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞，能有效地清 除EBVl中瘤細(xì)胞，對(duì)于EB病毒相關(guān)腫瘤的治療有著良好的應(yīng)用前景。但是， 既往依靠單純擴(kuò)增供者的特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞，往往來(lái)源受限或者量效不足； 國(guó)外有利用導(dǎo)入自殺基因或基因修飾樹(shù)突狀細(xì)胞作為瘤苗來(lái)進(jìn)行HSCT后腫 瘤免疫治療，取得了一定成效，但操作較為耗時(shí)繁瑣，難以推廣。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種EB 病毒特異性TCR基因相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCR Vpi重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一目的在于提供利用上述TCR Val5-pIRES-TCR Vpi重組質(zhì) 粒構(gòu)建抗EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的方法。
本發(fā)明利用EB病毒抗原肽獲得病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆，進(jìn)行T 細(xì)胞克隆性分析后，將EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的TCR Val5和V卩l(xiāng)基因轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，構(gòu)建TCR Val5-pIRES-TCR Vpi重組質(zhì) 粒，再通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將特異性TCR Val5-pIRES-TCR Vpi質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì) 胞，從而得到大量EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞。
本發(fā)明是用識(shí)別EB病毒相關(guān)抗原BMLF (裂解蛋白BMLF， BamH fragment M leftward reading frame)的TCR Val5和TCR Vpi雙基因同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo) 來(lái)獲得特異性識(shí)別EB病毒抗原的高效細(xì)胞毒T細(xì)胞，采用更為安全和高效的 轉(zhuǎn)染方式，具有較高的可行性。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì) 胞克隆相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCR Vpi質(zhì)^^轉(zhuǎn)導(dǎo)至外周血T細(xì)胞中，常規(guī) 培養(yǎng)擴(kuò)增后可獲得特異性識(shí)別EB病毒相關(guān)抗原的高效細(xì)胞毒T細(xì)胞，這種特 異性細(xì)胞毒T細(xì)胞具有更多的可操作性和通用性。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種EB病毒特異性TCR基 因相關(guān)的TCRVal5-pIRES-TCRVpi重組質(zhì)粒，其特征在于所述TCRVal5-pIRES-TCRVpi重組質(zhì)粒是由TCRVal5基因、pIRES載體和TCRVpi基因組 成，所述TCRVal5基因序列如下
ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCT GGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGT GTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCT CCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAG TTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACT CACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAG ACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGAacctATACA GCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAGATATC CAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCA CAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACAT GAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAACAA
ATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACACAGCATTATTCCAAAAGACA
CCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAA
AAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATT
GGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGAC
GCTGCGGTTGTGGTCCAGC;
所述TCRVal5基因序列共810bp。其中
V區(qū)為ATGAAGACATTT..........................TGTGCAGAGA;
J區(qū)為ATACAGCACCCTC............................CTTCTAGTCTCTCCAG;
C區(qū)為ATATCCAGAACC.........................GGTTGTGGTCCAGC;
其中CDR3區(qū)為
氨基酸序列CAENLYSTLTF 核苷酸序列 tgt gca gag aac eta tac age acc etc acc ttt 重排方式Val5 (又命名為:Va5*01) _N—Jall*01—Ca。
所述TCR Vpl基因序列如下
ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGC AGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACA GCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACC TCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCT CATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAA CGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGA GCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTA
ACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGC
CATCAGAAGCAGAGATATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCT
GGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAAT
GGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAG
GAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGA
GGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCA
AGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGG
GCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCA GACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCA CCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTG GTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAG GC;
所述TCR Vpl基因序列共930bp。其中
V區(qū)為ATGGGCTTCAGGC...................GCCAGCAGCGTAG;
D區(qū)為CGGGAGGG;
謳為ACGAGCAGTAC........................GGGCCGGGCAC;
C區(qū)為AGGACCTGAAAA........................ATTCCAGAGGC;
其中CDR3區(qū)為
氨基酸序列CASSVAGGDE QYF 核苷酸序列 tgt gcc age age gta gcg gga ggg gac gag cag tac ttc 重排方式V卩l(xiāng) (又命名為Vp981801) —DP2*02—N—J|32-7*01—CP2。
利用上述TCR Val5-pIRES-TCR Vpl重組質(zhì)粒構(gòu)建抗EB病毒特異性細(xì)胞 毒T細(xì)胞的方法，包括如下步驟
(1 )構(gòu)建EBV特異性CTL克隆相關(guān)的TCR Va-pIRES-TCR VP重組質(zhì)粒
(a) 根據(jù)克隆性增殖的TCRVal5和TCR Vpl亞家族基因序列(包括完 整的CDR3區(qū))設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增TCR Val5基因序列的上游引 物上帶有XhoI酶切位點(diǎn)、下游引物上帶有EcoRl酶切位點(diǎn)，所用上游引物 為CGCrC04GAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTC;所用下游引物為 TCa^42TCTCAGCTGGACCACAACCCGCAGCG，擴(kuò)增TCR Vpi基因序列的 上游引物上帶有XbaI酶切位點(diǎn)、下游引物上帶有SalI酶切位點(diǎn)，上游引物 為CGrC7^04AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA ; 下游引物為 CGGrC04CCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTT;分別獲得全長(zhǎng)的TCRVal5 和TCRVpi亞家族基因PCR產(chǎn)物。
(b) 將真核表達(dá)載體pIRES與純化后的TCR Val5 PCR產(chǎn)物分別用Xho I 和EcoR I酶切，37"C水浴3 h;雙酶切后的pIRES載體和TCR Val5 PCR產(chǎn) 物進(jìn)行連接反應(yīng)然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化；挑選陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA， 用Xho I和EcoR I雙酶切鑒定，同時(shí)在pIRES載體的IRES區(qū)設(shè)計(jì)一下游引 物IRES-R (5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，結(jié)合pIRES載體上游的 T7公共引物(5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3')進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)其
進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定，證實(shí)序列正確后擴(kuò)增陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，獲得EB病毒 特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)的TCR Val5-pIRES重組質(zhì)粒。
(c)將TCR Val5-pIRES質(zhì)粒與純化后TCR Vpl PCR產(chǎn)物分別用Xba I 和Sal I酶切，37'C水浴3 h;雙酶切后的TCR Val5-pIRES質(zhì)粒和TCR Vpl PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)再將連接產(chǎn)物(10pL)轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5a; 挑選陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，分別用Xba I和Sal I以及Xho I 和EcoRl兩組雙酶切鑒定；同時(shí)IRES區(qū)設(shè)計(jì)一上游引物IRES-F (5，-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3，)，結(jié)合pIRES載體下游的T3公共引 物(5'-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3')進(jìn)行PCR鑒定，再對(duì)其進(jìn)行分段 雙向測(cè)序鑒定，證實(shí)質(zhì)粒中所含TCR Val5和TCR Vpl序列均正確無(wú)誤后， 大量提取質(zhì)粒，獲得EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCRVpl重組質(zhì)粒。
(2) EBV特異性CTL克隆相關(guān)的TCR Va-pIRES-TCR V|3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 T細(xì)胞，獲得特異性識(shí)別EBV相關(guān)抗原的高效CTL:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn) 染或核轉(zhuǎn)染技術(shù)將EBV特異性TCR基因相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCR Vpl 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中，培養(yǎng)擴(kuò)增后獲得抗EBV特異性CTL。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果 由于血液腫瘤相關(guān)的TCR譜系優(yōu)勢(shì)利用和克隆性具有一定的特異性和傾 向性，利用EB病毒抗原肽獲得病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆，進(jìn)行T細(xì)胞克 隆性分析后，將特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆優(yōu)勢(shì)表達(dá)的TCR Val5和Vpl基因 轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，構(gòu)建TCR Val5-pIRES-TCR Vpl重組質(zhì)粒，再通過(guò)轉(zhuǎn)基 因技術(shù)將特異性TCR Val5-pIRES-TCR V卩l(xiāng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞，從而得 到大量EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞。通過(guò)嵌合TCR進(jìn)行遺傳學(xué)修飾T細(xì)胞， 體外培養(yǎng)和擴(kuò)增后獲得特異性識(shí)別EB病毒抗原的大量特異性高效細(xì)胞毒T細(xì) 胞，是可能有效治療EB病毒相關(guān)的腫瘤或移植后并發(fā)癥的過(guò)繼性免疫治療策 略，可為EB病毒相關(guān)疾病的特異性免疫治療提供新的治療途徑，具有較好的 應(yīng)用前景。本發(fā)明EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCR Vpl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至外周血T細(xì)胞，可獲得特異性識(shí)別EB 病毒相關(guān)抗原的大量高效細(xì)胞毒T細(xì)胞，能夠特異性地殺傷EBV"的細(xì)胞，安 全性高，對(duì)EB病毒相關(guān)疾病的治療有著較好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方 式不限于此。
實(shí)施例1
1構(gòu)建EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆相關(guān)的TCR Va-pIRES-TCR邪重組 質(zhì)粒；
首先由EB病毒相關(guān)抗原BMLF的九肽片段GLCTLVAML誘導(dǎo)正常人T 細(xì)胞(HLA-A02限制性)并進(jìn)行體外培養(yǎng)后獲得EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì) 胞克隆，在含10% (v/v)胎牛血清、20U/mL重組人IL-2、 100U/mL青-鏈霉 素的IMDM培養(yǎng)基中，37°C、 5% (v/v) C02飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，常規(guī)體外培 養(yǎng)擴(kuò)增；然后收集EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆lxl(^個(gè)細(xì)胞，常規(guī)進(jìn)行 RNA提取、cDNA合成(按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)，接著進(jìn)行利用TCR Vcc和TCR V卩亞家族引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞 克隆中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的TCR Va和TCR Vp亞家族，分別以29個(gè)TCR Va亞家族 和24個(gè)TCR邪亞家族相應(yīng)的特異性上游引物，并結(jié)合相應(yīng)Ca和Cp下游引 物，分別進(jìn)行Val 29與Ca以及Vpi 24與Cp共53個(gè)PCR反應(yīng)。PCR總 反應(yīng)體系20 pL，其中含0.5 pmol/L任一對(duì)Va和V卩弓|物、0.1 mmol/L dNTP、 1.25UTaq聚合酶、10xPCR緩沖液、1.5 mmol/LMgCl2、超純水和lnLcDNA 模板，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件94°C 1 min (首次為3 min)、 60。C 1 min、 72 °C 1 min (末次為10 min)，共40個(gè)循 環(huán)，PCR產(chǎn)物保存于4"C中。取8 nLPCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳后用 Gene genius凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，出現(xiàn)陽(yáng)性條帶者進(jìn)一步以熒光素標(biāo) 記的Ca-Fam引物或Cp-Fam引物進(jìn)行不對(duì)稱擴(kuò)增(10^L的反應(yīng)體系含2.5& TCR亞家族基因的PCR產(chǎn)物、0.15 pmol/L Ca-Fam引物或Cp-fam弓l物、1.5 mmol/LMgCl2、 0.1 mmol/L dNTP、 0.75UTaq聚合酶、10xPCR緩沖液和超純 水。PCR反應(yīng)條件94°C lmin (首次3min)、 66°C 1 min、 72°C 1 min (末次 6min)，共35個(gè)循環(huán))，得到熒光標(biāo)記的單鏈PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行基因掃描分 析(將高質(zhì)量的去離子甲酰胺與Genescan-500LIZ分子量標(biāo)準(zhǔn)品按20: 1比例 配好10iiL的混合液，加入2 nL熒光素Fam標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，經(jīng)94。C變性 4min，立即放置冰上冷卻2 min，然后加入96孔板，直接裝載到3100 DNA序
列分析儀(ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，進(jìn) 行基因掃描分析)，確定其T細(xì)胞克隆性(涉及相關(guān)的引物序列如表1所示)。
—_表1 相關(guān)的引物序列
引物_S_
Vpl 5，-CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC
邪2 5，-GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA
Vp3 5，<;gcttctcccggattctggagtcc
Vp4 5'國(guó)TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA
VP5 5，-AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC
VP6 5，-TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG
V|37 5，-CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC
邪8 5,-CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC
V卩9 5，-TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC
VpiO 5，-CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC
Vpll 5，-TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA
VP12 5，-TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC
邪13 5，-CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA
Vpi4 5，-GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC
Vpl 5 5，-CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG
邪16 5，《GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG
VP17 5，-CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC
邪18 5，-TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA
VP19 5，-TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA
Vp20 5，-AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC
VP21 5，-TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT
邪22 5，-AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA
V卩23 5'-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA
VP24 5，-CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC
CP 5，-CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG
Cp-Fam 5，-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG
Veil_5，- GGCATTAACGGTTTTGAGGCTGGA -3，
Va2 5'-CAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGT-3'
Va3 5，-CCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTA-3'
Va4 5，- TTGGTATCGACAGCTTCACTCCCA -3'
Va5 5'- CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA -3'
Va6 5'-TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT-3'
Va7 5，- GCAACATGCTGGCGGAGCACCCAC -3 ，
Va8 5 ，- CATTCGTTCAAATGTGGGCAAAAG -3'
Va9 5 ，- CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA -3'
ValO 5，- CACTGCGGCCCAGCCTGGTGATAC -3'
Val 1 5'- CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG -3'
Val2 5，-TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA-3'
Val3 5，- TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC -3'
Val4 5，- CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT -3'
Val5 5，- TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT -3，
Val6 5，- TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC -3'
Val 7 5,- TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT -3 ，
Val8 5，-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3'
Val9 5,-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3'
Va20 5，- TCCCTGTTTATCCCTGCCGACAGA -3'
Va21 5，-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3'
Va22 5，- CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA隱3'
Va23 5，-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3，
Va24 5 ，- CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC -3'
Va25 5，-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3'
Va26 5 ，- AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC -3'
Va27 5，- AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA -3'
Va28 5 ，- TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG -3'
Va29 5，- GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG -3，
Ca 5，- GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3'
Ca-F咖_5'-F咖-ATACACATCAGAATCCTTACTTTG-3，_
通過(guò)對(duì)單克隆增殖的亞家族(TCR Val5和TCRV卩1亞家族)進(jìn)行核苷酸 序列分析，確定EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆中克隆性增殖的TCR Val5 和TCR Vpl亞家族基因序列；根據(jù)克隆性增殖的TCR Val5和TCR Vpi亞家 族基因序列(包括完整的CDR3區(qū))設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增TCR Val5基因序列的上 游引物上帶有XhoI酶切位點(diǎn)、下游引物上帶有EcoRl酶切位點(diǎn)(與真核表 達(dá)載體pIRES中的插入位點(diǎn)A的酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，所用上游引物為 CGC7U04GAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTC ; 所用下游引物為 TCGL"7TCTCAGCTGGACCACAACCCGCAGCG)，擴(kuò)增TCR V卩l(xiāng)基因序列 的上游引物上帶有XbaI酶切位點(diǎn)、下游引物上帶有Sal I酶切位點(diǎn)(與真核 表達(dá)載體pIRES中的插入位點(diǎn)B的酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，上游引物為 CGrC7^04AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA ;下游引物為 CGGrC04CCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTT)0按BD Advantage 2 PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng):PCR總反應(yīng)體系50 piL，其中含10xBDAdvantage 2 PCR Buffer、上下游引物各0.5 nmol/L、 dNTP Mix 0.2 mmol/L、 50xBD Advantage 2 Polymerase Mix、超純水和1 jiL cDNA模板，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰 性對(duì)照。反應(yīng)條件94°C 1 min (首次為3 min)、 60°C 1 min、 72 °C 2min (末 次為7min)，共35個(gè)循環(huán)。
將真核表達(dá)載體pIRES與純化后的TCR Vcd5 PCR產(chǎn)物分別用Xho I和 EcoR I酶切，37。C水浴3 h;雙酶切后的pIRES載體和TCR Val5 PCR產(chǎn)物進(jìn) 行連接反應(yīng)體系為10xT4bufferlnL、 T4DNA酶lftL、雙酶切后的pIRES 載體2nL、雙酶切后的TCRVal5PCR產(chǎn)物6pL，混勻后置于16。C過(guò)夜；然 后進(jìn)行轉(zhuǎn)化:①將連接產(chǎn)物(10 jxL)加入感受態(tài)大腸桿菌DH5a,置冰中30 min; ②42。C熱休克90s后，迅速置冰中3min;③加入SOC培養(yǎng)基800 ^L，置干 燥恒溫振蕩箱中37°C 180 200 rpm振搖60 min;④菌液用玻璃推鋪于1,5% LB 固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100ng/mL)上，置37'C孵箱過(guò)夜培養(yǎng)；挑選陽(yáng)性 菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，用Xhol和EcoRl雙酶切鑒定，同時(shí)在 pIRES 載體的 IRES 區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物 IRES-R (5，-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，結(jié)合pIRES載體上游的T7公共引 物(5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3')進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系包括 0.1 mmol/LdNTP、 1.5UTaq聚合酶、10xpcR緩沖液、1,5 mmol/L MgCl2和 超純水，引物濃度均為0.4 pmol/L，以1 : 500稀釋的質(zhì)粒DNA 1 nL作為模
板。PCR擴(kuò)增條件為94。C3min， (94°C30s， 60°C 1 min， 72。C2min, 35個(gè) 循環(huán))，72'C5min;并對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定，證實(shí)序列正確后擴(kuò)增陽(yáng)性克隆 并提取質(zhì)粒，先獲得EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)的TCR Val5-pIRES重
組質(zhì)粒。
將TCR Val5-pIRES重組質(zhì)粒與純化后TCR Vpi PCR產(chǎn)物分別用Xba I 和Sal I酶切，37。C水浴3 h;雙酶切后的TCRVctl5-pIRES重組質(zhì)粒和TCR Vpl PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)體系為10xT4bufferl nL、 T4 DNA酶1 pL、雙酶 切后的TCR Val5-pIRES重組質(zhì)粒2 nL、雙酶切后的TCR Vpl PCR產(chǎn)物6 jiL， 混勻后置于16i:過(guò)夜；再將連接產(chǎn)物(10 jxL)轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5a， 方法同前；挑選陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA,分別用XbaI和SalI 以及Xho I和EcoRl兩組雙酶切鑒定，體系為①TCRVal5-pIRES-TCRV(31 重組質(zhì)粒3 nL、 TangoTMbuffer 4 pL、 Xba I和Sal I內(nèi)切酶各1.5 pL、超純水 10 ^L;②TCR Val5-pIRES-TCR Vpl質(zhì)粒3 fiL、 Tango buffer 4 ^L、 Xho I 和EcoR I內(nèi)切酶各1，5 ^L、超純水10 fiL;混勻后置于37。C水浴3 h;同時(shí)IRES 區(qū)設(shè)計(jì)一上游引物IRES-F(5，-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3，)，結(jié)合pIRES 載體下游的T3公共引物(5'-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3')進(jìn)行PCR鑒 定，PCR反應(yīng)體系和條件同前，再對(duì)其進(jìn)行分段雙向測(cè)序鑒定，證實(shí)質(zhì)粒中 所含TCR Val5和TCR Vpi序列均正確無(wú)誤后，大量提取質(zhì)粒，獲得EB病 毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCR VP1重組質(zhì)粒。
所構(gòu)建質(zhì)粒中pIRES載體的插入位點(diǎn)A內(nèi)的片段序列長(zhǎng)939 bp (其中含 TCRVal5基因序列全長(zhǎng)810bp以及部分非編碼前導(dǎo)序列)，序列如下 CTC7GL4GAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTCAGGGGGACCACAGTGCTTT GGAGGAAAGGAAGAGATACTTGATAATATAGCTCTCTTGGCTGGAGATTG CAGGTCCCAGTGGGGAGAACAATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCC TGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGA GCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAAC TGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGA ACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACA TGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACA TCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACT TCTGTGCAGAGAacctATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTG
AGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGA
TTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG
ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGC
CGCGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACAC
AGCATTATTCCAAAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGA
TGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTT
CAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCG
GGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGTTGTGGTCCAGCTGA0447TC 。
其中，起始密碼子ATG,終止密碼子TGA; Xho I酶切位點(diǎn)CTCGAG;
EcoRl酶切位點(diǎn)GAATTC。
V區(qū)為
ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGA
CTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTC
CGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCT
CCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTG
CTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCAC
TGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACA
CCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGA。
J區(qū)為
ATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAG C區(qū)為
ATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCC
AGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGT
GTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAG
ACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAA
CAAATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACACAGCATTATrcCAAAAG
ACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGA
GAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTG
ATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCAT
GACGCTGCGGTTGTGGTCC AGC 。 其中CDR3區(qū)為
氨基酸序列CAENLYS TLTF 核苷酸序歹U tgt gca gag aac cta tac age acc etc acc ttt 重排方式Val5 (又命名為為Va5*01) —N—Jall*01—Ca (包括外顯 子l、 2、 3)
所翻譯的TCR Val 5基因的氨基酸序列如下-
GFNLLMTLRLWSS。
其中，分子量為MW (mono) =30485.01226; MW (avg) =30504.6118。 所構(gòu)建質(zhì)粒中pIRES載體的插入位點(diǎn)B內(nèi)的片段序列長(zhǎng)1023 bp (其中含 TCRVpl基因序列全長(zhǎng)930bp以及部分非編碼前導(dǎo)序列)，序列如下 rCX404AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGAGAATGCTTACT ACAGAGACACCAGCCCCAAGCTAGGAGATCCTGCCATGGGCTTCAGGCT CCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTG GAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAG TGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTAC CAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGG AGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACA GTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGG
AGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAA ACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGAT ATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTAC CCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCAC AGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTC AATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCT
TCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGG
GCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCAC
CCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACC
TCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGAT
CTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGC
TGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGGTC04C 。
其中，起始密碼子ATG，終止密碼子TAG; Xba I酶切位點(diǎn)TCTAGA; Sall酶切位點(diǎn)GTCGAC。
V區(qū)為
ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGG
CCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCA
ACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCT
CTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCAT
TCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGA
TTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCT
CTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAG。
D區(qū)為CGGGAGGGo J區(qū)為ACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCAC 。 C區(qū)為
AGAAGCAGAGATATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCC
ACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGA
AGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGC
AGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGT
CTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTC
CAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCA
AACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACT
GTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCAT
CCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCA
GTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC。
其中CDR3區(qū)為
氨基酸序列CASSVAGGDEQYF 核苷酸序歹!] tgt gcc age age gta gcg gga ggg gac gag cag tac ttc 重排方式V卩l(xiāng) (又命名為Vp9Wl) —Dp2*02—N—J|32-7*01—C卩2
所翻譯的TCRVPI基因的氨基酸序列如下:
RKDSRGo
分子量為MW (mono) =34408.08665; MW (avg) =34429.9602。
(2) TCRVa-pIRES-TCRVp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞； 以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染為例
① 正常人T細(xì)胞培養(yǎng)
分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取lxl(^個(gè)細(xì)胞接種于50mL25cm2 的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)總液量5mL，含15% (v/v)胎牛血清、500U/mL重組人IL-2、
1 Jlg/mL饑入V^iAJ千3乂L、 V/,U jI^U11j X/li7V^ V^L/厶0千3乂L、1VA/ U/UJUU S-"P比母爾B'J
IMDM培養(yǎng)基，37°C、 5%032飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；3 4天可傳代， 培養(yǎng)體系變?yōu)?5%胎牛血清、250U/mL重組人IL-2、 100 U/mL青-鏈霉素的 IMDM培養(yǎng)基，37°C、 50/。C02飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)維持培養(yǎng)。
② TCR Va-pIRES-TCR Vp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常人T細(xì)胞以2><106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種6孔板，
取適量TCR Va-pIRES-TCR Vp重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合 后轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，操作方法按轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)，培養(yǎng)擴(kuò)增后得到表達(dá) EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)TCR Va |3基因的T細(xì)胞,再利用相應(yīng)的TCR Vo/Vp亞家族引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR以及用相應(yīng)的TCR Vo/Vp亞家族單抗進(jìn) 行流式檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá)。
(3) 利用TCR Va-pIRES-TCR V卩重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，獲得特異性識(shí)別EB病毒相關(guān)抗原的高效細(xì)胞毒T細(xì)胞。
TCR Vct-pIRES-TCR Vp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞后，以乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase, LDH)檢測(cè)試劑盒分別在轉(zhuǎn)染后第1周、第3周進(jìn)行 細(xì)胞毒性試驗(yàn)，操作按說(shuō)明進(jìn)行。分別以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染 空載體的正常T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以Raji細(xì)胞(EBV)、 Molt4細(xì)胞(EBV-) 為靶細(xì)胞，另設(shè)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常T細(xì)胞為空白組。效靶比為10 : 1，靶細(xì)胞 濃度lxl(^個(gè)細(xì)Jt/孔，每組3個(gè)復(fù)孔;置U型96孔培養(yǎng)板內(nèi)，稍離心2500 rpm 30 s，以促進(jìn)效、靶細(xì)胞之間接觸，于37"C、 5y。C02飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h;用1000rpm離心5min，吸取上清100 加入平底酶標(biāo)板中，加入100 pL LDH底物反應(yīng)液，室溫下避光作用30 min，每孔加50 1 mol/L鹽酸終止酶 促反應(yīng)；Elx-800酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(optical density, OD)值，測(cè)定波長(zhǎng)490 nm， 參考波長(zhǎng)670 nm。細(xì)胞毒T細(xì)胞細(xì)胞毒活性計(jì)算公式細(xì)胞毒T細(xì)胞活性(％) ==(實(shí)驗(yàn)組OD值一效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組OD值一靶細(xì)胞自然釋放組OD值)/ (最大釋放組OD值一靶細(xì)胞自然釋放組OD值)。
發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染空載體組和空白組的細(xì)胞毒T細(xì)胞活性均隨 培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后第1周和第3周的T細(xì)胞對(duì)Raji細(xì) 胞(EBV+)的殺傷活性為4.64±0.07%和59.44±2.27%,轉(zhuǎn)染空載體組T細(xì) 胞第1周和第3周對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷活性為3.73±0.16%和28.23±0.23%，而 空白組正常T細(xì)胞第1周和第3周對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷活性為1.39±0.47%和 11.29±3.19%，說(shuō)明在轉(zhuǎn)染后第1周和第3周，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的T細(xì)胞對(duì)Raji 細(xì)胞的殺傷活性均高于轉(zhuǎn)染空載體的T細(xì)胞和空白組的正常T細(xì)胞(i>值均 <0.05)。而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染空載體組和空白組的T細(xì)胞對(duì)Molt4細(xì)胞 (EBV-)的細(xì)胞毒活性按公式計(jì)算均為負(fù)值，故認(rèn)為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染 空載體組和空白組的T細(xì)胞對(duì)Molt4細(xì)胞均無(wú)明顯殺傷性；以上結(jié)果表明轉(zhuǎn) 染TCR Va-pIRES-TCR邪重組質(zhì)粒的正常T細(xì)胞對(duì)EBV"細(xì)胞株具有特異性 殺傷性，成功構(gòu)建了抗EBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí) 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大學(xué)
<120> EB病毒特異性TCR基因相關(guān)的重組質(zhì)粒及構(gòu)建抗EBV特異性CTL的方法 <130> 31 <160> 4
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TCRVal5基因序列 <400> 1
atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg tttttgtggc tgcagctgga ctgtatgagt 60 agaggagagg atgtggagca gagtcttttc ctgagtgtcc gagagggaga cagctecgtt 120 ataaactgca cttacacaga cagctcctcc acctacttat actggtataa gcaagaacct 180 ggagcaggtc tecagttgct gacgtatatt ttttcaaata tggacatgaa acaagaccaa 240 agactcactg ttctattgaa taaaaaggat aaacatctgt ctctgcgcat tgeagacacc 300 cagactgggg actcagctat ctacttctgt gcagagaacc tatacagcac cctcaccttt 360 gggaagggga ctatgcttct agtctctcca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 420 cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 480 caaacaaatg tgtoacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 540 gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgccgcgg cctggagcaa caaatctgac 600 tttgctgtgc aaacgccttc acacagcatt attccaaaag acaccttctt ccccagccca 660 gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac 720 tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat 780 ctgctcatga cgctgcggtt gtggtccagc 810
<210> 2
<211> 930
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TCRVei基因序列 <400> 2
atgggcttca ggctcctetg ctgtgtggcc ttttgtctcc tgggagc鄉(xiāng)cccagtggat 60 tctggagtca eacaaacccc aaagcacctg atcacagcaa ctggacagcg agtgacgctg 120 agatgctccc ctaggtctgg agacctctct gtgtactggt accaacagag cctggaccag 180 ggcctccagt tectcattca gtattataat ggagaagaga gagcaaaagg aaacattctt 240 gaacgattct ccgcacaaca gttccctgac ttgcactctg aactaaacct gagctetctg 300 gagctggggg actcagcttt gtatttctgt gccagcagcg tagcgggagg ggacgagcag 360 tacttcgggc cgggcaccag gctcacggtc acagaggacc tgaaaaacgt gttcccaccc 420 gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatatccc acacccaaaa ggccacactg 480 gtatgcctgg ccacaggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg 540 aaggaggtgc acagtggggt cagcacagac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc 600 aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac 660 ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg 720 acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca 780 gactgtggct tcacctccga gtcttaccag caaggggtcc tgtctgccac eatcctctat 840 gagatcttgc tagggaagge caccttgtat gccgtgctgg tcagtgccct cgtgctgatg 900 gccatggtca agagaaagga ttccagaggc 930
<210> 3
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223>所翻譯的TCRVci 15基因的氨基酸序列
<400> 3
Met Lys Thr Phe Ala Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gin Leu 15 10 15
Asp Cys Met Ser Arg Gly Glu Asp Val Glu Gin Ser Leu Phe Leu Ser
20 25 30
Val Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val lie Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser
35 40 45
Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gin Glu Pro Gly Ala Gly Leu
50 55 60
Gin Leu Leu Thr Tyr lie Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gin Asp Gin 65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg
85 90 95
lie Ala Asp Thr Gin Thr Gly Asp Ser Ala lie Tyr Phe Cys Ala Glu
100 105 110
Asn Leu Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Met Leu Leu Val
115 120 125
Ser Pro Asp lie Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp
130 135 140
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 145 150 155 160
Gin Thr Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr lie Thr Asp
165 170 175
Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
180 185 l卯
Ala Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Val Gin Thr Pro Ser His
195 200 205
Ser lie lie Pro Lys Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
210 215 220
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 225 230 235 240
Phe Gin Asn Leu Ser Val lie Gly Phe Arg lie Leu Leu Leu Lys Val
245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270
<210> 4 <211> 310 <212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223>所翻譯的TCR VP 1基因的氨基酸序列 <400> 4
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala 15 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys His Leu lie Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gin Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gin Gin Ser Leu Asp Gin Gly Leu Gin Phe
50 55 60
Leu lie Gin Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn He Leu 65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gin Gin Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Val Ala Gly Gly Asp Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu lie Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gin
180 185 l卯
Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Tip 225 230 235 240
Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin lie Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Tip Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gin Gin Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr lie Leu Tyr Glu He Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310
權(quán)利要求
1、一種EB病毒特異性TCR基因相關(guān)的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是由TCRVα15基因、pIRES載體和TCRVβ1基因組成，即TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重組質(zhì)粒，所述TCRVα15基因序列如下ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGAacctATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACACAGCATTATTCCAAAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGTTGTGGTCCAGC；所述TCRVβ1基因序列如下ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGCGGGAGGGgACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC。
2、利用權(quán)利要求1所述的TCR Val5-pIRES-TCR Vpi重組質(zhì)粒構(gòu)建抗EB 病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的方法，其特征在于包括如下步驟(1)構(gòu)建EBV特異性CTL克隆相關(guān)的TCR Va-pIRES-TCR Vp重組質(zhì)粒(a) 根據(jù)克隆性增殖的TCRVal5和TCRVpi亞家族基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn) 行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增TCRVal5基因序列的上游引物上帶有XhoI酶切位點(diǎn)、下 游引物上帶有EcoR I酶切位點(diǎn)，所用上游引物為 CGCTC04GAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTC ; 所用下游引物為 TCG^47TCTCAGCTGGACCACAACCCGCAGCG，擴(kuò)增TCR Vpl基因序列的 上游引物上帶有XbaI酶切位點(diǎn)、下游引物上帶有SalI酶切位點(diǎn)，上游引物為 CG7UK404AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA ;下游引物為 CGGrC04CCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTT;分別獲得全長(zhǎng)的TCR Val5 和TCRVpl亞家族基因PCR產(chǎn)物；(b) 將真核表達(dá)載體pIRES與純化后的TCR Val5 PCR產(chǎn)物分別用Xho I 和EcoR I酶切，37。C水浴3 h;雙酶切后的pIRES載體和TCR Val5 PCR產(chǎn)物 進(jìn)行連接反應(yīng)然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化；挑選陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，用 Xhol和EcoRl雙酶切鑒定，同時(shí)在pIRES載體的IRES區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物 IRES-R即5，-TATAGACAAACGCACACCGG-3，，結(jié)合pIRES載體上游的T7公 共引物即5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3'進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)其進(jìn)行雙向 測(cè)序鑒定，證實(shí)序列正確后擴(kuò)增陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，獲得EB病毒特異性細(xì)胞 毒T細(xì)胞相關(guān)的TCR Val5-pIRES重組質(zhì)粒； (c)將TCR Votl5-pIRES質(zhì)粒與純化后TCR VJJ1 PCR產(chǎn)物分別用Xba I 和Sal I酶切，37'C水浴3 h;雙酶切后的TCR Val5-pIRES質(zhì)粒和TCR PCR 產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5a;挑選陽(yáng)性菌落， 擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，分別用Xba I和Sal I以及Xho I和EcoR I兩組雙 酶切鑒定；同時(shí) IRES 區(qū)設(shè)計(jì) 一 上游引物 IRES-F 即 5'-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3'，結(jié)合pIRES載體下游的T3公共引物即 5'-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3'進(jìn)行PCR鑒定，再對(duì)其進(jìn)行分段雙向測(cè)序 鑒定，證實(shí)質(zhì)粒中所含TCRVal5和TCRVpi序列均正確無(wú)誤后，大量提取質(zhì) 粒，獲得EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)的TCR Val5-pIRES-TCR 重組 質(zhì)粒；(2) EBV特異性CTL克隆相關(guān)的TCR Va-pIRES-TCR VP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T 細(xì)胞，獲得特異性識(shí)別EBV相關(guān)抗原的高效CTL:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)染或 核轉(zhuǎn)染技術(shù)將EBV特異性TCR基因相關(guān)的TCR Val5-pKES-TCR V&1質(zhì)粒轉(zhuǎn) 入T細(xì)胞中，培養(yǎng)擴(kuò)增后獲得抗EBV特異性CTL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種EB病毒特異性TCR基因相關(guān)的重組質(zhì)粒及其轉(zhuǎn)導(dǎo)正常T細(xì)胞獲得抗EBV特異性CTL的方法。該重組質(zhì)粒是由TCR Vα15基因、pIRES載體和TCR Vβ1基因組成，本發(fā)明EB病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞克隆相關(guān)的TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至外周血T細(xì)胞，可獲得特異性識(shí)別EB病毒相關(guān)抗原的大量高效細(xì)胞毒T細(xì)胞，能夠特異性地殺傷EBV⁺的細(xì)胞，安全性高，對(duì)EB病毒相關(guān)疾病的治療有著較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101182531SQ20071003134
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者吳秀麗, 朱康兒, 李揚(yáng)秋, 楊力建, 陳少華 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)