本發(fā)明涉及干細(xì)胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種人源iPS干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

隨著中國人口日益老齡化，心血管疾病成為對健康構(gòu)成極大威脅的一類疾病。在我國，心血管病死亡率列第二位，每年死于心血管疾病的約有300萬人，尤其是冠心病導(dǎo)致的心肌梗死疾病會造成部分心肌缺血而壞死，導(dǎo)致病人引發(fā)心臟心律不齊，泵血不足，嚴(yán)重威脅國人健康和生活質(zhì)量，目前只有用ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)分化來的心肌細(xì)胞進(jìn)行貼片替換治療才是可行的治療方法。然而，ES細(xì)胞供體卵母細(xì)胞的來源困難，且細(xì)胞建系效率低，甚至存在免疫排斥反應(yīng)，而且，ES細(xì)胞和治療性克隆研究還存在倫理學(xué)爭論，以致ES細(xì)胞無法大面積地被采用。同時患有各類心血管疾病危險因素的人群至少2.3億人，我國心腦血管疾病用藥市場總規(guī)模保持快速增長的勢頭，年均復(fù)合增長率超過25％并呈逐年上升的趨勢。因此，相對應(yīng)的在制藥CRO市場就需要大量的心肌細(xì)胞來滿足心肌藥物的篩選。目前有許多通過ES細(xì)胞生成心肌細(xì)胞的方法大多是只在實驗室里完成的，不能滿足安全、均質(zhì)、大規(guī)模化生產(chǎn)的需要。

因此，為了能滿足未來CRO產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和細(xì)胞治療的需求，開發(fā)出一種安全、可大規(guī)模生產(chǎn)的心肌細(xì)胞分化方法成為細(xì)胞再生領(lǐng)域亟待解決的一個現(xiàn)實問題。

iPS細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等方面與ES細(xì)胞非常相近，而且在DNA甲基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動物等方面也與ES細(xì)胞幾乎完全相同，其自我更新能力較強(qiáng)，且具有高度的分化能力。目前，iPS細(xì)胞可在體外被誘導(dǎo)生成所有210種構(gòu)成人體的細(xì)胞，具有無限的疾病治療前景。

理論上，iPS細(xì)胞培養(yǎng)出的組織或器官移植回原患者身體內(nèi)時，可避開自身免疫系統(tǒng)的攻擊難題，同時以往ES細(xì)胞所產(chǎn)生的道德倫理問題也可以取得根本解決。因此，iPS細(xì)胞成為了再生醫(yī)學(xué)中備受矚目的重要細(xì)胞來源。

除了再生醫(yī)學(xué)之應(yīng)用外，還可以利用患者自身細(xì)胞所形成的iPS細(xì)胞，將其進(jìn)行特定細(xì)胞誘導(dǎo)分化后可以成為細(xì)胞的研究材料，解決以往人類組織細(xì)胞的提取難題。另外由于細(xì)胞來源于患者本身，其具有的“個別性”、“專一性”特性可以成為藥劑或是藥物毒理評估的最佳平臺，也可成為轉(zhuǎn)譯醫(yī)學(xué)的最佳測試材料。所以，iPS細(xì)胞的制作與發(fā)現(xiàn)也同樣成為了醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及食品的重要安全實驗平臺。

雖然，目前有很多方法可以將iPS細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，但是心肌細(xì)胞的分化效率低，價格高昂，細(xì)胞系之間的差異很大，不利于規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的局限，提供一種iPS干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于體外定向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括第一培養(yǎng)液，所述第一培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12，進(jìn)一步地，所述第一培養(yǎng)液還包括：

胰島素4～11/ml；

2-磷酸抗壞血酸酯40～70mg/ml；

亞硒酸鈉40～80ug/ml；

人類堿性成纖維細(xì)胞生長因子150～200ug/ml；

人類轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ1 90～140ug/ml；

轉(zhuǎn)鐵蛋白30～60mg/ml；

NaHCO₃ 4～8wt％。

本發(fā)明人經(jīng)過多次改進(jìn)和嘗試，終于發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的第一培養(yǎng)液細(xì)胞可以抑制細(xì)胞分化過程中細(xì)胞的死亡，并且可以促進(jìn)后續(xù)心肌細(xì)胞的分化比例。DMEM/F12是已經(jīng)商業(yè)化的培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入上述比例的各組分，可以明顯提高分化效率，雖然詳細(xì)的作用機(jī)制尚有待研究，但應(yīng)該與這些組分各自調(diào)節(jié)的基因、蛋白以及信號通路的相互協(xié)同的綜合作用相關(guān)。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，其中所述第一培養(yǎng)液還包括：1～3μM TZV或8～12μM Y-27632。其中，Y-27632是一種選擇性ROCK1(p160ROCK)抑制劑，TZV是四唑紫(tetrazolium violet)，第一培養(yǎng)液中含有的TZV或Y-27632用于保證待分化細(xì)胞的存活率，避免大量細(xì)胞死亡。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，其中所述第一培養(yǎng)液的pH值小于7。確保第一培養(yǎng)液顏色為紅色，而不是紫色(堿性)。如果培養(yǎng)液為紫色，加入50～100μg/ml抗壞血酸或松動蓋子后在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中預(yù)熱。在ips細(xì)胞培養(yǎng)分化過程中，酸堿度的變動過大會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述試劑盒還包括第二培養(yǎng)液，所述第二培養(yǎng)液包括CDM培養(yǎng)液，進(jìn)一步地，所述第二培養(yǎng)液還包括8～12μM的CHIR99021；其中所述CDM培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗壞血酸磷酸酯鎂。在分化初始階段加入肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受體的選擇性抑制劑CHIR99021可以激活Wnt/β-catenin信號通路提高心肌細(xì)胞的分化比率。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述試劑盒還包括第三培養(yǎng)液，所述第三培養(yǎng)液包括CDM培養(yǎng)液，進(jìn)一步地，所述第三培養(yǎng)液還包括4～6ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子；其中所述CDM培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗壞血酸磷酸酯鎂。在培養(yǎng)液中加入約5ng/ml作用的bFGF(最終濃度)小分子化合物，可一定程度的增加轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的成活率和心肌細(xì)胞分化的效率。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述試劑盒還包括第四培養(yǎng)液，所述第四培養(yǎng)液包括CDM培養(yǎng)液和已經(jīng)使用過的第三培養(yǎng)液，進(jìn)一步地，所述第四培養(yǎng)液還包括2～8μM的IWP2/4、1～3μM的IWR-1、或1～3μM的Wnt-C59；其中，所述述CDM培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗壞血酸磷酸酯鎂；其中，所述CDM培養(yǎng)液和已經(jīng)使用過的第三培養(yǎng)液的體積比為0.5～2。優(yōu)選地，所述第四培養(yǎng)液含有的是IWP2/4，其可以在一定程度上加速心肌細(xì)胞的分化。優(yōu)選的，所述第四培養(yǎng)液含有的是IWR-1，IWR-1對分化后的細(xì)胞有一定毒性，雖然成活細(xì)胞較少，但在三周時，相比用IWP2/4，使用IWR-1的心肌細(xì)胞的純度較高。在本發(fā)明中，“已經(jīng)使用過的第三培養(yǎng)液”是指分化過程中將第三培養(yǎng)液用于培養(yǎng)細(xì)胞后收集起來的細(xì)胞培養(yǎng)液，該細(xì)胞液中含有細(xì)胞培養(yǎng)過程中一些細(xì)胞分泌的活性因子，使用一部分(約30～70vol％)該細(xì)胞液和新的CDM培養(yǎng)液構(gòu)成的混合培養(yǎng)液有助于細(xì)胞存活率，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述試劑盒還包括第五培養(yǎng)液，所述第五培養(yǎng)液為CDM培養(yǎng)液，或所述第五培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640以及2～4％的KOSR或2～4％的B27；其中所述CDM培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗壞血酸磷酸酯鎂。其中，B27是一種血清替代物，用于細(xì)胞生長，尤其適用于大鼠海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元的長期培養(yǎng)。KOSR也是一種血清替代物。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于體外定向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法，所述方法包括以下階段：

第一階段：用所述的試劑盒中的第一培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)即將用于定向分化的多能干細(xì)胞；

第二階段：用所述的試劑盒中的第二培養(yǎng)液替換第一階段所用的第一培養(yǎng)液，培養(yǎng)12～36小時；

第三階段：用所述的試劑盒中的第三培養(yǎng)液替換第二階段所用的第二培養(yǎng)液，培養(yǎng)36～60小時；

第四階段：用所述的試劑盒中的第四培養(yǎng)液替換第三階段所用的第三培養(yǎng)液，培養(yǎng)36～60小時；

第五階段：用所述的試劑盒中的第五培養(yǎng)液替換第四階段所用的第四培養(yǎng)液。

在體外誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過程中，如何定向分化心肌細(xì)胞，提高分化效率，是一個復(fù)雜綜合的問題，其涉及到多種基因、蛋白及信號通路的調(diào)節(jié)。本發(fā)明人在長期實驗過程中，發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的方法進(jìn)行定向分化時，心肌細(xì)胞的分化效率和穩(wěn)定性均大幅提高。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述方法還包括第六階段，所述第六階段為每2～4天更換一次所述的試劑盒中的第五培養(yǎng)液。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法獲得的心肌前體細(xì)胞系或心肌細(xì)胞系。

此外，本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述心肌細(xì)胞系在細(xì)胞替代治療、心臟疾病治病機(jī)制研究以及藥物篩選中的應(yīng)用。

本發(fā)明的試劑盒和方法簡單可靠，穩(wěn)定高效，安全性高，利用本發(fā)明的試劑盒和方法，可成功高效的獲得具有生物學(xué)活性及功能的心肌細(xì)胞，且讓干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的比例明顯提高，其分化比例大于90％。同時，本發(fā)明的方法可以大規(guī)模生產(chǎn)高品質(zhì)的心肌細(xì)胞，無需后續(xù)的篩選和純化步驟，可以直接用于心臟發(fā)育科學(xué)研究，心臟疾病的細(xì)胞治療，心臟損傷的移植以及藥物篩選的應(yīng)用需求。

可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究反映了多能干細(xì)胞對外源性因子和微環(huán)境的反應(yīng)的多樣性。由于定向分化涉及錯綜復(fù)雜的因子網(wǎng)絡(luò),細(xì)胞活動收到多種信號間相互作用的調(diào)控,這些外源性因子和微環(huán)境的相互作用仍需進(jìn)一步研究。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一個實施例中人源iPS干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的方法的示意流程圖。

圖2是本發(fā)明采用本發(fā)明一個實施例的試劑和方法體外定向分化人源iPS干細(xì)胞為心肌細(xì)胞第二周所得的心肌細(xì)胞球熒光顯影圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料為市售商品。

本文使用的術(shù)語“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”，通常縮寫為iPS細(xì)胞，指的是通過被迫表達(dá)對保持胚胎干細(xì)胞的“干性(sternness)”重要的因子而重編程以進(jìn)入胚胎干細(xì)胞樣狀態(tài)的成體細(xì)胞。通常，iPS細(xì)胞通過以下方式由非多能性細(xì)胞(如成人體細(xì)胞，或末端分化細(xì)胞)，例如纖維原細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元、表皮細(xì)胞等人工制備，即通過將所述非多能性細(xì)胞引入重編程因子，或使所述非多能性細(xì)胞與所述重編程因子接觸。術(shù)語“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)”不包括胚胎干細(xì)胞。

在本發(fā)明中，本文使用的術(shù)語“分化”指的是在體外培養(yǎng)時，在控制條件下，通過非特化的iPSC獲得特化細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞)的生物過程。分化受細(xì)胞基因與細(xì)胞外的物理和化學(xué)條件的相互作用的控制，通常經(jīng)由涉及嵌入細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的信號通路。在某些實施方案中，多能干細(xì)胞可暴露于本發(fā)明的培養(yǎng)基組合物和方法，以便促進(jìn)多能干細(xì)胞分化為胎兒樣心肌細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“心肌細(xì)胞(cardiomyocytes)”通常指的是任何心肌細(xì)胞譜系細(xì)胞，并且，除非另有說明，可適用于處于心肌細(xì)胞個體發(fā)育的任何階段的細(xì)胞。例如，心肌細(xì)胞可同時包括心肌細(xì)胞前體細(xì)胞(不成熟的心肌細(xì)胞或胎兒心肌細(xì)胞)和成熟的心肌細(xì)胞(成體樣心肌細(xì)胞)。進(jìn)一步的心肌細(xì)胞可被細(xì)分成亞型包括，但不限于，竇房心肌細(xì)胞、心室心肌細(xì)胞、竇房結(jié)(SA)節(jié)點心肌細(xì)胞、外圍SA節(jié)點心肌細(xì)胞或中央SA節(jié)點心肌細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“約”，除非明確地指出或從上下文明顯得到，應(yīng)理解為在本領(lǐng)域的正常公差范圍內(nèi)，例如，在平均值的2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)。約可被理解為在規(guī)定值的10％，9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％內(nèi)。

本發(fā)明培養(yǎng)基的配置按照各組分的比例采用常規(guī)的方法配置即可。

本實施例的人源iPS干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的方法包括以下階段：

第一階段：iPS細(xì)胞材料前期準(zhǔn)備

取傳代細(xì)胞(來自Codex Biosolution)，采用0.5m MEDTA進(jìn)行洗脫。在EDTA洗脫后，加入含10μM Y-27632(或2μM TZV)的第一培養(yǎng)液，并利用試管的吸吐攪動使大多數(shù)細(xì)胞洗脫。

將洗脫后的高濃度的細(xì)胞(約為5x10⁶個)，平鋪在Geltrex(一種商業(yè)化的基底膜基質(zhì))預(yù)處理過的培養(yǎng)皿上，用含有10μM Y-27632(或2μMTZV)的第一培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時。每天需更換新鮮的第一培養(yǎng)液，培養(yǎng)三天后，細(xì)胞濃度若超過85％，可進(jìn)行后續(xù)的分化。

第二階段：

在iPS細(xì)胞材料前期準(zhǔn)備完成后的第一天，將第二培養(yǎng)液(含有10μMCHIR99021和2130μg/ml AA2P)提前預(yù)熱，確保其顏色為紅色，如果培養(yǎng)液為紫色，需加入50～100μg/ml抗壞血酸，或松動培養(yǎng)液瓶子蓋子后，將培養(yǎng)液放置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中預(yù)熱，待培養(yǎng)液顏色轉(zhuǎn)為紅色方可使用。用第二培養(yǎng)液替換第一8培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時。

第三階段：

在換入第二培養(yǎng)液24小時之后，吸出第二培養(yǎng)液，加入第三培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時，可以得到中胚層前體細(xì)胞。

第四階段：

吸出第三培養(yǎng)液，加入第四培養(yǎng)液，該第四培養(yǎng)液含有5μM的IWP2/4，培養(yǎng)48小時(在實際操作中，僅吸出一部分第三培養(yǎng)液，再補充進(jìn)去新的CDM培養(yǎng)液以及5μM的IWP2/4也可以達(dá)到類似的效果)。

第五階段：

吸出舊的含有IWP2/4的第四培養(yǎng)液，加入新的含有2％的B27的第五培養(yǎng)液。

第六階段：

每三天換一次含B27的第五培養(yǎng)液。

雖然不同細(xì)胞株之間存在不同，分化后心肌細(xì)胞的收縮最早可出現(xiàn)在第八天，最晚可出現(xiàn)在第三周，但通常出現(xiàn)在分化培養(yǎng)的第二周。通過熒光顯影能看到團(tuán)狀的心肌細(xì)胞球如圖2所示。

其他實施例：

本發(fā)明的其他實施例僅涉及到權(quán)利要求范圍內(nèi)的各組分的含量變化，其配置方法和用于多能干細(xì)胞的定向分化的方法與實施例1基本相同。

例如，在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約4mg/L到約11mg/L的胰島素，優(yōu)選約5mg/L到約10mg/L的胰島素，優(yōu)選約4mg/L到約9mg/L的胰島素，優(yōu)選約5mg/L到約8mg/L的胰島素，優(yōu)選約6mg/L到約7mg/L的胰島素，更優(yōu)選約6mg/L的胰島素。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約40～70mg/ml的2-磷酸抗壞血酸酯；優(yōu)選約50～60mg/ml的2-磷酸抗壞血酸酯，更優(yōu)選約60mg/ml的2-磷酸抗壞血酸酯。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約40～80ug/ml亞硒酸鈉；優(yōu)選約50～70ug/ml亞硒酸鈉，更優(yōu)選約60mg/L的亞硒酸鈉。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約150～200ug/ml的人類堿性成纖維細(xì)胞生長因子；優(yōu)選約160～180ug/ml的人類堿性成纖維細(xì)胞生長因子，更優(yōu)選約160ug/ml的人類堿性成纖維細(xì)胞生長因子。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約90～140ug/ml的人類轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ1；優(yōu)選約100～120ug/ml的人類轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ1，更優(yōu)選約120ug/ml的人類轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ1。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約30～60mg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白；優(yōu)選約40～60mg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白，更優(yōu)選約40mg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約4～8wt％的NaHCO₃，優(yōu)選約5～7wt％的NaHCO₃，更優(yōu)選約6wt％的NaHCO₃。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約1～3μM TZV，更優(yōu)選為2μM TZV；可選地，本發(fā)明的第一培養(yǎng)液可包含約8～12μM Y-27632，更有選為10μM Y-27632.

在具體實施方案中，本發(fā)明的第二培養(yǎng)液可包含8～12μM的CHIR99021；優(yōu)選約8～10μM的CHIR99021，更優(yōu)選約10μM的CHIR99021。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第三培養(yǎng)液可包含約4～6ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子；更優(yōu)選約5ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第四培養(yǎng)液可包含約2～8μM的IWP2/4，優(yōu)選為約3～6μM的IWP2/4，最優(yōu)選為約5μM的IWP2/4；或本發(fā)明的第四培養(yǎng)液包含約1～3μM的IWR-1，更優(yōu)選為約2μM的IWR-1；或本發(fā)明的第四培養(yǎng)液包含約1～3μM的Wnt-C59，更優(yōu)選為約2μM的Wnt-C59。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第四培養(yǎng)液可以包括體積百分比為約50％的

CDM培養(yǎng)液和約50％的舊的(即已經(jīng)使用過的)第三培養(yǎng)液，在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的第四培養(yǎng)液可以體積百分比為約60％的CDM培養(yǎng)液和約40％的舊的第三培養(yǎng)液。

在具體實施方案中，本發(fā)明的第四培養(yǎng)液可以包括體積百分比為約以2～4vol％的KOSR或2～4vol％的B27。

雖然上述實施例中各組分的含量有一定程度的變化，但大體上均可以實現(xiàn)心肌細(xì)胞的定向分化，心肌細(xì)胞分化的比例和純度有一些差異。

根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實施方式進(jìn)行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。