本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種特效干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)。
背景技術(shù)：
干細胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞；根據(jù)干細胞的發(fā)育潛能分為三類:全能干細胞、多能干細胞和專能干細胞。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細胞”。
人臍帶干細胞來自新生兒，取材方便，易于體外擴增，使用安全，無病毒感染風(fēng)險，而且不受倫理和法律限制，所以人臍帶干細胞是干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)的首選材料。目前國內(nèi)現(xiàn)有的干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)中，體內(nèi)干細胞的靶向歸巢率不是很理想，所以使得干細胞的利用率不是很高，如果能夠提供一種新型的特效干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)，該技術(shù)能夠使體內(nèi)干細胞的靶向歸巢率達到100%，將成為干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)的一個重大突破。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種能夠使體內(nèi)干細胞的靶向歸巢率達到100%的特效干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種特效干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)，其具體包括如下步驟：
1）人臍帶干細胞的分離和培養(yǎng)：首先采用人臍帶干細胞，無菌取人臍帶華通氏膠,用含12% FBS的DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗華通氏膠，收集細胞懸浮液，原代培養(yǎng)24h和48h各換液1次；再原代培養(yǎng)7d，如果觀察到細胞成片，則用質(zhì)量百分數(shù)為0.3%的胰酶消化后傳代到新瓶中，孵箱靜置40min后，瓶底朝上，輕輕吹打，丟棄懸浮細胞，而人臍帶干細胞大多數(shù)牢固貼壁；最后加入全培養(yǎng)基開始傳代培養(yǎng)，以后每3 d更換1次培養(yǎng)液，連續(xù)傳3代；
2）體外人臍帶干細胞誘導(dǎo)：選取傳代時間合適的3代以內(nèi)干細胞，換液后添加誘導(dǎo)分化劑5-氮雜胞苷，再添加肝細胞生長因子HGF、基礎(chǔ)生長因子EGF+bFGF和干細胞因子SGF，體外誘導(dǎo)24h，其中各因子的濃度分別為：肝細胞生長因子15μg/L、5-氮雜胞苷20～30μmol/L、干細胞因子12～20μg/L、EGF 20μg/L、bFGF 50μg/L。
本發(fā)明干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)用到的材料有：Ⅱ型膠原酶、低糖DMEM培養(yǎng)基、兔抗人HCN 4多克隆抗體、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、胰蛋白酶、5-氮雜胞苷(5AZA)、大鼠抗人心肌肌鈣蛋白T(cTnT)單克隆抗體、兔抗人連接蛋白43(connexin 43)多克隆抗體、重組人肝細胞生長因子(HGF)、重組人內(nèi)皮細胞生長因子(EGF)、重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和重組人干細胞因子(SCF)。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明中的特效干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)使用最新一代的體外誘導(dǎo)技術(shù)invitrol，讓體內(nèi)干細胞的靶向歸巢率為100%，屬于特效干細胞信息靶向技術(shù)（The target of the homing）的最新體外誘導(dǎo)方法。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作詳細描述。
一種特效干細胞體外誘導(dǎo)技術(shù)，具體包括如下步驟：1）人臍帶干細胞的分離和培養(yǎng)：本實驗采用人臍帶干細胞，無菌取人臍帶華通氏膠，用含12% FBS的DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗華通氏膠，收集細胞懸浮液，原代培養(yǎng)24h和48h各換液1次；再原代培養(yǎng)7d左右，如果觀察到細胞成片，則用0.3%胰酶消化后傳代到新瓶中，孵箱靜置40min后，瓶底朝上，輕輕吹打，丟棄懸浮細胞(主要是上皮細胞)，而人臍帶干細胞大多牢固貼壁；加入全培養(yǎng)基開始傳代培養(yǎng)，以后每3d更換1次培養(yǎng)液，連續(xù)傳3代左右；2）體外人臍帶干細胞誘導(dǎo)：選取傳代時間合適的干細胞(3代以內(nèi))，換液后添加誘導(dǎo)分化劑5-氮雜胞苷(5AZA)、肝細胞生長因子(HGF)、基礎(chǔ)生長因子(EGF+bFGF)和干細胞因子(SGF)。其中各因子的濃度分別為：肝細胞生長因子15μg/L、5AZA 20～30μmol/L、干細胞因子12～20μg/L、EGF 20μg/L、bFGF 50μg/L，體外誘導(dǎo)24h。
最后應(yīng)當說明的是，以上內(nèi)容僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案進行的簡單修改或者等同替換，均不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。