本發(fā)明涉及一株乳酸菌及其在酸漿豆腐生產(chǎn)中的應(yīng)用。技術(shù)背景酸漿點豆腐在我國有上千年的加工歷史。酸漿是豆腐制作過程中產(chǎn)生的廢水——黃漿水經(jīng)自然發(fā)酵變酸即為酸漿，利用其所含的乳酸來制作豆腐，制成的豆腐更為醇香，與石膏、鹽鹵以及內(nèi)酯等凝固劑相比，源自豆腐本身的酸漿更為天然、綠色和安全；同時，減少了豆腐廢水排放造成的環(huán)境污染。但是，由于酸漿是自然發(fā)酵的產(chǎn)物，受環(huán)境因素的影響較大，很難控制酸漿的酸度，導致生產(chǎn)的酸漿豆腐品質(zhì)不穩(wěn)定。另一方面，自然發(fā)酵過程中，除有益菌外，還有許多腐敗雜菌的存在，從而會導致所生產(chǎn)的酸漿豆腐保質(zhì)期短。若將酸漿的生產(chǎn)由自然發(fā)酵變?yōu)閲栏竦募兎N發(fā)酵，將會解決以上兩方面的問題，這也正是酸漿凝固劑標準生產(chǎn)的意義所在。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對自然發(fā)酵酸漿受環(huán)境因素的影響較大，難于控制的問題提供一株快速產(chǎn)酸的乳酸菌，該乳酸菌能夠在新鮮的黃漿水中快速生長產(chǎn)酸。該乳酸菌為干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）YQ336，已于2016年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12796。本發(fā)明的另一個目的在于，利用篩選到的干酪乳桿菌YQ336（LactobacilluscaseiYQ336）和市售的乳酸乳球菌制備酸漿凝固劑并應(yīng)用于酸漿豆腐的生產(chǎn)中。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：所述的LactobacilluscaseiYQ336的個體形態(tài)特征：大小為（0.7μm～1.1μm）×（2.0μm～4.0μm），桿狀或長桿狀，單個、成對或呈鏈狀排列，革蘭氏陽性，無芽孢、莢膜及鞭毛。菌落形態(tài)特征：菌落大小在1mm～3mm，正面為圓形，側(cè)面稍有突起，乳白色，不透明，菌落邊緣整齊，表面光滑，質(zhì)地柔軟有彈性。最適生長溫度為30-40℃，最適pH為5.5-6.8，在pH為4或者更低時仍可生長。具有良好的耐酸性、耐鹽性和耐膽汁能力。同型乳酸發(fā)酵，乳酸是最終的發(fā)酵終產(chǎn)物，不發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣。不產(chǎn)生脲酶，不能代謝精氨酸產(chǎn)氨。生長必需維生素B2、葉酸、鈣、泛酸和煙酸。該菌株的16SrDNA序列全長共1491bp，經(jīng)Genbank比對與Lactobacilluscasei相似性達到99%；結(jié)合其個體、群體形態(tài)特征，鑒定為Lactobacilluscasei，命名為LactobacilluscaseiYQ336。該菌株從遼寧省錦州市氣象臺農(nóng)貿(mào)市場豆腐作坊自然發(fā)酵黃漿水中分離獲得，經(jīng)測定其能夠在黃漿水發(fā)酵過程中快速生長并產(chǎn)酸。本發(fā)明的優(yōu)勢在于提供了一株能夠在新鮮黃漿廢水中快速產(chǎn)酸的純種發(fā)酵生長的乳酸菌，與市售乳酸乳球菌配伍接種于新鮮黃漿水中，經(jīng)6h發(fā)酵，其發(fā)酵液可作為酸漿豆腐生產(chǎn)的酸漿凝固劑，充分利用了副產(chǎn)物資源且生產(chǎn)出的酸漿豆腐風味好口感佳，深受廣大群眾的喜愛。本發(fā)明提供利用LactobacilluscaseiYQ336發(fā)酵生產(chǎn)酸漿凝固劑的方法：在冷卻至室溫的新鮮黃漿水中添加2%的葡萄糖，調(diào)pH至6.8，接種3%-5%種子培養(yǎng)液，靜置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵6h即為酸漿凝固劑。具體為：用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保藏的干酪乳桿菌YQ336于3mL黃漿水培養(yǎng)基中，37℃下發(fā)酵6h；另取一環(huán)乳酸乳球菌于3mL黃漿水培養(yǎng)基中，37℃下發(fā)酵6h。取上述干酪乳桿菌發(fā)酵液3mL和乳酸乳球菌發(fā)酵液1.5mL接入到100mL黃漿水培養(yǎng)基中37℃下發(fā)酵6h，獲得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液按3%-5%接種量接入黃漿水培養(yǎng)基，37℃下發(fā)酵6h，該發(fā)酵液即為酸漿凝固劑。黃漿水培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g，新鮮黃漿水1000mL。該酸漿凝固劑在豆腐生產(chǎn)中的使用方法：將酸漿凝固劑與蒸餾水按1:2稀釋后備用。500g干豆泡發(fā)、磨漿、過濾后煮沸，待溫度降至70℃，并保溫70℃開始用稀釋后的酸漿點漿，1-2min點漿一次約100mL左右，待出現(xiàn)明顯大量塊狀凝聚停止點漿。本發(fā)明所用材料及使用后產(chǎn)生的效果：（1）LactobacilluscaseiYQ336在新鮮黃漿水中可快速生長產(chǎn)酸，3%接種量發(fā)酵5小時，pH即可降到4以下，乳酸產(chǎn)量為12.36g/L。（2）與自然發(fā)酵酸漿凝固劑相比，LactobacilluscaseiYQ336和乳酸乳球菌混菌發(fā)酵酸漿凝固劑具有發(fā)酵速度快，無雜菌等致病菌污染，提高了生產(chǎn)速度并保證了豆腐食用安全性。（3）本發(fā)明所篩選的LactobacilluscaseiYQ336及所使用的乳酸乳球菌為益生菌，利用益生菌發(fā)酵黃漿水獲得的酸漿發(fā)酵液作為豆腐凝固劑，可以充分保證豆腐產(chǎn)品的食用安全性。（4）LactobacilluscaseiYQ336和乳酸乳球菌混菌發(fā)酵酸漿豆腐凝固劑所生產(chǎn)的豆腐感官質(zhì)量顯著優(yōu)于自然發(fā)酵酸漿豆腐凝固劑所生產(chǎn)的豆腐。具體實施方式實施例1發(fā)酵菌株的分離、篩選與鑒定1實驗材料黃漿水瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖20g，瓊脂15g，新鮮黃漿水1000mL，調(diào)pH至6.8，115℃滅菌30min。自然發(fā)酵黃漿水：取自錦州氣象臺農(nóng)貿(mào)市場豆腐作坊。黃漿水培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g，新鮮黃漿水1000mL。2發(fā)酵菌株的分離2.1樣品的稀釋用無菌吸管吸取自然發(fā)酵黃漿水25mL，移入盛有225mL無菌生理鹽水帶玻璃珠的三角瓶中，充分振搖均勻，即為10-1的樣品稀釋液。用無菌生理鹽水對10-1的樣品稀釋液進行梯度稀釋至10-7。2.2平板分離培養(yǎng)取上述10-5、10-6、10-7稀釋度的稀釋液各1mL分別注入無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度做三個重復(fù)。以無菌操作按20g/L的量將滅菌的CaCO3加入熔化了的黃漿水瓊脂培養(yǎng)基中，于自來水中迅速冷卻至50℃左右，邊冷卻邊搖晃將瓶內(nèi)CaCO3搖勻的同時，立刻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)搖勻，使樣品稀釋液和CaCO3均勻分布于培養(yǎng)基中。待培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。2.3平板接種培養(yǎng)用接種環(huán)挑取菌落周圍產(chǎn)生CaCO3溶解圈較大的菌落20株，編號后劃線接種于黃漿水瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)24h，反復(fù)純化3代，得到單菌落接種于黃漿水瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)24h。3菌株篩選3.1方法取上述20株斜面培養(yǎng)物各1環(huán)，進行涂片、革蘭氏染色，油鏡觀察個體形態(tài)和純度。同時分別挑取1環(huán)培養(yǎng)物接入3mL黃漿水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6h后，接入到100mL黃漿水培養(yǎng)基中37℃下發(fā)酵6h，獲得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液按3%接種量接入黃漿水培養(yǎng)基，37℃下發(fā)酵，以pH和乳酸含量（利用高效液相色譜法檢測乳酸含量）為指標，篩選出一株pH最低、產(chǎn)酸速度快的乳酸菌菌株YQ336。3.2結(jié)果3.2.1pH結(jié)果見表1由上述pH結(jié)果選擇pH最低的一株細菌336號進行菌種鑒定。3.2.2乳酸檢測結(jié)果3%接種量發(fā)酵5小時，pH即可降到4以下，乳酸產(chǎn)量為12.36g/L。4菌種鑒定4.1乳酸菌YQ336的形態(tài)特征觀察將乳酸菌菌株YQ336在黃漿水瓊脂培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)24h，然后進行革蘭氏染色，其個體形態(tài)特征見表2。表2YQ336菌株的形態(tài)特征菌株YQ336在黃漿水瓊脂培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)48h，觀察菌落大小、形態(tài)和顏色，結(jié)果見表3。表3菌落形態(tài)特征4.2乳酸菌YQ336的生理生化特征根據(jù)常規(guī)生理生化鑒定，結(jié)果見表4，參照《伯杰細菌鑒定手冊》，初步判斷菌株YQ336為乳桿菌屬。表4菌株生理生化特性4.3乳酸菌YQ336的16SrDNA序列分析結(jié)果該菌株的16SrDNA序列全長共1491bp，經(jīng)Genbank比對與Lactobacilluscasei相似性達到99%；結(jié)合其菌體的群體形態(tài)特征、個體形態(tài)特征、生理生化試驗結(jié)果及菌株的16SrDNA序列比對，確定該菌株為干酪乳桿菌，命名為LactobacilluscaseiYQ336，已于2016年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中科院微生物研究所，郵編100101），保藏編號為CGMCCNo.12796。實施例2LactobacilluscaseiYQ336在酸漿豆腐生產(chǎn)中的應(yīng)用1試驗材料試驗用的菌株為本發(fā)明分離的LactobacilluscaseiYQ336和市售乳酸乳球菌，自然發(fā)酵黃漿水采集自錦州市氣象臺農(nóng)貿(mào)市場豆腐作坊。2酸漿凝固劑的制備⑴種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g，新鮮黃漿水1000ml。⑵制備方法：用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保藏的干酪乳桿菌YQ336于3ml黃漿水培養(yǎng)基中，37℃下發(fā)酵6h；另取一環(huán)乳酸乳球菌于3mL黃漿水培養(yǎng)基中，37℃下發(fā)酵6h。取上述干酪乳桿菌發(fā)酵液3mL和乳酸乳球菌發(fā)酵液1.5mL接入到100mL黃漿水培養(yǎng)基中37℃下發(fā)酵6h，獲得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液按3%-5%接種量接入黃漿水培養(yǎng)基，37℃下發(fā)酵6h，該發(fā)酵液即為酸漿凝固劑。3微生物檢驗乳酸菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)分別按GB4789.35-2010和GB4789.3-2010方法測定。4自然發(fā)酵酸漿與混菌發(fā)酵酸漿的比較見表5表5自然發(fā)酵酸漿與混菌發(fā)酵酸漿比較發(fā)酵方法自然發(fā)酵混菌發(fā)酵最低pH3.603.35乳酸菌含量（cfu/mL）3.2×1084.9×1012大腸菌群數(shù)（個/100mL）1205酸漿豆腐的制作500g干豆泡發(fā)9個小時+5000mL水打漿，然后100目篩子過濾，過濾后先小火后大火煮沸，再100目篩子過濾，溫度降至70℃并維持70℃開始點漿（500mL酸漿1：2稀釋），1-2min點漿一次約100mL，待出現(xiàn)明顯大量塊狀凝聚停止點漿，再順時針方向攪拌豆?jié){至塊狀增大至不變且水固分離時，保溫養(yǎng)漿20min，再大火加熱至微沸1min，1000g重物壓制蹲腦20min；6自然發(fā)酵酸漿凝固劑與混菌發(fā)酵酸漿凝固劑生產(chǎn)豆腐的感官比較6.1感官評定組織從事食品研究的專業(yè)人員10人，成立評定小組，按照表6對制得的酸漿豆腐的色、香、味、形及綜合感官進行逐一評判，給出一個綜合評分，滿分為100分。6.2評定結(jié)果由表7可知LactobacilluscaseiYQ336和乳酸乳球菌混菌發(fā)酵酸漿豆腐凝固劑所生產(chǎn)的豆腐感官質(zhì)量顯著（P＜0.05）優(yōu)于自然發(fā)酵酸漿豆腐凝固劑所生產(chǎn)的豆腐。7自然發(fā)酵酸漿凝固劑與混菌發(fā)酵酸漿凝固劑生產(chǎn)豆腐的保水性7.1保水性測定方法：稱取2g(精確到0.0001g)豆腐，于底部有脫脂棉的50mL離心管中，以1000r/min轉(zhuǎn)速離心10min后稱重并記錄(W1)，置于105℃下干燥至恒重(W0)。豆腐保水性=[(W1-W0)/W1]×100%7.2結(jié)果從表8可以看出，混菌發(fā)酵酸漿豆腐凝固劑所生產(chǎn)的豆腐保水性顯著（P＜0.05）高于自然發(fā)酵酸漿豆腐凝固劑所生產(chǎn)的豆腐。8結(jié)論本發(fā)明從自然發(fā)酵黃漿水中篩選到一株快速產(chǎn)酸乳酸菌LactobacilluscaseiYQ336，利用該菌株產(chǎn)酸速度快的特性，將其與乳酸乳球菌混菌接入到新鮮黃漿水中發(fā)酵成酸漿凝固劑，用該酸漿凝固劑生產(chǎn)的豆腐特點是保水性好、質(zhì)地細膩、口味清淡略帶甘甜，安全無污染，避免了因使用鹽類凝固劑而將重金屬引入豆腐中，還可降低凝固劑成本，符合營養(yǎng)與安全的飲食理念。該酸漿凝固劑利用副產(chǎn)物新鮮黃漿水資源為原料，既能增加豆腐風味，又能減輕環(huán)境污染與治理壓力。SEQUENCELISTING<110>錦州醫(yī)科大學<120>干酪乳桿菌Lactobacilluscasei<130>應(yīng)用于酸漿豆腐的生產(chǎn)<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1491<212>DNA<213>錦州醫(yī)科大學<400>1cttagacggctcgctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctca60tggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccg120cgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaa180tggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtag240cacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctcc300ggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagg360gttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgc420accacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtc480aagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgc540gggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgct600taatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgttt660acggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcg720tcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcattt780caccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatg840cgcttcctcggttaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgct900ttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacg960tagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgacc1020attcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgc1080tccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgg1140gccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcatcgcct1200tggtgagccattacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagc1260ttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatctatgcggtattagcatctg1320tttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgcc1380actcgttccatgttgaatcttggtgcaagcaccgatcatcaacaagaactcgttcgactt1440gcatgtattaggcacgccgccagcgttcatcctgagccagattcaaactct1491當前第1頁1 2 3