本發(fā)明涉及一種提高刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量的方法。

背景技術(shù)：

刺葡萄是葡萄科葡萄屬東亞種群的一個野生種。刺葡萄果實(shí)紫黑色，營養(yǎng)極為豐富，含有具保健功能的黃酮類化合物(主要是花青素和原花青素)、白黎蘆醇、齊墩果酸、鞣質(zhì)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和維生素C等天然活性成分。研究表明，刺葡萄果實(shí)中富含的花青素和原花青素有很強(qiáng)的清除自由基的能力，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、保護(hù)心血管等方面的功能，尤其是原花青素，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑。目前，天然的原花青素還主要來源于松樹皮和葡萄籽，隨著市場需求的不斷擴(kuò)大，原有的從葡萄、松樹皮或其他替代植物中來源的生物活性物質(zhì)已不能滿足需要，必須尋求更多更可靠的材料來源。植物細(xì)胞培養(yǎng)是生物技術(shù)領(lǐng)域的一個重要分支，具有不受季節(jié)影響、生長周期短、產(chǎn)物均一可控、活性物質(zhì)成分高等優(yōu)點(diǎn)。因此，解決藥用植物資源匱乏和藥效成分低的藥用植物的有效途徑是采用規(guī)模化植物細(xì)胞培養(yǎng)，以滿足需求。要開展刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行天然產(chǎn)物的生產(chǎn)，亟待解決刺葡萄優(yōu)良細(xì)胞系的篩選、高含量花青素細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)技術(shù)體系建立等諸多問題。本研究在已建立的刺葡萄松散型細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素(如KT)濃度的優(yōu)化，以期大幅度提高刺葡萄細(xì)胞中花青素的含量，從而為刺葡萄細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)天然花青素提供技術(shù)支撐。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種提高刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量的方法，不僅能夠快速獲得大量刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物，且所獲得的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物具有高含量花青素，從而為刺葡萄細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)天然花青 素奠定了良好的基礎(chǔ)。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種提高刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量的方法，包括以下步驟：

(1)細(xì)胞系的選擇與預(yù)培養(yǎng)：選取長期繼代培養(yǎng)過程中穩(wěn)定顯示紫紅色的刺葡萄細(xì)胞系，挑取細(xì)胞團(tuán)表層略帶部分里層的細(xì)胞作為接種的材料；為了使細(xì)胞旺盛生長并趨于同步化，需對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，將前代繼代培養(yǎng)20天的細(xì)胞，按上述取材方式，挑取細(xì)胞團(tuán)表層略帶部分里層的細(xì)胞作為接種的材料，將細(xì)胞團(tuán)接種到未添加6-糠氨基嘌呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，作為高含量花青素細(xì)胞接種的起始材料；

(2)高含量花青素細(xì)胞培養(yǎng)：按(1)步驟所述的取材方式，將(1)步驟中培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞，挑取細(xì)胞團(tuán)表層略帶部分里層的細(xì)胞作為接種的材料，接種到高含量花青素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并于溫度25±1℃下，先在弱光或黑暗下培養(yǎng)3天，后在光照強(qiáng)度為2500lx的LED燈，每天光照12h的條件下繼續(xù)培養(yǎng)32天，期間共培養(yǎng)35天，即可獲得高花青素含量的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物。

進(jìn)一步地，所述(1)步驟中未添加6-糠氨基嘌呤的培養(yǎng)基包括的組分如下：MS培養(yǎng)基、2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L。

進(jìn)一步地，所述(2)步驟中高含量花青素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基包括下述成分：MS培養(yǎng)基、2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、6-糠氨基嘌呤0.05mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L；其中，各成分的濃度均以高含量花青素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明不僅能夠快速獲得大量刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物，且所獲得的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物具有高含量花青素，從而為刺葡萄細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)天然花青素奠定了良好的基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】

本發(fā)明所涉及的一種提高刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量的方法，包括以下步驟：

(1)細(xì)胞系的選擇與預(yù)培養(yǎng)：選取長期繼代培養(yǎng)過程中穩(wěn)定顯示紫紅色的刺葡萄細(xì)胞系，挑取細(xì)胞團(tuán)表層略帶部分里層的細(xì)胞作為接種的材料。為了使細(xì)胞旺盛生長并趨于同步化，需對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，將前代繼代培養(yǎng)20天的細(xì)胞，按上述取材方式，將細(xì)胞接種到未添加6-糠氨基嘌呤(KT)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，作為高含量花青素細(xì)胞接種的起始材料。

(2)高含量花青素細(xì)胞培養(yǎng)：按(1)步驟所述的取材方式，將(1)步驟中培養(yǎng)所獲得的材料，將細(xì)胞接種到高含量花青素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并于溫度25±1℃，先在弱光或黑暗下培養(yǎng)3天，后在光照強(qiáng)度為2500lx的LED燈，每天光照12h的條件下繼續(xù)培養(yǎng)32天，期間共培養(yǎng)35天，即可獲得高花青素含量的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物；

所述(1)步驟中未添加KT的培養(yǎng)基包括的組分如下：MS培養(yǎng)基、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.0mg/L。

所述(2)步驟中高含量花青素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基包括下述成分：MS培養(yǎng)基、2,4-D1.0mg/L、KT 0.05mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L；其中，各成分的濃度均以高含量花青素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。

所述MS培養(yǎng)基具體包括以下各成分：硝酸銨(NH₄NO₃)1650mg/L、硝酸鉀(KNO₃)1900mg/L、氯化鈣(CaCl₂·2H₂O)440mg/L、硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)370mg/L、磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)170mg/L、硫酸錳(MnSO₄·H₂O)22.3mg/L、硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg/L、氯化鈷(CoCl₂·6H₂O)0.025mg/L、硫酸銅(CuSO₄·5H₂O)0.02mg/L、硼酸(H₃BO₃)6.2、鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/L、碘化鉀(KI)0.83mg/L、硫酸亞鐵(FeSO₄·7H₂O)28.7mg/L、乙二胺四乙酸二鈉(Na₂-EDTA)37.3mg/L、煙酸0.5mg/L、維生素B₆ 0.5mg/L、維生素B₁ 0.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L。

實(shí)施例1

(1)刺葡萄細(xì)胞系的選擇與預(yù)培養(yǎng)

選取長期繼代培養(yǎng)過程中穩(wěn)定顯示紫紅色的刺葡萄細(xì)胞系，挑取細(xì)胞團(tuán)表層略帶部分里層的細(xì)胞作為接種的材料。為了使細(xì)胞旺盛生長并趨于同步 化，需對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，具體做法為：將前代繼代培養(yǎng)20天的細(xì)胞，按上述取材方式，挑取細(xì)胞團(tuán)表層略帶部分里層的細(xì)胞作為接種的材料，將細(xì)胞接種到未添加KT的T0培養(yǎng)基(MS+2,4-D 1.0mg/L)中培養(yǎng)20天，作為高含量花青素細(xì)胞接種的起始材料。

(2)高含量花青素刺葡萄細(xì)胞的培養(yǎng)

a、培養(yǎng)基

設(shè)計6種濃度梯度KT的培養(yǎng)基配方，用于高含量花青素刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)的研究，具體配方如下：

T1：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L

T2：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.1mg/L

T4：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L

T3：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L

T5：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 1.5mg/L

T6：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 2.0mg/L

以上培養(yǎng)基均加入蔗糖30g/L、瓊脂粉6g/L，pH調(diào)整為5.8左右。

b、不同培養(yǎng)天數(shù)和不同培養(yǎng)基對刺葡萄細(xì)胞花青素含量的影響

將預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞，挑取合適大小的細(xì)胞團(tuán)(表層略帶部分里層的細(xì)胞)作為接種的材料，接種到T1～T6的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以T0培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)25d后和35d后分別取樣，測定細(xì)胞培養(yǎng)物中花青素的含量，測定的結(jié)果見表1。從培養(yǎng)天數(shù)變化來看，隨培養(yǎng)天數(shù)從25d到35d的增加，花青素含量極顯著的升高。從不同培養(yǎng)基來看，培養(yǎng)25d時，在KT濃度為0～2.0mg/L范圍內(nèi)，隨KT濃度的增加，刺葡萄細(xì)胞中花青素含量呈先增加后降低再增加的趨勢，增加和降低的幅度較小，最高出現(xiàn)在T6培養(yǎng)基，為18.52μg·g^-1(FW)，其次是T2培養(yǎng)基，為18.18μg·g^-1(FW)，第三是T1培養(yǎng)基，為15.44μg·g^-1FW)，含量最低是T0培養(yǎng)基，為8.92μg·g^-1(FW)，除T4培養(yǎng)基外，其它培養(yǎng)基中培養(yǎng)的刺葡萄細(xì)胞中花青素含量均極顯著于對照的T0培養(yǎng)基；培養(yǎng)35d時，在KT濃度為0～2.0mg/L范圍內(nèi)，隨KT濃度的增加，花青素含量也呈先急劇增加后迅速降低再增加的趨勢，花青素含量最 高出現(xiàn)在T1培養(yǎng)基，為66.95μg·g^-1(FW)，并極顯著高于其它培養(yǎng)基中培養(yǎng)的刺葡萄細(xì)胞花青素含量，其次是T6培養(yǎng)基，為50.60μg·g^-1(FW)，第三是T2培養(yǎng)基，為39.54μg·g^-1(FW)，最低是T3培養(yǎng)基，為22.22μg·g^-1(FW)。從分析的結(jié)果可以看出，當(dāng)刺葡萄細(xì)胞在T1培養(yǎng)基中培養(yǎng)35d時，最有利于其花青素含量的合成，花青素含量高達(dá)66.95μg·g^-1(FW)，是對照T0培養(yǎng)基中刺葡萄細(xì)胞花青素含量的2.44倍，因此，將刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)在MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L培養(yǎng)基中，可極大的提高其花青素含量。

表1不同培養(yǎng)基中刺葡萄細(xì)胞花青素含量變化情況

注：表中同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

c、不同培養(yǎng)天數(shù)和不同培養(yǎng)基對刺葡萄細(xì)胞原花青素含量的影響

本發(fā)明進(jìn)一步考察了所篩選出來培養(yǎng)基對刺葡萄細(xì)胞中原花青素含量的影響。分別取25d和35d的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物，測定細(xì)胞培養(yǎng)物中原花青素的含量，測定的結(jié)果見表2。從培養(yǎng)天數(shù)變化來看，隨培養(yǎng)天數(shù)從25d到35d的增加，原花青素含量極顯著的升高。從不同培養(yǎng)基來看，KT濃度為0～2.0mg/L范圍內(nèi)，培養(yǎng)25d時，原花青素含量隨KT濃度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但增加和降低的幅度很小，各培養(yǎng)基中培養(yǎng)的刺葡萄細(xì)胞原花青素含量除T1和T2與對照的T0培養(yǎng)基差異顯著外，其余的差異都不顯著，原花青素含量最高是T2培養(yǎng)基，為1433.65μg·g^-1(FW)，其次是T1培養(yǎng)基，為1406.48μg·g^-1(FW)，含量最低是T0培養(yǎng)基，為1100.33μg·g^-1 (FW)；培養(yǎng)35d時，在KT濃度為0～2.0mg/L范圍內(nèi)，隨KT濃度的增加，刺葡萄細(xì)胞中原花青素含量呈先急劇升高后迅速下降再緩慢升高的趨勢，原花青素含量最高時對應(yīng)的培養(yǎng)基是T1，為3947.50μg·g^-1(FW)，其次是T6培養(yǎng)基，為2789.65μg·g^-1(FW)，原花青素含量最低是T4培養(yǎng)基，為1836.24μg·g^-1(FW)。從數(shù)據(jù)分析可以看出，T1培養(yǎng)基中培養(yǎng)35d的刺葡萄細(xì)胞，其原花青素含量極顯著高于其它幾個培養(yǎng)基，原花青素含量高達(dá)3947.50μg·g^-1(FW)，是對照T0培養(yǎng)基2353.52μg·g^-1(FW))的1.68倍，因此，將刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)在MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L培養(yǎng)基中，也可極大的提高其原花青素含量。

表2不同培養(yǎng)基中刺葡萄細(xì)胞原花青素含量變化情況

綜上所述，通過添加KT可以有效的調(diào)控刺葡萄細(xì)胞中花青素的合成，其中以MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)的刺葡萄細(xì)胞中花青素和原花青素的含量最高，分別比對照提高了2.44倍和1.68倍。

本發(fā)明方法不僅能夠快速獲得大量刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物，且所獲得的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物具有高含量花青素，從而為刺葡萄細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)天然花青素奠定了良好的基礎(chǔ)。

雖然以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，我們所描述的具體的實(shí)施例只是說明性的，而不是用于對本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應(yīng)當(dāng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求所保護(hù)的范圍內(nèi)。