本發(fā)明涉及了一種菌培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，尤其是涉及了一種益生菌的高密度培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

益生菌，英文probiotics一詞由希臘語(yǔ)“for live”派生而來(lái)，譯為“為了生命”，是含有生理活性的活菌，當(dāng)被機(jī)體經(jīng)過(guò)口服或其他給藥方式攝入適當(dāng)?shù)臄?shù)量后，能夠定植于宿主并改善宿主微生態(tài)平衡，從而發(fā)揮有益作用。近年來(lái)的研究表明，人體內(nèi)的細(xì)菌多達(dá)1000多種，特別是胃腸道內(nèi)的細(xì)菌最為豐富，占全身微生態(tài)菌總數(shù)80％左右，是人體細(xì)胞的10倍，被譽(yù)為人類的“第二基因組”。這些細(xì)菌有助于人體消化食物，產(chǎn)生維生素以預(yù)防食物中細(xì)菌所誘發(fā)的疾病，同時(shí)刺激免疫系統(tǒng)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腸道微生物在許多慢性疾病和癥狀中，如炎癥、肥胖、糖尿病、還有癌癥等也起了關(guān)鍵作用。微生物的數(shù)量和基因數(shù)量驚人，強(qiáng)烈影響人類的健康。這些發(fā)現(xiàn)為益生菌產(chǎn)品在食品、保健品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖、環(huán)境、衛(wèi)生用品等領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)了巨大的推動(dòng)力。目前，益生菌被廣泛用于酸奶、乳酸菌飲料、益生菌粉劑、動(dòng)物飼料、環(huán)境治理等產(chǎn)品中，形成了相對(duì)完整和成熟的益生菌行業(yè)。

值得注意的是，益生菌只有達(dá)到一定的數(shù)量水平時(shí)，益生菌才能在宿主體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的效果。所以，以益生菌為功能成分的食品、保健品或藥品需要保證所含活的益生菌數(shù)量保持在一定的水平。這一需求對(duì)益生菌的生產(chǎn)和制備提出了相應(yīng)的要求。在益生菌的培養(yǎng)過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，不但可以滿足后續(xù)益生菌產(chǎn)品的功能需求，還可以提高益生菌生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的生產(chǎn)效率，減少培養(yǎng)體積，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。因此，益生菌的高密度培養(yǎng)是當(dāng)前益生菌開發(fā)和生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)問題。

液體發(fā)酵體系中，中國(guó)發(fā)明專利(公開號(hào)：CN 101230323A)在培養(yǎng)過(guò)程中添加堿性鹽和脫氧劑以消除嗜酸乳桿菌或兩歧雙歧桿菌發(fā)酵時(shí)所受到的脅迫物質(zhì)酸或氧，使最終產(chǎn)品中活菌數(shù)量提高2-4倍。中國(guó)發(fā)明專利(公開號(hào)：CN 101418270A)在干酪乳桿菌Zhang的培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)加入NaOH、KOH或氨水等中和劑和通氮?dú)獾姆椒?，得?0¹¹CFU/mL以上活菌數(shù)的干酪乳桿菌的凍干菌粉。Hayakawa K等人(J Ferment Bioeng,1990,70,404)采用膜技術(shù)與發(fā)酵罐偶聯(lián)，不斷過(guò)濾除去乳酸等脅迫成分，實(shí)現(xiàn)最高菌體密度高達(dá)10¹¹CFU/mL，該方法需耗費(fèi)大量培養(yǎng)基，且僅限于實(shí)驗(yàn)室水平，很難擴(kuò)大到生產(chǎn)應(yīng)用規(guī)模。

半固體或固體發(fā)酵體系中，中國(guó)發(fā)明專利(公開號(hào)：CN 105132321A)采用由麥麩和豆粕等物質(zhì)組成的培養(yǎng)基，接種屎腸球菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，干燥產(chǎn)品中的活菌含量最高為3.8×10¹⁰CFU/g。

類似的還有中國(guó)專利(公開號(hào)：CN 101555510B；CN 101555511B；CN 103421710B；CN 102907563B；CN 103289937B；CN 1212391C)均采用豆粕、麩皮、玉米芯、米糠、花生殼、淀粉、玉米粉、草炭等農(nóng)業(yè)廢棄物或農(nóng)產(chǎn)品為主要成分的固體培養(yǎng)基，接種微生物，進(jìn)行高密度發(fā)酵，產(chǎn)品中的活菌數(shù)基本為10¹¹CFU/g。這類產(chǎn)品主要用于動(dòng)物飼料或進(jìn)行藥物等代謝產(chǎn)物生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種益生菌的高密度培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一、一種益生菌的高密度培養(yǎng)方法：

在含有促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)繁殖的促生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中添加多孔材料，培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1：0.001–1：1000，再在培養(yǎng)基中接種益生菌并進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)益生菌高密度培養(yǎng)。

所述培養(yǎng)為厭氧培養(yǎng)，所接種的益生菌為厭氧或兼性厭氧的微生物。

厭氧培養(yǎng)是在30-42℃下培養(yǎng)12-48h。

培養(yǎng)結(jié)束后，所述益生菌聚集到多孔材料的表面或者內(nèi)部或者表面和內(nèi)部，得到干燥后的產(chǎn)品中總活菌數(shù)可達(dá)10¹¹-10¹⁵CFU/g以上。活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

所制備得到的益生菌具有良好的耐熱性、耐酸性及耐藥性等性能。

所述的培養(yǎng)基為液態(tài)、半固態(tài)或者固態(tài)，培養(yǎng)體系可為液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)三種培養(yǎng)方式中的任一種，所述的多孔材料為固態(tài)。

所述的培養(yǎng)基為YPD(酵母菌)、雙歧桿菌培養(yǎng)基(青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌)、MRS培養(yǎng)基(嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞氏乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、副干酪乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、格氏乳桿菌、片球菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬、蜜蜂球?qū)?、卷曲乳桿菌)、SIIM0012培養(yǎng)基(發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌)、M17培養(yǎng)基(嗜熱鏈球菌)、乳酸菌培養(yǎng)基(乳酸乳球菌乳脂亞種)、腸膜明串珠菌培養(yǎng)基(腸膜明串珠菌腸膜亞種)、丙酸細(xì)菌培養(yǎng)基(丙酸桿菌屬)、5oBé麥芽汁瓊脂(德巴利酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬)、血瓊脂培養(yǎng)基(擬桿菌屬、梭桿菌屬)、番茄汁培養(yǎng)基(酒球菌屬)、PDA馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(青霉屬)、SICC0070丁酸菌培養(yǎng)基(梭菌屬)、TSA胰蛋白胨大豆瓊脂(氣球菌屬)、肉湯培養(yǎng)基(芽孢桿菌屬)、LB培養(yǎng)基(微球菌屬)等。

所述的培養(yǎng)基中含有促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)繁殖的促生長(zhǎng)因子。含有促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)繁殖的促生長(zhǎng)因子如乳清發(fā)酵液、膠原蛋白發(fā)酵液、馬鈴薯發(fā)酵液、海藻提取物、菌菇類發(fā)酵液或提取物、豆乳、番茄汁、胡蘿卜汁、玉米汁、冬蟲夏草提取物、靈芝提取物、鐵皮石斛提取物、當(dāng)歸提取物、銀杏葉提取物、麥芽提取物、參類提取物、黃芪提取物、羅漢果提取物、菊粉、酵母葡聚糖、低聚木糖、維生素、氨基酸、多巴胺、植酸、黃腐酸、腐殖酸、鎂鹽、鋅鹽、錳鹽、鈣鹽、鐵鹽、硒鹽等的一種或多種。

所述的培養(yǎng)基中的多孔材料的平均孔徑大小為1納米-500微米，體積孔隙率為5％-99.9％(v/v)。5％-99.9％(v/v)指的是多孔材料中的孔隙占整個(gè)材料的體積比為5％-99.9％。

所述的多孔材料為凝膠材料、氣凝膠材料、泡沫材料、纖維材料、微孔材料、介孔材料或者大孔材料等。

所述的凝膠材料、氣凝膠材料、泡沫材料和纖維材料的平均孔徑從納米級(jí)尺寸到微米級(jí)尺寸不等；所述的微孔材料的平均孔徑小于2納米，介孔材料的平均孔徑為2-50納米，大孔材料的平均孔徑大于50納米。

所述的多孔材料為天然多糖類及其衍生物、天然蛋白類及其衍生物、合成高分子的均聚物或者共聚物、無(wú)機(jī)材料等材料中的一種或多種。

天然多糖類如甲殼素、殼聚糖、纖維素、木質(zhì)素、葡聚糖、瓊脂糖、低聚果糖、大豆低聚糖、魔芋葡甘聚糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚麥芽糖、淀粉、糊精、菊粉、海藻酸及其鹽、右旋糖酐、透明質(zhì)酸、海藻多糖、褐藻多糖、螺旋藻多糖、地衣多糖、香菇多糖、靈芝多糖、銀耳多糖、阿拉伯膠、果膠、瓜爾膠、黃原膠角叉菜膠等來(lái)源于植物、動(dòng)物、海藻和微生物的多糖及其衍生物。

天然蛋白類如大豆蛋白、綠豆蛋白、小麥蛋白、玉米蛋白、谷蛋白、蠶絲蛋白、蜘蛛絲蛋白、膠原蛋白、乳清蛋白、明膠、酪蛋白酸鈉、纖維蛋白、角蛋白等來(lái)源于植物、動(dòng)物和微生物的蛋白及其衍生物。

合合成高分子的均聚物和共聚物如聚氨基酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚己酸內(nèi)酯、聚β羥基丁酸酯、聚β羥基戊酸等。

無(wú)機(jī)材料如珍珠巖、蒙脫土、炭黑、白炭黑、陶瓷等。

所述的多孔材料為以上所述材料的一種或多種，但又不局限于以上材料。

所用的益生菌為對(duì)人和(或)動(dòng)物有益的微生物，如雙歧桿菌屬、青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、乳桿菌屬、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、卷曲乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種(保加利亞乳桿菌)、德氏乳桿菌亞種、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、鏈球菌屬、嗜熱鏈球菌、乳球菌屬、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、丙酸桿菌屬、酵母屬、德巴利酵母數(shù)、假絲酵母屬、球擬酵母屬、擬桿菌屬、梭桿菌屬、酒球菌屬、消化鏈球菌屬、青霉屬、鏈球?qū)佟⑺缶鷮?、氣球菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬、蜜蜂球菌屬、腸球菌屬、微球菌屬、魏斯氏菌屬等的一種或多種，但又不局限于以上菌種。

所述培養(yǎng)基中，多孔材料上接種的益生菌菌液量為0.1％-50％(v/v)。0.1％-50％(v/v)指的是益生菌菌液加入的體積量為加入后整個(gè)培養(yǎng)基體積的0.1％-50％。

所述益生菌接種菌液中的菌液的濃度是10⁸-10⁹CFU/mL。

依據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法培養(yǎng)，菌種在培養(yǎng)基中多組分的促進(jìn)下，其生長(zhǎng)繁殖速率大幅提升，培養(yǎng)結(jié)束后，干燥即可制得高密度益生菌產(chǎn)品。產(chǎn)品中的總活菌數(shù)可達(dá)10¹¹-10¹⁵CFU/g以上，可用作益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑。這種高密度益生菌具有良好的耐熱性、耐酸堿性及耐藥性等性能。

二、所述益生菌在制備食品、食品添加劑、保健品、醫(yī)藥、飼料或者環(huán)保處理等產(chǎn)品中的應(yīng)用。

所制備的益生菌在食品、醫(yī)藥、飼料、環(huán)保處理等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

食品包括餅干、面包、蛋糕等西式糕點(diǎn)，米糕、饅頭、包子、花卷、月餅、粽子等中式糕點(diǎn)，酸奶、乳制品等奶制品，水、果蔬汁、運(yùn)動(dòng)飲料等飲料，巧克力、蜜餞、面粉、面粉制品等。

保健品和醫(yī)藥包括粉劑和水劑制品。

飼料包括水產(chǎn)、寵物、豬、牛、羊、雞、鴨等動(dòng)物養(yǎng)育和養(yǎng)殖用飼料。

環(huán)保處理產(chǎn)品包括水處理、水凈化等產(chǎn)品。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)益生菌的高密度培養(yǎng)，可直接加工制備成益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑。這種方法提高了益生菌生產(chǎn)的生產(chǎn)效率，減少了培養(yǎng)體積，有效降低生產(chǎn)成本。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明專利進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些。

本發(fā)明的實(shí)施例如下：

實(shí)施例1：

培養(yǎng)基中加入纖維素/殼聚糖凝膠，凝膠孔隙率為90％，平均孔徑大小為500nm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為MRS 75％，L-半胱氨酸鹽酸鹽1％，維生素C 1％，胡蘿卜汁5％，香菇提取物10％，豆乳8％。培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1:0.2。

雙歧桿菌接種到培養(yǎng)基中，雙歧桿菌從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)得，雙歧桿菌采用濃度為10⁹CFU/mL的菌液，接種菌液量為20％。厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16h，干燥后產(chǎn)品中雙歧桿菌總活菌數(shù)可達(dá)8×10¹¹-3×10¹³CFU/g，活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

實(shí)施例2：

培養(yǎng)基中加入膠原蛋白/海藻糖多孔膜，多孔膜孔隙率為80％，平均孔徑大小為200nm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為MRS 80％，蔗糖4％，鎂鹽1％，玉米汁5％，香菇提取物5％，乳清發(fā)酵液5％。培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1：1。

鼠李糖乳桿菌接種到培養(yǎng)基中，鼠李糖乳桿菌從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購(gòu)買獲得，鼠李糖乳桿菌采用濃度為10⁹CFU/mL的菌液，接種菌液量為30％。37℃培養(yǎng)24h，干燥后產(chǎn)品中總活菌數(shù)可達(dá)2×10¹²-3×10¹⁴CFU/g，活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

實(shí)施例3：

培養(yǎng)基中加入聚乳酸泡沫，泡沫孔隙率為92％，平均大小為400μm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為YPD 85％，麥芽提取物4％，維生素1％，平菇提取物5％，靈芝提取物2％，膠原蛋白發(fā)酵液3％。培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1：500。

酵母接種到培養(yǎng)基中，酵母菌從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)得，酵母菌采用濃度為10⁸CFU/mL的菌液，接種菌液量為50％。35℃培養(yǎng)24h，干燥后產(chǎn)品中總活菌數(shù)可達(dá)3×10¹²-2×10¹⁴CFU/g，活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

實(shí)施例4：

培養(yǎng)基中加入蠶絲蛋白/低聚木糖纖維，纖維材料孔隙率為95％，平均孔徑大小為5μm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為M17 78％，馬鈴薯提取物10％，草菇發(fā)酵液5％，當(dāng)歸提取物5％，番茄汁2％。培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1:50。

植物乳桿菌接種到培養(yǎng)基中，植物乳桿菌從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購(gòu)買獲得，植物乳桿菌采用濃度為10⁹CFU/mL的菌液，接種菌液量為45％。37℃培養(yǎng)36h，干燥后產(chǎn)品中總活菌數(shù)可達(dá)6×10¹¹-7×10¹⁴CFU/g，活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

實(shí)施例5：

培養(yǎng)基中加入珍珠巖和細(xì)菌纖維素顆粒，孔隙率為65％，孔徑大小為0.2-20μm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為MRS 78％，低聚木糖5％，海藻提取物5％，草菇發(fā)酵液5％，菊粉5％，植酸2％。培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1:0.01。

嬰兒雙歧桿菌、芽孢桿菌、瑞士乳桿菌混合接種到培養(yǎng)基中，上述菌種從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購(gòu)買獲得，均采用濃度為10⁹CFU/mL的接種菌液，接種菌液量分別為15％,15％，15％。37℃培養(yǎng)36h，干燥后產(chǎn)品中總活菌數(shù)可達(dá)2×10¹³-1×10¹⁵CFU/g，活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

實(shí)施例6：

培養(yǎng)基中加入細(xì)菌纖維素聚集體、膠原蛋白多孔膜和蒙脫土，孔隙率為70％，孔徑大小為0.02-8μm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為MRS 70％，豆乳8％，酵母葡聚糖5％，番茄汁5％，香菇發(fā)酵液5％，乳清發(fā)酵液5％，腐殖酸2％。培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1:100。

芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、丙酸桿菌、糞腸球菌混合接種到培養(yǎng)基中，上述菌種從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購(gòu)買獲得，均采用濃度為10⁹CFU/mL的接種菌液，接種菌液量均為10％。37℃培養(yǎng)30h，干燥后產(chǎn)品中總活菌數(shù)可達(dá)4×10¹³-2×10¹⁵CFU/g，活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

實(shí)施例7：

培養(yǎng)基中加入聚乳酸泡沫、葡聚糖凝膠顆粒和白炭黑，孔隙率為70％，平均孔徑大小為0.2-300μm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為MRS 50％，YPD20％，乳清發(fā)酵液10％，菊粉5％，酵母葡聚糖5％，胡蘿卜汁5％，猴頭菇發(fā)酵液3％，黃腐酸2％。培養(yǎng)基與多孔材料的體積比為1:10。

黃酒酵母、嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、青春雙歧桿菌、糞腸球菌混合接種到培養(yǎng)基中，上述菌種從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購(gòu)買獲得，酵母采用10⁹CFU/mL的接種菌液，其它菌種均采用濃度為10⁹CFU/mL的接種菌液，接種菌液量均為8％。37℃培養(yǎng)36h，干燥后產(chǎn)品中總活菌數(shù)可達(dá)8×10¹³-6×10¹⁵CFU/g，活菌數(shù)受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產(chǎn)品中活菌數(shù)更高。

由上述實(shí)施例可見，本發(fā)明方法具有其突出顯著的技術(shù)效果，能進(jìn)行益生菌的高密度培養(yǎng)，提高了益生菌生產(chǎn)的生產(chǎn)效率，減少了培養(yǎng)體積，有效降低生產(chǎn)成本。