本發(fā)明涉及一種CIK細胞無血清培養(yǎng)基，屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

無血清培養(yǎng)基是指不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基，可以應(yīng)用于培養(yǎng)免疫細胞，例如淋巴細胞(例如，T淋巴細胞、B細胞、NK細胞等)、樹突狀細胞(也稱DC細胞)、單核/巨噬細胞等。

通常來說，免疫細胞在體外存活和擴增所需要的營養(yǎng)物質(zhì)包括：白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、氨基酸、維生素、糖、脂質(zhì)、無機鹽、生長因子等。這些成分中，白蛋白對細胞生長和存活的影響最大，也是功能和組成最復雜的成分。而無血清培養(yǎng)基中，白蛋白所發(fā)揮的功能主要是由它所攜帶的脂肪酸和微量元素等成分決定的。

不同來源的白蛋白，例如不同種屬的牛白蛋白和人白蛋白，它們所攜帶的脂肪酸差異很大；例如，重組白蛋白與人血白蛋白所攜帶的脂肪酸不同；例如在重組白蛋白中，水稻胚乳提取的與酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)的重組白蛋白所攜帶的脂肪酸不同；不同產(chǎn)地的，也有不同。另外，后期生產(chǎn)加工過程也會造成白蛋白所攜帶的脂肪酸差異，例如不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的、不同的批次的白蛋白所攜帶的脂肪酸也有很大的不同。總之，以上這些差異就導致添加了白蛋白的無血清培養(yǎng)基的成分復雜、不穩(wěn)定。

無血清培養(yǎng)基中添加的白蛋白，其所攜帶的脂肪酸被細胞攝取后，用于構(gòu)建細胞膜結(jié)構(gòu)、信號傳導分子、轉(zhuǎn)化成能量、或者參與其它物質(zhì)的合成等。因此，培養(yǎng)基中的白蛋白所攜帶的脂肪酸的差異會影響到免疫細胞的生長增殖、細胞功能等各個方面。特別是，往往某些脂肪酸含量過高或過低也會不利于免疫細胞的增殖及其殺傷活性，比如過高含量的亞麻酸或過低含量的亞油酸對免疫細胞增殖和殺傷活性不利。

特別是，對于淋巴細胞來說，體外富集、活化，并擴增淋巴細胞，可用于回輸治療多種諸如惡性腫瘤、感染、自身免疫病的疾病。然而，在體外擴增的過程中，需要用到適宜體外支持淋巴細胞存活和擴增的培養(yǎng)基。

目前，一些文獻公開了一些無血清培養(yǎng)基，例如適合培養(yǎng)T淋巴細胞和DC細胞的無血清培養(yǎng)基，但都沒有公開針對白蛋白的組成復雜性的解決方案，也沒有公開一種專門培養(yǎng)CIK細胞的無血清培養(yǎng)基。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于相關(guān)技術(shù)的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明提供了一種成分更穩(wěn)定的CIK細胞無血清培養(yǎng)基及其配制方法，改善了因白蛋白的組成復雜性而導致的培養(yǎng)基成分不穩(wěn)定的情況。

本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于CIK細胞無血清培養(yǎng)基，所述CIK細胞無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和適用于所述CIK細胞無血清培養(yǎng)基的血清替代物，所述血清替代物包含白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和膽固醇，所述白蛋白是通過在無脂肪酸白蛋白上負載脂肪酸而形成的。

優(yōu)選的，所述白蛋白是通過在無脂肪酸白蛋白上負載特定的脂肪酸而形成的；所述特定的脂肪酸由棕櫚酸和/或硬脂酸、油酸和亞油酸組成；按照每1mmol無脂肪酸白蛋白添加0.4-2mmol的棕櫚酸和/或硬脂酸，0.4-2mmol的油酸和0.4-2mmol的亞油酸的比例，將所述特定的脂肪酸添加到所述無脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成。

優(yōu)選的，所述特定的脂肪酸還包括花生四烯酸，所述花生四烯酸與所述亞油酸的添加量的比值為1:6～1:1。

優(yōu)選的，所述特定的脂肪酸包括棕櫚酸和硬脂酸、油酸和亞油酸，所述硬脂酸與所述棕櫚酸的添加量的比值為1:6～1:1。

優(yōu)選的，所述CIK細胞無血清培養(yǎng)基中，所述白蛋白的添加量為0.015～0.15mmol/L，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準。

優(yōu)選的，所述的白蛋白為牛血清白蛋白、人血白蛋白或重組人血白蛋白。

優(yōu)選的，所述的重組白蛋白為水稻胚乳表達的重組人血白蛋白或者轉(zhuǎn)基因酵母菌表達的重組人血白蛋白。

優(yōu)選的，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準，所述人轉(zhuǎn)鐵蛋白的添加量為1～100mg/L，所述胰島素的添加量為1～100mg/L，所述膽固醇的添加量為1～10mg/L。

優(yōu)選的，所述血清替代物還包含乙醇胺，其添加量為1～10mg/L，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準。

優(yōu)選的，所述CIK細胞無血清培養(yǎng)基的pH值為6.8～7.5。

本發(fā)明再一方面還提供了上述的CIK細胞CIK細胞無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)CIK細胞方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的CIK細胞CIK細胞無血清培養(yǎng)基配制方法，將脂肪酸負載到無脂肪酸白蛋白上后，再將獲得的成分穩(wěn)定的白蛋白溶液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，由此獲得的CIK細胞無血清培養(yǎng)基成分更穩(wěn)定，功能一致性更好，不會因白蛋白的種屬來源或加工批次的差異有所不同。

附圖說明

圖1為實施例1～4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力的結(jié)果；

圖2為對比例1～4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力的結(jié)果；

圖3為實施例1～11與對比例5～7的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力的結(jié)果；

圖4為實施例1～11與對比例5～7的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的淋巴毒性實驗的結(jié)果；

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些具體實施方式。

實施例1～4

實施例1～4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的配制過程如下：

步驟一：獲取無脂肪酸白蛋白；

實施例1取牛血清白蛋白(購自SIGMA公司的A1933產(chǎn)品)1.5mmol，加注射用水配成2000ml溶液，加入50g活性炭，混勻；采用2mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH值到pH3.0；置于56℃水浴中30分鐘或4℃放置過夜；離心處理(4000轉(zhuǎn)/分鐘)去除活性炭；再用2mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值到pH7.0；最后過濾除菌獲得實施例1的無脂肪酸白蛋白溶液；

實施例2取人血白蛋白(購自基立福(Grifols)公司的人血白蛋白(產(chǎn)品規(guī)格為20％50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過5mol/mol白蛋白))1.5mmol，具體操作過程同實施例1，獲得實施例2的無脂肪酸白蛋白溶液；

實施例3取人血白蛋白(購自武漢生物制品研究所有限責任公司的人血白蛋白(產(chǎn)品規(guī)格20％50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過10mol/mol白蛋白))1.5mmol，具體操作過程同實施例1，獲得實施例3的無脂肪酸白蛋白溶液；

實施例4取水稻重組白蛋白(購自武漢禾元生物科技股份有限公司的植物源重組人血白蛋白(凍干粉)產(chǎn)品)1.5mmol，具體操作過程同實施例1，獲得實施例4的無脂肪酸白蛋白溶液。

步驟二：將特定的脂肪酸負載到所述無脂肪酸白蛋白上；

取1.2mmol棕櫚酸、1.2mmol油酸和1.2mmol亞油酸加入到10ml無水乙醇中溶解，配制相同的4組，分別加入到實施例1-4的步驟一獲得的無脂肪酸白蛋白溶液中(相當于每1mmol無脂肪酸白蛋白溶液中添加了0.8mmol棕櫚酸、0.8mmol油酸和0.8mmol亞油酸)；0-37.5℃條件下，攪拌(100轉(zhuǎn)/分鐘)至少4小時，獲得實施例1-4的白蛋白溶液。

步驟三：配制CIK細胞無血清培養(yǎng)基；

稱取IMDM培養(yǎng)基粉末(購自SIGMA公司的I7633產(chǎn)品)用注射水配制成IMDM培養(yǎng)基溶液，配制相同的4份。

在這4份IMDM培養(yǎng)基溶液中，按每一升IMDM培養(yǎng)基溶液，分別添加實施例1-4的步驟二所獲得的白蛋白溶液(含0.0375mmol白蛋白)；再在每份中，繼續(xù)添加以下物質(zhì)：重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg(購自SIGMA公司的T3705產(chǎn)品)、重組人胰島素10mg(購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司的胰島素注射液產(chǎn)品)、膽固醇2mg(購自SIGMA公司的C1231產(chǎn)品)、乙醇胺2mg(購自SIGMA公司的E0135產(chǎn)品)、抗壞血酸2.5mg(購自SIGMA公司的A4544產(chǎn)品)、硫酸慶大霉素10000IU(購自上海第一生化藥業(yè)有限公司的硫酸慶大霉素注射液產(chǎn)品)、硫酸銅0.001mg、硫酸鋅0.5mg和氯化錳0.0005mg，攪拌使充分溶解；

再用0.1mol/L鹽酸和0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8-7.5之間，0.1um濾膜過濾除菌，分裝，4-8攝氏度保存。

實施例5～8

實施例5～8的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的配制過程如下：

步驟一和三同實施例2的；

步驟二的操作過程同實施例2的，不同之處僅在于步驟二中的脂肪酸添加量的不同；

實施例5：

3mmol棕櫚酸、3mmol油酸和3mmol亞油酸；

實施例6：

0.6mmol棕櫚酸、0.6mmol油酸和0.6mmol亞油酸；

實施例7：

1.6mmol棕櫚酸、1.6mmol油酸和1.6mmol亞油酸；

實施例8：

2.0mmol棕櫚酸、2.0mmol油酸和2.0mmol亞油酸；

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述特定的脂肪酸還包括花生四烯酸，所述花生四烯酸與所述亞油酸的添加量比值的1:6～1:1。優(yōu)選的，比值可以為1:5、1:4、1:3、1:2、2:3、3:4、4:5、5:6等。更優(yōu)選的，比值可以為1:3。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例參見實施例9。

所述特定的脂肪酸還包括硬脂酸，所述硬脂酸與所述棕櫚酸的添加量比值為1:6～1:1。優(yōu)選的，比值可以為1:5、1:4、1:3、1:2、2:3、3:4、4:5、5:6等。更優(yōu)選的，比值可以為1:2。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例參見實施例10。

實施例9

實施例9的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的配制過程如下：

步驟一同實施例1；

步驟二中，取1.2mmol棕櫚酸、1.2mmol油酸、1.2mmol亞油酸和0.4mmol花生四烯酸，加入到10ml無水乙醇中溶解，再加入到步驟一獲得的無脂肪酸白蛋白溶液中；0-37.5℃條件下，攪拌(100轉(zhuǎn)/分鐘)至少4小時，獲得白蛋白溶液；

步驟三中，在每一升IMDM培養(yǎng)基溶液中，加入步驟二所獲得的白蛋白溶液(含0.03mmol白蛋白)、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg、重組人胰島素20mg、膽固醇6mg、乙醇胺5mg、抗壞血酸5mg、硫酸慶大霉素10000IU、硫酸銅0.0005mg、硫酸鋅0.1mg和氯化錳0.001mg。

實施例10

實施例10的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的配制過程如下：

步驟一同實施例1；

步驟二中，取0.8mmol棕櫚酸、1.2mmol油酸、1.2mmol亞油酸和0.4mmol硬脂酸加入到10ml無水乙醇中溶解；再加入到步驟一獲得的無脂肪酸白蛋白溶液中；0-37.5℃條件下，攪拌(100轉(zhuǎn)/分鐘)至少4小時，獲得白蛋白溶液；

步驟三中，在每一升IMDM培養(yǎng)基溶液中加入步驟二所獲得的白蛋白溶液(含0.075mmol白蛋白)、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白100mg、重組人胰島素5mg、膽固醇4mg、乙醇胺10mg、抗壞血酸1mg、硫酸慶大霉素10000IU、硫酸銅0.001mg、硫酸鋅0.5mg和氯化錳0.0005mg。

實施例11

實施例11的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的配制過程如下：

步驟一同實施例1；

步驟二中，取1.2mmol硬脂酸、1.2mmol油酸、1.2mmol亞油酸加入到10ml無水乙醇中溶解；再加入到步驟一獲得的無脂肪酸白蛋白溶液中；0-37.5℃條件下，攪拌(100轉(zhuǎn)/分鐘)至少4小時，獲得白蛋白溶液；

步驟三中，在每一升IMDM培養(yǎng)基溶液中加入步驟二所獲得的白蛋白溶液(含0.0375mmol白蛋白)、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg、重組人胰島素10mg、膽固醇4mg、乙醇胺10mg、抗壞血酸1mg、硫酸慶大霉素10000IU、硫酸銅0.001mg、硫酸鋅0.5mg和氯化錳0.0005mg。

效果對比數(shù)據(jù)

對比例1～4

對比例1～4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的配制：

稱取IMDM培養(yǎng)基粉末用注射水配制成IMDM培養(yǎng)基溶液，配制相同的4份。

在這4份IMDM培養(yǎng)基溶液中，按每一升IMDM培養(yǎng)基溶液，分別添加對比例1-4的白蛋白；

對比例1：牛血清白蛋白(購自SIGMA公司的A1933產(chǎn)品)的水溶液50ml，其中含有牛血清白蛋白0.0375mmol；

對比例2：人血白蛋白(購自基立福(Grifols)公司的人血白蛋白(產(chǎn)品規(guī)格為20％50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過5mol/mol白蛋白))的水溶液50ml，其中含有人血白蛋白0.0375mmol；

對比例3：人血白蛋白(購自武漢生物制品研究所有限責任公司的人血白蛋白(產(chǎn)品規(guī)格20％50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過10mol/mol白蛋白))的水溶液50ml，其中含有人血白蛋白0.0375mmol；

對比例4：水稻重組人血白蛋白(購自武漢禾元生物科技股份有限公司的植物源重組人血白蛋白(凍干粉)產(chǎn)品)的水溶液50ml，其中含有水稻重組人血白蛋白0.0375mmol；

再在每一份中，繼續(xù)添加以下物質(zhì)：重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg、重組人胰島素10mg、膽固醇2mg、乙醇胺2mg、抗壞血酸2.5mg、慶大霉素10000IU、硫酸銅0.001mg、硫酸鋅0.5mg和氯化錳0.0005mg，攪拌使充分溶解；再用0.1mol/L鹽酸和0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8-7.5之間，0.1um濾膜過濾除菌，分裝，4-8攝氏度保存。

對比例5～7

對比例5：市售的AIM-V培養(yǎng)基(購自GIBCO公司的087-0112BK產(chǎn)品)；

對比例6：市售的GT-T561培養(yǎng)基(購自TAKARA公司的CIK細胞無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品)；

對比例7：市售的RPMI1640培養(yǎng)基(購自GIBCO公司22400-105產(chǎn)品)，加入5％熱滅活自體血漿。

淋巴細胞增殖能力實驗

在6孔板中，按照每種培養(yǎng)基三個復孔，每孔加入2mlCIK細胞無血清培養(yǎng)基，再加入1*10⁶外周血淋巴細胞，再加入300IU/ml IL-2和50ng/ml OKT3，進行培養(yǎng)，當細胞密度大于2*10⁶/ml時進行補液培養(yǎng)，補液培養(yǎng)時將細胞密度調(diào)整為1*10⁶/ml，加入300IU/ml IL-2。第10天取每孔的樣品進行細胞計數(shù)，并計算細胞增殖的倍數(shù)。

實施例1～4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力的結(jié)果參見圖1；

對比例1～4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力的結(jié)果參見圖2；

實施例1-11、對比例5～7的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力的結(jié)果參見圖3。

結(jié)論：從圖2的結(jié)果可以看出，不同種屬來源的白蛋白(牛血清白蛋白、人血白蛋白和水稻重組人血白蛋白)、不同廠家生產(chǎn)的白蛋白(對比例2和3的人血白蛋白)按照現(xiàn)有技術(shù)方法配制成的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖倍數(shù)差異很大，即細胞培養(yǎng)效果差異很大；

然而，從圖1的結(jié)果可以看出，不同種屬來源的白蛋白(牛血清白蛋白、人血白蛋白和水稻重組白蛋白)、不同廠家生產(chǎn)的白蛋白(實施例2和3的人血白蛋白)，經(jīng)本發(fā)明的方法配制成的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)效果(細胞增殖倍數(shù))基本處于同一水平，差異不大。

這說明采用本發(fā)明的方法獲得的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的成分更穩(wěn)定，功能一致性更好。

另外，分別對比實施例1-4與對比例1-4的結(jié)果，可以看出實施例1-4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力優(yōu)于對比例1-4的，因此，這說明采用本發(fā)明的方法獲得的CIK細胞無血清培養(yǎng)基不僅成分更穩(wěn)定，功能一致性更好，并且細胞增殖能力得到提高。

對比實施例1-4與對比例5-7的結(jié)果，可以看出本發(fā)明的實施例1-4的CIK細胞無血清培養(yǎng)基的細胞增殖能力優(yōu)于對比例5-7的培養(yǎng)基的。

淋巴細胞毒性實驗

將上述細胞增殖能力實驗中培養(yǎng)第10天的CIK細胞作為效應(yīng)細胞，以Daudi細胞為靶細胞。

首先配制效應(yīng)細胞溶液：取實施例1-11，以及對比例5-7的培養(yǎng)基所培養(yǎng)10天的T淋巴細胞，用IMDM培養(yǎng)基洗2次，用培養(yǎng)基配成1x10⁶/ml細胞懸液。靶細胞daudi細胞用IMDM培養(yǎng)基洗一次，配成1x10⁵/ml細胞懸液。按效靶比10:1接種到96孔板內(nèi)，同時設(shè)置效應(yīng)細胞孔和靶細胞孔，按每種培養(yǎng)基3個復孔，37度5％CO₂培養(yǎng)24小時。用MTT法測吸光度值，計算殺瘤率。

殺瘤率％＝1-(試驗孔-效應(yīng)細胞孔)/靶細胞孔。

結(jié)果參見圖4。

結(jié)論：從圖4可以看出，本發(fā)明實施例1-11的CIK細胞無血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)出來的CIK淋巴細胞的殺瘤率明顯高于市售的AIM-V培養(yǎng)基、GT-T561培養(yǎng)基和含5％熱滅活自體血漿的RPMI1640培養(yǎng)基。

應(yīng)當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當將說明書作為一個整體，各實施方式中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。