本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)：

自20世紀(jì)80年代，美國(guó)人發(fā)現(xiàn)了LAK細(xì)胞，之后又研究了TIL細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞，1991年CIK細(xì)胞出現(xiàn)，讓免疫細(xì)胞治療真正從實(shí)驗(yàn)室走上臨床，近年來(lái)免疫細(xì)胞療法的不斷涌現(xiàn)，腫瘤臨床治療成功案例的大量報(bào)道，預(yù)示著免疫細(xì)胞治療在臨床治療特別是腫瘤治療方面獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與不可替代的作用。

隨著免疫細(xì)胞療法受到越來(lái)越多人的重視，CIK細(xì)胞制備及臨床應(yīng)用中存在的問(wèn)題也不斷呈現(xiàn)：體外活化后，細(xì)胞的擴(kuò)增效率低下，培養(yǎng)后的細(xì)胞含大量免疫抑制性T細(xì)胞群，抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，對(duì)病人免疫系統(tǒng)損傷較大、導(dǎo)致病人對(duì)放化療耐受性差，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程繁瑣，人為因素多、可控性差、規(guī)?；a(chǎn)困難等等，因此需要對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在細(xì)胞擴(kuò)增效率低下以及含有大量免疫抑制性T細(xì)胞群的缺陷，而提供一種細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞的制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題提供的技術(shù)方案是：本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

（1）、分離單個(gè)核細(xì)胞；

（2）、細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng)。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）分離單個(gè)核細(xì)胞采用如下步驟：

（1.1）、在生物安全柜中，使用電動(dòng)助吸器將外周血轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管中，每個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)的外周血為20ml-35ml，然后在1500-2000rmp的轉(zhuǎn)速下，離心8min；

（1.2）、對(duì)外周血離心后，外周血分為明顯的兩層：上層淡黃色血漿層和下層暗紅色血細(xì)胞層，先吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至50mL的無(wú)菌離心管中，將無(wú)菌離心管密封后，再放入恒溫水浴箱中，在56℃的條件下滅活30min，滅活過(guò)后，在2000-3000rpm/min的轉(zhuǎn)速下，再離心10min，管底可見(jiàn)明顯的白色沉淀，轉(zhuǎn)移上層血漿至50mL的無(wú)菌離心管中，制備得到滅活的血漿，封口，4℃保存，備用；

（1.3）、用生理鹽水稀釋血細(xì)胞，用生理鹽水稀釋血細(xì)胞，使得血細(xì)胞與生理鹽水體積比為1:1，混勻后，緩慢均勻的加入到含有10-20ml的人淋巴細(xì)胞分離液的50ml無(wú)菌離心管中，在1600-2500rpm/min的轉(zhuǎn)速下，20℃溫度下，離心20-40min，可見(jiàn)明顯分層，第一層為生理鹽水與血漿混合層，第二層為單個(gè)核細(xì)胞聚集的“白膜層”，第三層為淋巴細(xì)胞分離液層，第四層為粒細(xì)胞層，第五層為紅細(xì)胞層，吸取第二層的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至50ml的無(wú)菌離心管中，向無(wú)菌離心管中加入生理鹽水，定容至40ml，然后在1500-2000rpm/min的轉(zhuǎn)速下，離心8min，棄上清液，再向無(wú)菌離心管內(nèi)加入生理鹽水，定容至40ml,然后使用電動(dòng)助吸器吹打混勻，取500ul細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)；

（1.4）、根據(jù)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，然后在1500-2000rpm/min轉(zhuǎn)速下，離心8min，沉淀細(xì)胞，再用CMK活化液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1x10⁶-2x10⁶/ml,轉(zhuǎn)移到T175培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

作為優(yōu)選，所述的步驟（2）細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)采用如下步驟：

（2.1）、配制LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基：將1支IL-2試劑全部溶解至1瓶1000ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，使得IL-2試劑的濃度控制在1000-2000U/ml；

（2.2）、細(xì)胞培養(yǎng)至第3天，加入50ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.3）、細(xì)胞培養(yǎng)至第4天，加入140mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.4）、第5-7天，分瓶培養(yǎng)，取出240ml細(xì)胞懸液按1.4:1的比例轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新的T175培養(yǎng)瓶中，分別標(biāo)記為f_AC瓶和f_BD瓶，然后兩瓶均補(bǔ)加LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，直至兩瓶?jī)?nèi)均定容至240ml；

（2.5）、第8天，裝袋培養(yǎng)，將f_AC培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入500-1000ml的 LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記為培養(yǎng)袋A；

（2.6）、第9天，裝袋培養(yǎng)，將f_BD培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入500-1000ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記培養(yǎng)袋B；

（2.7）、第11天分袋：在兩個(gè)新的培養(yǎng)袋中分別加入500-1500mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，分別標(biāo)記為培養(yǎng)袋C和培養(yǎng)袋D，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋C中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出500-1000mL至培養(yǎng)袋A中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋A中向培養(yǎng)袋C中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C熱合分開(kāi)即可，同樣的方法，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋D中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出500-1000mL至培養(yǎng)袋B中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋B中向培養(yǎng)袋D中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D熱合分開(kāi)即可；

（2.8）、第15天，從培養(yǎng)袋A收獲第一袋（bag1,b1）細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.9）、第17天, 從培養(yǎng)袋B收獲第二袋(bag2,b2)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.10）、第19天，從培養(yǎng)袋C收獲第三袋(bag3,b3)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.11）、第21天，從培養(yǎng)袋D收獲第四袋(bag4,b4)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1.3）中，所述的人淋巴細(xì)胞分離液的密度為1.077g/ml。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1.4）中，所述的CMK活化液的配制方法為：打開(kāi)生物安全柜，將事先分裝好的儲(chǔ)液CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2取出，待溶解后轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml離心管中，用無(wú)血清培養(yǎng)基涮洗各儲(chǔ)液管，然后將CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2全部加入到50ml離心管中，定容至50ml，使得CD3mAb的濃度為100-500ng/ml,使得CD28mAb的濃度為100-500ng/ml，使得抗CTLA4單抗的濃度為100-500ng/ml，使得IFN-γ的濃度為500-2000U/ml，使得IL-1a的濃度為500-2000U/ml ，使得IL-2的濃度為500-2000U/ml，瓶身貼標(biāo)簽，即可制備得到CMK活化液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)：

1、多重細(xì)胞因子組合篩選，在傳統(tǒng)IFN-γ、CD3mAb、IL-1a和IL-2活化擴(kuò)增因子的基礎(chǔ)上，加入CD28mAb、抗CTLA4單抗等新的抗體細(xì)胞因子，進(jìn)一步提高細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞活化通路，切斷抑制T細(xì)胞對(duì)抗原識(shí)別第二信號(hào)產(chǎn)生的通路，抑制T細(xì)胞的免疫失能，提高細(xì)胞免疫效應(yīng)；

2、細(xì)胞因子工作液濃度的再優(yōu)化，現(xiàn)階段培養(yǎng)CIK細(xì)胞的細(xì)胞因子濃度各異，不同實(shí)驗(yàn)室給出不同的培養(yǎng)濃度，我們通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，逐一摸索出各個(gè)因子的最佳工作濃度，從而達(dá)到最大量的擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)和更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，這些抗體和因子的最佳工作液濃度如下：CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗為100-500ng/ml，IFN-γ、IL-1a、IL-2工作液濃度為500-2000U/ml；

3、無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，保證沒(méi)有潛在的動(dòng)物病源微生物的感染，且培養(yǎng)過(guò)程中不添加任何異源血液成份；

4、細(xì)胞擴(kuò)增的高效性、高活性、高穩(wěn)定性，以及強(qiáng)特異性殺傷能力；

6、擴(kuò)增效率約為300~1000倍；

7、可保持細(xì)胞活性時(shí)間：24小時(shí)；

8、獨(dú)特的細(xì)胞培養(yǎng)工藝，少量外周血即可滿(mǎn)足多次細(xì)胞回輸?shù)囊螅?/p>

9、可與化療聯(lián)合，完全滿(mǎn)足多個(gè)化療療程對(duì)細(xì)胞治療次數(shù)和細(xì)胞治療數(shù)目的要求，從而產(chǎn)生較好的協(xié)同治療腫瘤效果；

10、與傳統(tǒng)行業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)CD3+CD56+ NKT≥10%，CD3+CD8+≥50%，CD4+CD25+Treg≤10%相比，細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞(CMK細(xì)胞)的自然殺傷性T 細(xì)胞（NKT）細(xì)胞群平均可達(dá)25%以上，CD3+CD8+細(xì)胞群可達(dá)60%以上，CD4+CD25+Treg≤5%，細(xì)胞培養(yǎng)效率和腫瘤殺傷能力顯著增強(qiáng)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1的細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞免疫流式表型圖；

圖2為實(shí)施例2的細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞免疫流式表型圖；

圖3為實(shí)施例3的細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞免疫流式表型圖；

圖4為實(shí)施例4的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

（1）、分離單個(gè)核細(xì)胞：

（1.1）、在生物安全柜中，使用電動(dòng)助吸器將外周血轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管中，每個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)的外周血為25ml，然后在1800rmp的轉(zhuǎn)速下，離心8min；

（1.2）、對(duì)外周血離心后，外周血分為明顯的兩層：上層淡黃色血漿層和下層暗紅色血細(xì)胞層，先吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至50mL的無(wú)菌離心管中，將無(wú)菌離心管密封后，再放入恒溫水浴箱中，在56℃的條件下滅活30min，滅活過(guò)后，在2500rpm/min的轉(zhuǎn)速下，再離心10min，管底可見(jiàn)明顯的白色沉淀，轉(zhuǎn)移上層血漿至50mL的無(wú)菌離心管中，制備得到滅活的血漿，封口，4℃保存，備用；

（1.3）、用生理鹽水稀釋血細(xì)胞，使得血細(xì)胞與生理鹽水體積比為1:1，混勻后，緩慢均勻的加入到含有20ml的人淋巴細(xì)胞分離液的50ml無(wú)菌離心管中，在1800rpm/min的轉(zhuǎn)速下，20℃溫度下，離心30min，可見(jiàn)明顯分層，第一層為生理鹽水與血漿混合層，第二層為單個(gè)核細(xì)胞聚集的“白膜層”，第三層為淋巴細(xì)胞分離液層，第四層為粒細(xì)胞層，第五層為紅細(xì)胞層，吸取第二層的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至50ml的無(wú)菌離心管中，向無(wú)菌離心管中加入生理鹽水，定容至40ml，然后在1800rpm/min的轉(zhuǎn)速下，離心8min，棄上清液，再向無(wú)菌離心管內(nèi)加入生理鹽水，定容至40ml,然后使用電動(dòng)助吸器吹打混勻，取500ul細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)；

（1.4）、根據(jù)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，然后在1800rpm/min轉(zhuǎn)速下，離心8min，沉淀細(xì)胞，再用CMK活化液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2x10⁶/ml，轉(zhuǎn)移到T175培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）、細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng)：

（2.1）、配制LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基：將1支IL-2試劑全部溶解至1瓶1000ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，使得IL-2試劑的濃度控制在1500U/ml；

（2.2）、細(xì)胞培養(yǎng)至第3天，加入50ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.3）、細(xì)胞培養(yǎng)至第4天，加入140mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.4）、第5-7天，分瓶培養(yǎng)，取出240ml細(xì)胞懸液按1.4:1的比例轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新的T175培養(yǎng)瓶中，分別標(biāo)記為f_AC瓶和f_BD瓶，然后兩瓶均補(bǔ)加LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，直至兩瓶?jī)?nèi)均定容至240ml；

（2.5）、第8天，裝袋培養(yǎng)，將f_AC培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入700ml的 LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記為培養(yǎng)袋A；

（2.6）、第9天，裝袋培養(yǎng)，將f_BD培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入700ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記培養(yǎng)袋B；

（2.7）、第11天分袋：在兩個(gè)新的培養(yǎng)袋中分別加入1000mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，分別標(biāo)記為培養(yǎng)袋C和培養(yǎng)袋D，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋C中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出700mL至培養(yǎng)袋A中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋A中向培養(yǎng)袋C中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C熱合分開(kāi)即可，同樣的方法，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋D中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出700mL至培養(yǎng)袋B中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋B中向培養(yǎng)袋D中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D熱合分開(kāi)即可；

（2.8）、第15天，從培養(yǎng)袋A收獲第一袋（bag1,b1）細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.9）、第17天, 從培養(yǎng)袋B收獲第二袋(bag2,b2)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.10）、第19天，從培養(yǎng)袋C收獲第三袋(bag3,b3)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.11）、第21天，從培養(yǎng)袋D收獲第四袋(bag4,b4)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞。

所述的步驟（1.3）中，所述的人淋巴細(xì)胞分離液的密度為1.077g/ml。

所述的步驟（1.4）中，所述的CMK活化液的配制方法為：打開(kāi)生物安全柜，將事先分裝好的儲(chǔ)液CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2取出，待溶解后轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml離心管中，用無(wú)血清培養(yǎng)基涮洗各儲(chǔ)液管，然后將CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2全部加入到50ml離心管中，定容至50ml，使得CD3mAb的濃度為300ng/ml,使得CD28mAb的濃度為300ng/ml，使得抗CTLA4單抗的濃度為300ng/ml，使得IFN-γ的濃度為1200U/ml，使得IL-1a的濃度為1200U/ml ，使得IL-2的濃度為1200U/ml，瓶身貼標(biāo)簽，即可制備得到CMK活化液。

實(shí)施例2

（1）、分離單個(gè)核細(xì)胞：

（1.1）、在生物安全柜中，使用電動(dòng)助吸器將外周血轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管中，每個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)的外周血為35ml，然后在2000rmp的轉(zhuǎn)速下，離心8min；

（1.2）、對(duì)外周血離心后，外周血分為明顯的兩層：上層淡黃色血漿層和下層暗紅色血細(xì)胞層，先吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至50mL的無(wú)菌離心管中，將無(wú)菌離心管密封后，再放入恒溫水浴箱中，在56℃的條件下滅活30min，滅活過(guò)后，在3000rpm/min的轉(zhuǎn)速下，再離心10min，管底可見(jiàn)明顯的白色沉淀，轉(zhuǎn)移上層血漿至50mL的無(wú)菌離心管中，制備得到滅活的血漿，封口，4℃保存，備用；

（1.3）、用生理鹽水稀釋血細(xì)胞，使得血細(xì)胞與生理鹽水體積比為1:1，混勻后，緩慢均勻的加入到含有20ml的人淋巴細(xì)胞分離液的50ml無(wú)菌離心管中，在2500rpm/min的轉(zhuǎn)速下，20℃溫度下，離心40min，可見(jiàn)明顯分層，第一層為生理鹽水與血漿混合層，第二層為單個(gè)核細(xì)胞聚集的“白膜層”，第三層為淋巴細(xì)胞分離液層，第四層為粒細(xì)胞層，第五層為紅細(xì)胞層，吸取第二層的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至50ml的無(wú)菌離心管中，向無(wú)菌離心管中加入生理鹽水，定容至40ml，然后在2000rpm/min的轉(zhuǎn)速下，離心8min，棄上清液，再向無(wú)菌離心管內(nèi)加入生理鹽水，定容至40ml,然后使用電動(dòng)助吸器吹打混勻，取500ul細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)；

（1.4）、根據(jù)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，然后在2000rpm/min轉(zhuǎn)速下，離心8min，沉淀細(xì)胞，再用CMK活化液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1x10⁶/ml，轉(zhuǎn)移到T175培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）、細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng)：

（2.1）、配制LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基：將1支IL-2試劑全部溶解至1瓶1000ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，使得IL-2試劑的濃度控制在2000U/ml；

（2.2）、細(xì)胞培養(yǎng)至第3天，加入50ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.3）、細(xì)胞培養(yǎng)至第4天，加入140mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.4）、第5-7天，分瓶培養(yǎng)，取出240ml細(xì)胞懸液按1.4:1的比例轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新的T175培養(yǎng)瓶中，分別標(biāo)記為f_AC瓶和f_BD瓶，然后兩瓶均補(bǔ)加LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，直至兩瓶?jī)?nèi)均定容至240ml；

（2.5）、第8天，裝袋培養(yǎng)，將f_AC培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入1000ml的 LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記為培養(yǎng)袋A；

（2.6）、第9天，裝袋培養(yǎng)，將f_BD培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入1000ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記培養(yǎng)袋B；

（2.7）、第11天分袋：在兩個(gè)新的培養(yǎng)袋中分別加入1500mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，分別標(biāo)記為培養(yǎng)袋C和培養(yǎng)袋D，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋C中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出1000mL至培養(yǎng)袋A中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋A中向培養(yǎng)袋C中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C熱合分開(kāi)即可，同樣的方法，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋D中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出1000mL至培養(yǎng)袋B中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋B中向培養(yǎng)袋D中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D熱合分開(kāi)即可；

（2.8）、第15天，從培養(yǎng)袋A收獲第一袋（bag1,b1）細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.9）、第17天, 從培養(yǎng)袋B收獲第二袋(bag2,b2)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.10）、第19天，從培養(yǎng)袋C收獲第三袋(bag3,b3)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.11）、第21天，從培養(yǎng)袋D收獲第四袋(bag4,b4)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞。

所述的步驟（1.3）中，所述的人淋巴細(xì)胞分離液的密度為1.077g/ml。

所述的步驟（1.4）中，所述的CMK活化液的配制方法為：打開(kāi)生物安全柜，將事先分裝好的儲(chǔ)液CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2取出，待溶解后轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml離心管中，用無(wú)血清培養(yǎng)基涮洗各儲(chǔ)液管，然后將CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2全部加入到50ml離心管中，定容至50ml，使得CD3mAb的濃度為500ng/ml,使得CD28mAb的濃度為500ng/ml，使得抗CTLA4單抗的濃度為500ng/ml，使得IFN-γ的濃度為2000U/ml，使得IL-1a的濃度為2000U/ml ，使得IL-2的濃度為2000U/ml，瓶身貼標(biāo)簽，即可制備得到CMK活化液。

實(shí)施例3

（1）、分離單個(gè)核細(xì)胞；

（2）、細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng)。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）分離單個(gè)核細(xì)胞采用如下步驟：

（1.1）、在生物安全柜中，使用電動(dòng)助吸器將外周血轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管中，每個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)的外周血為20ml，然后在1500rmp的轉(zhuǎn)速下，離心8min；

（1.2）、對(duì)外周血離心后，外周血分為明顯的兩層：上層淡黃色血漿層和下層暗紅色血細(xì)胞層，先吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至50mL的無(wú)菌離心管中，將無(wú)菌離心管密封后，再放入恒溫水浴箱中，在56℃的條件下滅活30min，滅活過(guò)后，在2000rpm/min的轉(zhuǎn)速下，再離心10min，管底可見(jiàn)明顯的白色沉淀，轉(zhuǎn)移上層血漿至50mL的無(wú)菌離心管中，制備得到滅活的血漿，封口，4℃保存，備用；

（1.3）、用生理鹽水稀釋血細(xì)胞，使得血細(xì)胞與生理鹽水體積比為1:1，混勻后，緩慢均勻的加入到含有15ml的人淋巴細(xì)胞分離液的50ml無(wú)菌離心管中，在1600rpm/min的轉(zhuǎn)速下，20℃溫度下，離心20min，可見(jiàn)明顯分層，第一層為生理鹽水與血漿混合層，第二層為單個(gè)核細(xì)胞聚集的“白膜層”，第三層為淋巴細(xì)胞分離液層，第四層為粒細(xì)胞層，第五層為紅細(xì)胞層，吸取第二層的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至50ml的無(wú)菌離心管中，向無(wú)菌離心管中加入生理鹽水，定容至40ml，然后在1500rpm/min的轉(zhuǎn)速下，離心8min，棄上清液，再向無(wú)菌離心管內(nèi)加入生理鹽水，定容至40ml,然后使用電動(dòng)助吸器吹打混勻，取500ul細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)；

（1.4）、根據(jù)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，然后在1500rpm/min轉(zhuǎn)速下，離心8min，沉淀細(xì)胞，再用CMK活化液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2x10⁶/ml，轉(zhuǎn)移到T175培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

作為優(yōu)選，所述的步驟（2）細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)采用如下步驟：

（2.1）、配制LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基：將1支IL-2試劑全部溶解至1瓶1000ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，使得IL-2試劑的濃度控制在1000U/ml；

（2.2）、細(xì)胞培養(yǎng)至第3天，加入50ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.3）、細(xì)胞培養(yǎng)至第4天，加入140mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基；

（2.4）、第5-7天，分瓶培養(yǎng)，取出240ml細(xì)胞懸液按1.4:1的比例轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新的T175培養(yǎng)瓶中，分別標(biāo)記為f_AC瓶和f_BD瓶，然后兩瓶均補(bǔ)加LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，直至兩瓶?jī)?nèi)均定容至240ml；

（2.5）、第8天，裝袋培養(yǎng)，將f_AC培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入500ml的 LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記為培養(yǎng)袋A；

（2.6）、第9天，裝袋培養(yǎng)，將f_BD培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中，再加入500ml的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，標(biāo)記培養(yǎng)袋B；

（2.7）、第11天分袋：在兩個(gè)新的培養(yǎng)袋中分別加入500mL的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基，分別標(biāo)記為培養(yǎng)袋C和培養(yǎng)袋D，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋C中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出500mL至培養(yǎng)袋A中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋A中向培養(yǎng)袋C中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋A與培養(yǎng)袋C熱合分開(kāi)即可，同樣的方法，然后通過(guò)無(wú)菌結(jié)合機(jī)將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D無(wú)菌結(jié)合，結(jié)合后，將培養(yǎng)袋D中的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基倒出500mL至培養(yǎng)袋B中，混勻，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)袋B中向培養(yǎng)袋D中傾倒返還等體積的培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)袋B與培養(yǎng)袋D熱合分開(kāi)即可；

（2.8）、第15天，從培養(yǎng)袋A收獲第一袋（bag1,b1）細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.9）、第17天, 從培養(yǎng)袋B收獲第二袋(bag2,b2)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.10）、第19天，從培養(yǎng)袋C收獲第三袋(bag3,b3)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞；

（2.11）、第21天，從培養(yǎng)袋D收獲第四袋(bag4,b4)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞。

所述的步驟（1.3）中，所述的人淋巴細(xì)胞分離液的密度為1.077g/ml。

所述的步驟（1.4）中，所述的CMK活化液的配制方法為：打開(kāi)生物安全柜，將事先分裝好的儲(chǔ)液CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2取出，待溶解后轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml離心管中，用無(wú)血清培養(yǎng)基涮洗各儲(chǔ)液管，然后將CD3mAb、CD28mAb、抗CTLA4單抗、IL-1a、IFN-γ、IL-2全部加入到50ml離心管中，定容至50ml，使得CD3mAb的濃度為100ng/ml,使得CD28mAb的濃度為100ng/ml，使得抗CTLA4單抗的濃度為100ng/ml，使得IFN-γ的濃度為500U/ml，使得IL-1a的濃度為500U/ml ，使得IL-2的濃度為500U/ml，瓶身貼標(biāo)簽，即可制備得到CMK活化液。

實(shí)施例4

選擇市售的常用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基：培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B、培養(yǎng)基C及本發(fā)明制得的LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基四種培養(yǎng)基做細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)分為培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B、培養(yǎng)基C、LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基四組，按1x10⁶/ml初始細(xì)胞濃度接種6孔板，各組按上述優(yōu)選方案添加各相應(yīng)的培養(yǎng)基，分別在第3、6、10、14天取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞，繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，14天細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，LONZA組為L(zhǎng)ONZA無(wú)血清培養(yǎng)基組，培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B、培養(yǎng)基C分別為三種不同品牌的淋巴細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，由圖可見(jiàn)，LONZA無(wú)血清培養(yǎng)基較其他三種的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞總量上都有明顯的優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)例

采集5人份外周血，按上述方案提取外周血MNC，擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞毒型混合殺傷細(xì)胞（CMK細(xì)胞），第15、17、19、21天收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞表型檢測(cè)，結(jié)果如下表1：

表1

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。