本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒與方法。

背景技術(shù)：

艾滋病是一種嚴(yán)重危害人類健康的致死性傳染病，我國自1985年發(fā)現(xiàn)第1例艾滋病病毒(HIV)感染者以來，新感染人數(shù)每年快速增長，并以驚人的速度從高危人群向一般人群擴(kuò)散。HIV(Human immunodeficiency virus)感染最主要的特征是其能夠直接感染和破壞人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞數(shù)量不斷減少，最終導(dǎo)致感染者免疫系統(tǒng)崩潰而死亡。

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)，是效應(yīng)T細(xì)胞，可特異性識(shí)別MHC分子提呈的抗原，進(jìn)而特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞及受微生物感染的細(xì)胞等。CTL可高效且特異地殺傷靶細(xì)胞，而不損害正常組織。CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制包括：1)釋放顆粒酶和穿孔素直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡；2)通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；3)分泌IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞生長。

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對(duì)HIV病毒具有殺傷功能。通過進(jìn)一步對(duì)患者疾病進(jìn)展不同階段抗原特異性CTL細(xì)胞數(shù)量、頻率的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量和頻率的變化與病毒清除的效率密切相關(guān)。因此建立高效的CTL細(xì)胞的擴(kuò)增方法，對(duì)于研究HIV清除的免疫機(jī)制、有效評(píng)判臨床預(yù)后具有重要意義。

為了解決CTL細(xì)胞擴(kuò)增效率低下的問題，本發(fā)明提供了一種剔除調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(T regulatory cells,Tregs)進(jìn)行CTL細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法。發(fā)明通過將艾滋病患者的外周血中Tregs去除，并聯(lián)合細(xì)胞因子IL-2添加的方式有效擴(kuò)增CTL細(xì)胞。此方法能有效提高CTL細(xì)胞擴(kuò)增的效率，對(duì)于研究HIV清除的免疫機(jī)制具有更為重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種HIV抗原特異性CTL的擴(kuò)增方法。本發(fā)明通過將艾滋病患者的外周血中Tregs去除，并聯(lián)合細(xì)胞因子IL-2添加的方式有效擴(kuò)增HIV抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。大大增強(qiáng)HIV抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷功能。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增HIV抗原特異性CTL的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)分離并體外培養(yǎng)艾滋病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞；

(2)去除單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的Tregs細(xì)胞；

(3)使用促進(jìn)HIV抗原特異性CTL擴(kuò)增和激活的試劑刺激培養(yǎng)經(jīng)過步驟(2)處理的細(xì)胞。

進(jìn)一步，本發(fā)明選擇的艾滋病患者其HIV血清學(xué)標(biāo)志物為HIV Ab⁺，白細(xì)胞抗原標(biāo)志物為HLA-A2⁺。其中上角標(biāo)的正(+)負(fù)(-)分別表示陽性和陰性。

通常采用PBMC作為CTL的起始細(xì)胞的來源，PBMC中含有CD4陽性T淋巴細(xì)胞(CD4⁺T)、CD8陽性T淋巴細(xì)胞(CD8⁺T)、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞(Mo)、自然殺傷細(xì)胞(NK)等多種細(xì)胞成份。

采用單采法一次性可采集大量外周PBMC，獲得大量起始細(xì)胞，多余PBMC可輻照或凍存，用于多次細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制備和應(yīng)用，且方法操作簡便。

進(jìn)一步，外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法包括但不限于，葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)，用此方法分離PBMC純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％，其中T淋巴細(xì)胞占80％，B淋巴細(xì)胞占4～10％。

進(jìn)一步，葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液，又稱淋巴細(xì)胞分層液，在分離人PBMC時(shí)，要求其比重為1.077±0.01。

作為可替代的實(shí)施方案，葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液可被percoll細(xì)胞分離液代替。

進(jìn)一步，步驟(2)中剔除的步驟(1)獲取的單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的Tregs細(xì)胞是細(xì)胞表面標(biāo)記為CD4⁺CD25⁺CD127^-的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

進(jìn)一步，步驟(2)中剔除步驟(1)獲取的單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的Tregs細(xì)胞可采用免疫磁珠陰性分選法。免疫磁珠分離法是基于細(xì)胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單克隆抗體相結(jié)合，在外磁場作用下，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面標(biāo)記抗原的細(xì)胞由于不能與磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，因此不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。免疫磁珠分離法有陽性分選法和陰性分選法，陽性分選法的磁珠所結(jié)合的細(xì)胞是需要分離獲得的細(xì)胞，而陰性分離法的磁珠所結(jié)合的細(xì)胞為不需要細(xì)胞。本發(fā)明利用免疫磁珠陰性分選法將PBMC中的Treg細(xì)胞去除，將PBMC向Treg轉(zhuǎn)化降至最低，PBMC中剩下的細(xì)胞則進(jìn)行后續(xù)的HIV抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)。

進(jìn)一步，步驟(3)中添加的促進(jìn)HIV抗原特異性CTL擴(kuò)增和激活的試劑包括但不限于IFN-γ、IL-1α、PHA、IL-2、IL-7中的一種或者幾種。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的促進(jìn)HIV抗原特異性CTL擴(kuò)增和激活的試劑為IL-2。

本發(fā)明還提供了一種制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包括：

分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的試劑；

淋巴細(xì)胞分離液；

促進(jìn)HIV抗原特異性CTL擴(kuò)增和激活的試劑。

進(jìn)一步，所述淋巴細(xì)胞分離液包括葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液，或percoll細(xì)胞分離液。

進(jìn)一步，所述促進(jìn)HIV抗原特異性CTL擴(kuò)增和激活的試劑包括但不限于IFN-γ、IL-1α、PHA、IL-2、IL-7中的一種或者幾種。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的促進(jìn)HIV抗原特異性CTL擴(kuò)增和激活的試劑為IL-2。

本發(fā)明的試劑盒還可以包括：

PBS緩沖液；

10％胎牛血清培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供了一種HIV抗原特異性CTL的檢測方法，所述檢測方法包括通過流式細(xì)胞儀檢測HIV抗原特異性CTL的頻率。

抗原特異性CTL流式檢測所用的免疫球蛋白五聚體(Pentamer)識(shí)別的HIV抗原表位是p17gag蛋白上的SL9(SL9,SLYNTVAL)表位。Pentamer由北京四正柏生物科技有限公司提供。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明選用剔除Tregs細(xì)胞，聯(lián)合細(xì)胞因子IL-2的方式刺激HIV抗原特異性CTL，有效地提高了HIV抗原特異性CTL的擴(kuò)增效率。

(2)本發(fā)明選用MHC肽五聚體染色的技術(shù)檢測HIV抗原特異性CTL，通過Pentamer染色可以有效區(qū)分HIV抗原特異性CTL的擴(kuò)增效率。

附圖說明

圖1顯示利用流式細(xì)胞儀檢測HIV抗原特異性CTL的擴(kuò)增效率；A：陰性對(duì)照，B：PBMC+IL-2；C：PBMC-Tregs+IL-2。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實(shí)施檢測。

實(shí)施例1外周血單個(gè)核細(xì)胞分離

1、材料收集：收集解放軍第302醫(yī)院艾滋病患者的血液1份，其血清學(xué)標(biāo)志物為HIV Ab⁺，白細(xì)胞抗原標(biāo)志物為HLA-A2+，符合上述檢測標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離

(1)靜脈取血20ml，加入含肝素溶液(10～50U/m1血樣本)的試管中，混勻，使血液抗凝。用pH7.2的Hanks液將抗凝血稀釋1倍。

(2)吸取10ml淋巴細(xì)胞分層液置于刻度離心管中，然后將離心管傾斜45度角，用毛細(xì)滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。

(3)在18℃～20℃下，用水平離心機(jī)以2000r/min離心20min。

(4)用毛細(xì)吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細(xì)胞，移入另一支離心管中。即要吸取所有單個(gè)核細(xì)胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿，以免混入其他細(xì)胞成分。

(5)用PBS洗滌細(xì)胞2次，一次2000r/min，10min；第2次1500r/min，10min，可去掉大部分混雜的血小板。

(6)將沉淀細(xì)胞懸于培養(yǎng)基中備用。

實(shí)施例2調(diào)節(jié)性T細(xì)胞去除

一、溶液配制

PBS：用分析純試劑，Millipore級(jí)別的純水配制，高壓滅菌。

分離緩沖液：PBS中加入終濃度為0.5％的BSA和2mM EDTA，注意無菌操作，液體儲(chǔ)存于2-8℃。

二、磁珠分選標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、分選細(xì)胞染色處理流程

(1)將分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液離心，1500r/min，10min。

(2)調(diào)整細(xì)胞濃度，每1*10⁷細(xì)胞用40μl分離緩沖液重懸。

(3)每1*10⁷細(xì)胞加入10μl生物素標(biāo)記的抗體混合物(Anti-CD4-FITC、Anti-CD25-APC、Anti-CD127-PE)于4℃孵育10分鐘。

(4)每1*10⁷細(xì)胞補(bǔ)加30ul緩沖液和20μl抗生物素抗體20ul。

(5)充分混合后于4℃孵育15分鐘。

(6)每1*10⁷細(xì)胞加入1-2ml緩沖液洗滌后離心，1500r/min，10min。

(7)每1*10⁸細(xì)胞加入500μl緩沖液重懸備用。

2、磁珠分選刪除CD4^-CD127⁺細(xì)胞流程

(1)用2ml緩沖液沖洗備選好的磁珠分選LD柱。

(2)將抗體標(biāo)記好的單細(xì)胞懸液緩慢滴加到LD柱中。

(3)收集細(xì)胞流出液，用2ml緩沖液繼續(xù)沖洗LD柱。

(4)收集細(xì)胞流出液備用。

(5)加壓LD柱柄使陰選細(xì)胞和緩沖液一同流出。

(6)收集LD柱內(nèi)細(xì)胞流出液備用。

3、磁珠標(biāo)記CD4⁺CD25⁺CD127^-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

(1)將陰選收集好的細(xì)胞流出液離心1500r/min，10min，棄掉上清。

(2)每1*10⁷細(xì)胞用90μl緩沖液充分混懸。

(3)每1*10⁷細(xì)胞加入10μl CD25分子標(biāo)記的磁珠。

(4)充分混懸后于4℃孵育15分鐘。

(5)另行加入混合抗體10μl Anti-CD25-APC,10μl Anti-CD4-FITC,10μl Anti-CD127-PE抗體，避光4℃孵育5分鐘。

(6)孵育完成后加入1-2ml緩沖液離心，1500r/min，10min，棄掉上清。

(7)按照每1*10⁸細(xì)胞加入500μl緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)重懸細(xì)胞備用。

4、磁珠陽性分選CD4⁺CD25⁺CD127^-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

(1)將分選所用的MS柱放入體積適合的磁珠分選架內(nèi)。

(2)用500μl緩沖液預(yù)沖MS柱。

(3)將步驟3標(biāo)記好磁珠的細(xì)胞懸液緩慢滴加入柱體內(nèi)，收集流出液。

(4)收集MS柱內(nèi)細(xì)胞流出液離心后棄上清，用培養(yǎng)基(10％胎牛血清的RPMI 1640)重懸。

實(shí)施例3 HIV抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增

設(shè)立單純PBMC刺激組和剔除Tregs細(xì)胞的PBMC刺激組。

1、收集實(shí)施例2中獲取的LD柱內(nèi)細(xì)胞流出液MS柱內(nèi)細(xì)胞流出液，離心1500r/min，10min，棄掉上清。

2、用培養(yǎng)基(10％胎牛血清的RPMI 1640)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1*10⁷/ml。

3、使用96孔板按照1*10⁶/100μl/孔的細(xì)胞濃度種板。

4、每孔補(bǔ)加IL-2，終濃度為10ng/ml。

5、細(xì)胞在37℃，5％CO₂孵箱中培養(yǎng)72小時(shí)。

6、收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞染色。

實(shí)施例4抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的流式檢測

步驟如下：

1、收集擴(kuò)增好的淋巴細(xì)胞，離心，1500r/min，10min，棄掉上清。

2、PBC重懸細(xì)胞后分別加入染色抗體(HIV抗原特異性Pentamer,Anti-CD3-FITC,Anti-CD8-APC)，室溫，避光30分鐘。其中Pentamer識(shí)別的HIV抗原表位是p17gag蛋白上的HLA-A0201(SL9,SLYNTVAL)表位。

3、加入2ml的PBS洗液充分洗滌，離心，1500r/min，10min，棄掉上清。

4、細(xì)胞充分震蕩后加入250μl流式細(xì)胞固定液固定細(xì)胞。

5、流式細(xì)胞儀檢測抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的頻率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

結(jié)果如圖1所示，剔除Tregs細(xì)胞聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC-Tregs+IL-2)HIV抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的比例較單純PBMC聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC+IL-2)明顯增加，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，統(tǒng)計(jì)平均值：剔除Tregs細(xì)胞聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC-Tregs+IL-2)HIV抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的比例平均為4.09％，單純PBMC聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC+IL-2)HIV抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的比例平均為1.845％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。