本發(fā)明涉及微生物制劑領(lǐng)域，尤其是一種用于垃圾除臭的EM菌液制備方法。
背景技術(shù)：
：EM菌(EffectiveMicroorganisms)是由多種有益微生物（主要是光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌、絲狀真菌和放線菌）復(fù)合而成的有機組合，可在使用處形成良好的微生態(tài)環(huán)境，因而可以應(yīng)用于環(huán)保、種植、畜牧、水產(chǎn)、飼料及人體家庭保健等方面，起到抑制病原菌、除異臭、改良土壤、改善水質(zhì)、增強抗病性、促生長、改善產(chǎn)品品質(zhì)等功效。目前，環(huán)保、種植、畜牧等行業(yè)所用的EM菌并沒有本質(zhì)上的差異，只是不同用戶所使用的品牌不同，其中的微生物種類及各菌種比例差異不顯著。這種同一性使EM菌的針對性使用效果不理想，或者使用量過大，使用成本較高。EM菌的菌種組成復(fù)雜，其中的光合細(xì)菌等多種微生物對除臭無作用，但在除臭過程中發(fā)揮重要作用的酵母、乳酸菌以及產(chǎn)生抗生素的微生物含量過低；而且由于菌種間的拮抗作用，傳統(tǒng)的發(fā)酵方法生產(chǎn)的產(chǎn)品中菌體濃度通常較低，培養(yǎng)時間長，生產(chǎn)成本較高。市場急需一種專一性高、除臭效果好、用量少、成本低的EM菌產(chǎn)品。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種在垃圾處理、畜牧養(yǎng)殖、污水處理等過程中除臭用的EM菌液制備方法，該菌液中活菌總數(shù)不低于109cfu/mL。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種除臭用EM菌液制備方法，將常規(guī)的EM菌種分為DFA和DFB兩個部分，分別在糖蜜培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時；其中：DFA培養(yǎng)溫度為37℃，不通氣培養(yǎng)；DFB培養(yǎng)溫度為30℃，通氣培養(yǎng)；培養(yǎng)后DFA和DFB按9:1的體積比混合，隨后，30℃密閉發(fā)酵，培養(yǎng)24h，即得除臭用EM菌液。其中：DFA為不含酵母菌，以細(xì)菌和放線菌為主要成分的復(fù)合菌種；DFB為以酵母菌和絲狀真菌為主要成分的復(fù)合菌種。本發(fā)明所使用的出發(fā)菌液為市售EM菌液。所述DFA的制備，包括以下步驟：取常規(guī)EM菌液4℃下靜置30天后的上層液體按1%接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基（按質(zhì)量百分比計，糖蜜8%，蛋白胨2%，K2HPO40.6%，CaCO33%，自然pH）中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發(fā)酵，37℃振蕩培養(yǎng)7天后顯微鏡檢，取無酵母的樣品作DFA組分一；取常規(guī)EM菌液按1%接種量接種至高溫滅菌的LB培養(yǎng)基（按質(zhì)量百分比計，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl1%,培養(yǎng)基pH控制在7.4）中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發(fā)酵，37℃振蕩培養(yǎng)7天后傳代，重復(fù)上述操作，取顯微鏡檢無酵母菌的樣品作組分二；利用LB固體培養(yǎng)基（按質(zhì)量百分比計，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl1%,瓊脂1.0%~1.5%，培養(yǎng)基pH控制在7.4）與PDA培養(yǎng)基（按質(zhì)量百分比計，馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%~2.0%，自然pH）分離常規(guī)EM中菌種，除酵母菌外，分別培養(yǎng)分離得到的菌株后按相同比例接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發(fā)酵，自然協(xié)調(diào)菌種比例，37℃振蕩培養(yǎng)7天作為組分三；以上所得的三種無酵母發(fā)酵液均按3%接種量混合接種至高溫滅菌的糖蜜培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方同前）中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發(fā)酵，37℃振蕩培養(yǎng)3天即得新鮮DFA，新鮮DFA與無菌保護液（蔗糖100g/L、脫脂奶粉100g/L）等體積混合后-80℃真空冷凍干燥24h制成菌粉。所述DFB的制備：取常規(guī)EM菌液4℃下靜置30天后的菌泥，按1%接種量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方同前）中，按25%裝液量裝入錐形瓶中，通氧發(fā)酵，30℃振蕩培養(yǎng)3天即得新鮮DFB，新鮮DFB與無菌保護液（蔗糖100g/L、脫脂奶粉100g/L）等體積混合后-80℃真空冷凍干燥24h制成菌粉。新鮮DFA菌液按2%量直接接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方同前）中，凍干菌粉需經(jīng)種子培養(yǎng)（采用糖蜜培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方同前），90%裝液量，1%接種量，37℃密閉振蕩培養(yǎng)）24h后按10%量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方同前）中，發(fā)酵罐裝液量為70%，密閉發(fā)酵，每隔24小時攪拌10分鐘（攪拌時打開放氣閥放出氣體，防止過壓），37℃培養(yǎng)48小時；新鮮DFB菌液按2%量直接接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方同前）中，凍干菌粉需經(jīng)種子培養(yǎng)（采用糖蜜培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方同前），25%裝液量，1%接種量，30℃通氣振蕩培養(yǎng)）24h后按10%量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方同前）中，30℃通氣攪拌/振蕩培養(yǎng)48小時；發(fā)酵后的DFA和DFB按9:1（V/V）混合后按70%裝液量裝入發(fā)酵罐或無菌密閉容器，30℃密閉發(fā)酵，每隔6小時攪拌10分鐘（攪拌時打開放氣閥放出氣體，防止過壓）培養(yǎng)24h即得除臭用EM菌液。本發(fā)明使用時，根據(jù)待處理樣品差異選擇不同的使用方法。待處理樣品為固體，如垃圾、糞便或養(yǎng)殖場時，將除臭用EM菌液用20-30℃溫水稀釋10倍，靜置1h后噴灑表面，按照其臭味濃烈程度，原液使用量為待處理樣品質(zhì)量的0.1%-1%。待處理樣品為液體，如生活污水、便池、工業(yè)廢水等時，將除臭用EM菌液用20-30℃溫水稀釋3倍，靜置1h后傾倒至待處理液體中，按照其臭味濃烈程度，原液使用量為待處理樣品質(zhì)量的0.001%-0.1%。本發(fā)明菌液中酵母類真菌占總微生物比例為市售EM菌液中的10倍以上。本發(fā)明通過通氣培養(yǎng)，將酵母菌和霉菌等在除臭過程中起主要作用的好氧菌從EM菌中分離出來制成DFB，不含酵母菌的EM菌不通氣培養(yǎng)制成DFA，DFA和DFB分別培養(yǎng)至高菌體濃度后復(fù)配培養(yǎng)制成除臭用EM菌，稀釋后噴灑或傾倒至待處理樣品中。本發(fā)明的有益效果是：（1）菌體濃度高；在培養(yǎng)的前48h內(nèi)無酵母菌和其他菌株間營養(yǎng)的競爭以及代謝產(chǎn)物（乙醇、乙酸和乳酸等）所導(dǎo)致的相互之間的抑制作用，并為生長需求不同的菌種提供了不同的培養(yǎng)條件，使菌體生長旺盛，成品中活菌總數(shù)可達(dá)109數(shù)量級以上。（2）生產(chǎn)周期短，72小時即可完成發(fā)酵。（3）提高了對除臭有顯著效果的酵母和霉菌的比例，經(jīng)檢測，本產(chǎn)品菌液中酵母類真菌占總微生物比例為市售EM菌液中的10倍以上，增強了EM菌的除臭效果。具體實施方式實施例一：液體菌種制備與發(fā)酵。步驟一、DFA的制備：1、取EM菌液500mL，分裝至25支無菌試管中，密封于4℃下靜置30天后的取上層液體按1%分別接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，每組2個平行樣，密閉發(fā)酵，37℃振蕩培養(yǎng)7天后顯微鏡檢，得到無酵母的樣品按相同體積比混合后作為組分一。2、取EM菌液按1%接種量接種至高溫滅菌的LB培養(yǎng)基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，每組10個平行樣，密閉發(fā)酵，37℃振蕩培養(yǎng)7天后傳代，重復(fù)上述操作至第三次傳代得到2個鏡檢無酵母菌樣品混合作為組份二。3、利用LB固體培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基分離純化EM中菌種，得到15株細(xì)菌、2株放線菌、8株霉菌、1株酵母菌，除酵母菌與霉菌外，分別在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后按0.5%（V/V）接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發(fā)酵，自然協(xié)調(diào)菌種比例，37℃振蕩培養(yǎng)7天作為組分三。以上所得的三種無酵母發(fā)酵液均按3%接種量混合接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發(fā)酵，37℃，100rpm振蕩培養(yǎng)7天得DFA。步驟二、DFB的制備：取EM菌液4℃下靜置30天后的菌泥，按1%接種量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基中，按25%裝液量裝入錐形瓶中，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)3天得DFB。步驟三、取DFA按2%接種量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基中，按70%裝液量裝入發(fā)酵罐，密閉發(fā)酵，每隔24h攪拌30min，37℃培養(yǎng)48h，經(jīng)檢測，活菌總數(shù)達(dá)1.53×109cfu/ml。取DFB按2%接種量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基中，30℃通氣攪拌培養(yǎng)48h，經(jīng)檢測，酵母菌濃度達(dá)9.30×108cfu/ml，總活菌數(shù)達(dá)1.78×109cfu/ml。發(fā)酵后的DFA和DFB按9:1混合后裝入空消后的發(fā)酵罐，裝液量70%，30℃密閉發(fā)酵，每隔6小時攪拌10分鐘，培養(yǎng)24h后得除臭用高密度EM菌液，經(jīng)檢測，活菌總數(shù)達(dá)3.73×109cfu/ml，其中酵母菌總數(shù)為1.65×109cfu/ml。實施例二：固體菌種制備與發(fā)酵。DFA凍干粉劑的制備與培養(yǎng)：DFA新鮮菌液與無菌保護液按1:1（V/V）混合后于-80℃預(yù)凍4h，預(yù)凍后的樣品于-80℃真空冷凍干燥48h，檢測其含水量為3.74%，菌體存活率為87.5%。取保存6個月的凍干菌粉按1%量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基，按90%裝液量裝入500mL錐形瓶，37℃，150rpm振蕩培養(yǎng)1天后按10%接種量接種至50L發(fā)酵罐中，接種后裝液量約為35L，培養(yǎng)基為糖蜜培養(yǎng)基，每隔24h攪拌30min，37℃培養(yǎng)48h，經(jīng)檢測，活菌總數(shù)達(dá)1.27×109cfu/ml。DFB凍干粉劑的制備與培養(yǎng)：DFB新鮮菌液與無菌保護液按1:1（V/V）混合后于-80℃預(yù)凍4h，預(yù)凍后的樣品于-80℃真空冷凍干燥48h，檢測其含水量為3.37%，菌體存活率為84.3%。取保存6個月的凍干菌粉按1%量接種至無菌的糖蜜培養(yǎng)基，容器為500mL錐形瓶，25%裝液量，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1天后按10%接種量接種至5L發(fā)酵罐中，接種后裝液量約為3.5L，培養(yǎng)基為糖蜜培養(yǎng)基，30℃下，300rpm通氣攪拌培養(yǎng)，通氣比1:1，培養(yǎng)48h，經(jīng)檢測，活菌總數(shù)達(dá)1.96×109cfu/ml，其中酵母菌總數(shù)1.22×109cfu/ml。從DFA發(fā)酵罐內(nèi)放料3.5L，將3.5LDFB導(dǎo)入DFA發(fā)酵罐內(nèi)，30℃密閉發(fā)酵，每隔6小時攪拌10分鐘，培養(yǎng)24h后得除臭用高密度EM菌液，經(jīng)檢測，活菌總數(shù)達(dá)4.65×109cfu/ml，其中酵母菌總數(shù)為1.95×109cfu/ml。實施例三：固體垃圾除臭實驗。從生活區(qū)垃圾場采集垃圾100kg，其組成包括廢紙、塑料制品、動物內(nèi)臟、食物殘渣等，攪拌混勻后均勻分為5份，每份20kg，分別裝入5個100kg塑料桶中，桶蓋上留有8cm2氣窗，分別編號1-5。處理方法：1號；取除臭用EM菌液，離心、過濾除菌后取20g濾液加入30℃溫水180g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。2號；取除臭用EM菌液20g加入30℃溫水180g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。3號；取除臭用EM菌液，離心、過濾除菌后取200g濾液加入30℃溫水1800g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。4號；取除臭用EM菌液200g加入30℃溫水1800g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。5號；不作處理，直接蓋上桶蓋。將5個桶置于室外，3d后取氣體樣品檢測其中硫化氫和氨（GB/T14678-93，GB/T14679-93）。采氣時用硅膠管伸入桶中部采集氣體。實驗過程中無下雨，溫度16-28℃，無陽光直射，檢測結(jié)果如表1所示。表1除臭實驗檢測結(jié)果實驗組氨(mg/m3)硫化氫(mg/m3)14.782.4821.140.2435.262.7140.440.1154.652.53結(jié)果分析：除臭用EM菌液表現(xiàn)出良好的除臭效果，顯著的降低了實驗桶中的氨和硫化氫這兩種主要的臭味形成氣體，且氨和硫化氫的去除率隨用量的升高而增加，通過2和1，4和3的對照可以看出，菌液的除臭作用依賴于其中的微生物。3中氨和硫化氫均高于1和5可能系菌液中殘留的培養(yǎng)基促進了垃圾中產(chǎn)臭微生物的生長，同時3噴灑的水量較大，有助于產(chǎn)臭微生物的繁殖。當(dāng)前第1頁1 2 3