本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是提供了一種金藻與光合細(xì)菌混合發(fā)酵的方法，具體是提供了一種球等鞭金藻與沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵的方法。
背景技術(shù)：
：球等鞭金藻屬于金藻門、普林藻綱、等鞭藻目、等鞭藻科。具有細(xì)胞膜薄、沒(méi)有細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)含量高、易被魚(yú)蝦蟹貝類消化吸收的特點(diǎn)，在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用在眾多微藻中，金藻由于個(gè)體小、無(wú)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜薄、易消化，油脂及多不飽和脂肪酸含量高等優(yōu)點(diǎn)，而成為一種研究?jī)r(jià)值極高的經(jīng)濟(jì)藻類。但是金藻對(duì)溫度、光照強(qiáng)度及營(yíng)養(yǎng)因子等條件要求苛刻，且易受其他微藻及原生動(dòng)物等各種微生物的污染。較難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)，因此，如何提高金藻的生長(zhǎng)速率及培養(yǎng)密度成為目前值得研究的一個(gè)課題。王雪青等通過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最終能得到球等鞭金藻的量達(dá)2.989×106個(gè)/ml。沙氏外硫紅螺菌，專性自養(yǎng)菌，厭氧菌，相對(duì)地耐氧，在空氣中馴化可生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞無(wú)色，細(xì)胞懸液的顏色最初呈顯黃色到橙棕色，后來(lái)為棕紅色到粉紅色。PH最適范圍：8-8.5，最適生長(zhǎng)溫度30-35℃；沙氏外硫紅螺菌有較大的適應(yīng)范圍，10-40℃、500-6000lux和PH7-9.5，鹽度為千分之三十五以下，均能適應(yīng)生長(zhǎng)，在微好氧黑暗狀態(tài)下也能生存，條件不適時(shí)，該菌的生長(zhǎng)處于抑制狀態(tài)，一旦條件允許，又能繼續(xù)生長(zhǎng)。光合電子供體：硫化物，硫、硫代硫酸鹽，分子氫、醋酸鹽、丁酸鹽、丙酸鹽、蘋果酸鹽、乳酸鹽。氮源：銨鹽、谷氨酸鹽、天門冬氨酸鹽。能進(jìn)行同化型的硫酸鹽還原作用，具有較強(qiáng)的降解硫化氫，亞硝酸鹽的能力，具有較好的凈水效果。在水產(chǎn)動(dòng)物苗種培育過(guò)程中，由于水質(zhì)凈化與營(yíng)養(yǎng)餌料的要求較多及對(duì)營(yíng)養(yǎng)的平衡需要,經(jīng)常對(duì)不同動(dòng)物或不同生長(zhǎng)階段的相同動(dòng)物同時(shí)投喂不同微藻與光合細(xì)菌，而生產(chǎn)上是分別以單一品種培養(yǎng)后再加以混合的投喂方式進(jìn)行,這對(duì)維持不同微藻與光合細(xì)菌的單種培養(yǎng)及其最佳數(shù)量比例的提供是一個(gè)難題。解決該難題的有效方法之一是開(kāi)發(fā)高效的共培養(yǎng)體系。然而，共培養(yǎng)并非單種培養(yǎng)下的簡(jiǎn)單組合，其生長(zhǎng)特性和生化成份與單種培養(yǎng)相比存在較大的差異。已有研究顯示，影響共培養(yǎng)生長(zhǎng)的因子較多,如溫度、鹽度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽以及接種密度等，盡管張金燕等在專利號(hào)CN101363005中已經(jīng)公開(kāi)了一種微細(xì)藻類和光合細(xì)菌共培養(yǎng)的方法，但其主要公開(kāi)的是一種小球藻和沼澤紅假單胞菌兩種淡水藻與菌的培養(yǎng)方法，雖然在球等鞭金藻或沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)方面都有報(bào)道，但是在如何利用球等鞭金藻與沙氏外硫紅螺菌的各自生理生態(tài)特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)二者在同一培養(yǎng)基及理化條件下都能夠快速生長(zhǎng)并達(dá)到較高的生物量方面卻未見(jiàn)研究報(bào)道。而且沒(méi)有公開(kāi)過(guò)海水藻與菌的混合培養(yǎng)方法，本發(fā)明公開(kāi)的金藻與光合細(xì)菌混合發(fā)酵的方法在生產(chǎn)上可充分利用空間和資源，在應(yīng)用上可實(shí)現(xiàn)菌藻優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，因此在規(guī)?；a(chǎn)藻菌方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。而且現(xiàn)有的單一培養(yǎng)的微藻的液體保存時(shí)間短，無(wú)法做為商品藻進(jìn)行出售，也是一個(gè)限制因素。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種金藻和光合細(xì)菌混合發(fā)酵的方法，具體的是提供一種能夠大大延長(zhǎng)保質(zhì)期，大大提高金藻菌體含量的一種金藻與沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵的方法，其特征在于，采用球等鞭金藻與紫硫光合細(xì)菌中的沙氏外硫紅螺菌菌種按以下步驟進(jìn)行培養(yǎng)：⑴沙氏外硫紅螺菌半固體種子活化培養(yǎng)：將沙氏外硫紅螺菌種穿刺在半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基中，25-30℃，光照強(qiáng)度為：1000-6000lux，光照培養(yǎng)7-10天，待穿刺的菌線變紅并長(zhǎng)出菌苔，即可為活化的沙氏外硫紅螺菌種；⑵沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)：將活化的菌種接種至沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基中，溫度25-30℃，光照強(qiáng)度為：1000-6000lux，光照厭氧培養(yǎng)7-10天，檢測(cè)種子的OD650≥1.2，活菌數(shù)≥6億cfu/ml即為種子培養(yǎng)液；⑶球等鞭金藻種子培養(yǎng)：將球等鞭金藻接種到2000mL三角燒瓶中的金藻培養(yǎng)基進(jìn)行活化純培養(yǎng),光照為3000lx,溫度為27℃,不充氣培養(yǎng),每天搖動(dòng)攪拌6次,培養(yǎng)4-9天，待球等鞭金藻的含量≥100萬(wàn)個(gè)/ml，即為球等鞭金藻種子培養(yǎng)液；⑷發(fā)酵培養(yǎng)：將球等鞭金藻種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基以1：4-1：8的接種量接種，同時(shí)將沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按1：10-1：15的接種量接入，在光照培養(yǎng)罐中間歇通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-28℃，光照強(qiáng)度為：1000-6000lux，攪拌速度為80轉(zhuǎn)/分鐘，光暗比為12L：12D，即每天12小進(jìn)光照，12小時(shí)黑暗培養(yǎng)，利用磷酸調(diào)PH，使PH不高于8.5，培養(yǎng)6-10天，待血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)其沙氏外硫紅螺菌不低于30億cfu/ml，球等鞭金藻不低于4000萬(wàn)個(gè)/ml，即可放罐，灌裝，包裝成品。其中，所述的半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基為:氯化銨0.8-2.0g/L，磷酸二氫鉀0.5-1g/L，二水氯化鈣0.05-0.2g/L，氯化鎂0.1-0.5g/L，碳酸氫鈉1-3g/L,醋酸鈉2-5g/L，九水硫化鈉0.1-1g/L，瓊脂8-10g/L，氯化鈉20-30g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調(diào)PH至7.0-7.2,其中九水硫化鈉先配制成0.1g/mL單獨(dú)滅菌；其中，所述的沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基為：氯化銨0.8-2.0g/L，磷酸二氫鉀0.5-1g/L，二水氯化鈣0.05-0.2g/L，氯化鎂0.1-0.5g/L，醋酸鈉2-10g/L,碳酸氫鈉1-3g/L，氯化鈉20-30g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調(diào)PH至7.0-7.2；其中，所述的金藻液體培養(yǎng)基為:硝酸鈉0.1g，磷酸二氫鉀0.01g，微量元素1ml，復(fù)合維生素1ml,海水1L,121℃滅菌15分鐘；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：硝酸鈉0.1g，氯化銨0.8g/L，氯化鉀0.5g/L，EDTA二鈉0.5g/L，氯化鎂0.2g/L，醋酸鈉4g/L，碳酸氫鈉6g/L，氯化鈉2g/L，硅酸鈉0.01g/L，微量元素1ml，復(fù)合維生素1ml,用磷酸調(diào)PH至7.2-7.5。其中，所述的微量元素組成為：4.5g，硫酸亞鐵0.5g，濃硫酸0.05ml，硫酸鋅30mg，氯化錳0.2g，硼酸30mg，氯化鈷20mg，氯化銅10mg，氯化鎳2mg，鉬酸鈉3mg，檸檬酸鐵4g，蒸餾水1000毫升，PH3-4，121℃滅菌15分鐘；其中，所述的復(fù)合維生素：VB1100mg，VB120.5mg，蒸餾水1L，過(guò)濾除菌。本發(fā)明所培養(yǎng)的金藻和光合細(xì)菌都屬于光合微生物，雖然它們進(jìn)行光合作用的代謝途徑和機(jī)理不同，但在共同培養(yǎng)條件下可以對(duì)培養(yǎng)基的高效利用產(chǎn)生協(xié)同作用。如光合細(xì)菌在好氧和厭氧不同條件下有多種代謝途徑，對(duì)有機(jī)物代謝的產(chǎn)物二氧化碳可以被金藻利用，同時(shí)金藻通過(guò)光合作用產(chǎn)生的氧氣可以有助于光合細(xì)菌通過(guò)好氧方式利用有機(jī)物。因此，金藻與光合細(xì)菌共同培養(yǎng)不僅能夠使培養(yǎng)基的成分得到充分利用，而且各自本身所具有的生理生態(tài)特點(diǎn)也可以使二者同時(shí)受益，促進(jìn)共同生長(zhǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：球等鞭金藻和沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵時(shí)，在共同培養(yǎng)條件下能夠使球等鞭金藻和沙氏外硫紅螺菌同時(shí)持續(xù)快速生長(zhǎng)，且最終獲得較高的生物量，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)出高細(xì)胞濃度的藻菌培養(yǎng)物，可以作為水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料和凈水劑等進(jìn)行應(yīng)用。單獨(dú)發(fā)酵的藻液在常溫下保存時(shí)由于藻體代謝旺盛，老化及雜菌增長(zhǎng)等原因影響藻液的保存效果。由此，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，藻體生理活動(dòng)的延續(xù)，水體中營(yíng)養(yǎng)的消耗，水體中積累的藻體代謝物必然增加，且藻體自身攜帶雜菌可能也不斷增長(zhǎng)，消耗水體溶氧以及營(yíng)養(yǎng)從而導(dǎo)致藻體活性降低。球等鞭金藻和沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵后，可使混合菌藻液保存過(guò)程中增加藻液中溶氧，藻體代謝物得以適當(dāng)分解，抑制了藻液中有害細(xì)菌的增長(zhǎng)，減少有害物質(zhì)的積累；其次減輕了藻體的自氧化，減緩老化，增強(qiáng)自身活性，提升了整體成活率。因此，明顯延長(zhǎng)了球等鞭金藻的保存時(shí)間，可使用保存時(shí)間從2個(gè)月延長(zhǎng)至4-6個(gè)月。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種金藻與光合細(xì)菌混合發(fā)酵的方法，其特征在于，采用球等鞭金藻與紫硫光合細(xì)菌中的沙氏外硫紅螺菌菌種按以下步驟進(jìn)行培養(yǎng)：⑴沙氏外硫紅螺菌半固體種子活化培養(yǎng)：將沙氏外硫紅螺菌種穿刺在半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基中，30℃，光照強(qiáng)度為：4000lux，光照培養(yǎng)8天，待穿刺的菌線變紅并長(zhǎng)出菌苔，即可為活化的沙氏外硫紅螺菌種；⑵沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)：將活化的菌種接種至沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基中，溫度30℃，光照強(qiáng)度為：4000lux，光照厭氧培養(yǎng)8天，檢測(cè)種子的OD650為1.3，活菌數(shù)為6.5億cfu/ml即為種子培養(yǎng)液；⑶球等鞭金藻種子培養(yǎng)：將球等鞭金藻接種到2000mL三角燒瓶中的金藻培養(yǎng)基進(jìn)行活化純培養(yǎng),光照為3000lx,溫度為27℃,不充氣培養(yǎng),每天搖動(dòng)攪拌6次,培養(yǎng)8天，待球等鞭金藻的含量110萬(wàn)個(gè)/ml，即為球等鞭金藻種子培養(yǎng)液；⑷發(fā)酵培養(yǎng)：將球等鞭金藻種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基以1：6的接種量接種，同時(shí)將沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按1：12的接種量接入，在光照培養(yǎng)罐中間歇通氣培養(yǎng)，每小時(shí)通氣5分鐘，每分鐘通氣量為液體培養(yǎng)基的0.2倍，培養(yǎng)溫度28℃，光照強(qiáng)度為：5000lux，攪拌速度為80轉(zhuǎn)/分鐘，光暗比為12L：12D，即每天12小進(jìn)光照，12小時(shí)黑暗培養(yǎng)，利用磷酸調(diào)PH，使PH不高于8.5，培養(yǎng)9天，待血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)其沙氏外硫紅螺菌為32億cfu/ml，球等鞭金藻為4100萬(wàn)個(gè)/ml，即可放罐，灌裝，包裝成品；其中，所述的半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基為:氯化銨0.9g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，二水氯化鈣0.1/L，氯化鎂0.3g/L，碳酸氫鈉3g/L,醋酸鈉3g/L，九水硫化鈉0.2g/L，瓊脂9g/L，氯化鈉25g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調(diào)PH至7.0-7.2,其中九水硫化鈉先配制成0.1g/mL單獨(dú)滅菌；其中，所述的沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基為：氯化銨1.0g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，二水氯化鈣0.1g/L，氯化鎂0.3g/L，醋酸鈉4g/L,碳酸氫鈉3g/L，氯化鈉25g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調(diào)PH至7.0-7.2；其中，所述的金藻液體培養(yǎng)基為:硝酸鈉0.1g，磷酸二氫鉀0.01g，微量元素1ml，復(fù)合維生素1ml,海水1L,121℃滅菌15分鐘；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：硝酸鈉0.1g，氯化銨0.8g/L，氯化鉀0.5g/L，EDTA二鈉0.5g/L，氯化鎂0.2g/L，醋酸鈉4g/L，碳酸氫鈉6g/L，氯化鈉2g/L，硅酸鈉0.01g/L，微量元素1ml，復(fù)合維生素1ml,用磷酸調(diào)PH至7.2-7.5；其中，所述的微量元素組成為：4.5g，硫酸亞鐵0.5g，濃硫酸0.05ml，硫酸鋅30mg，氯化錳0.2g，硼酸30mg，氯化鈷20mg，氯化銅10mg，氯化鎳2mg，鉬酸鈉3mg，檸檬酸鐵4g，蒸餾水1000毫升，PH3-4，121℃滅菌15分鐘；其中，所述的復(fù)合維生素：VB1100mg，VB120.5mg，蒸餾水1L，過(guò)濾除菌。實(shí)施例2混合金藻與光合細(xì)菌發(fā)酵的有效期試驗(yàn)試驗(yàn)組：混合金藻與光合細(xì)菌發(fā)酵，初始金藻含量為4100萬(wàn)個(gè)/ml，每隔一個(gè)月檢測(cè)其金藻的成活率；對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)的金藻，初始金藻含量為320萬(wàn)個(gè)/ml，每個(gè)月檢測(cè)其成活率。指標(biāo)測(cè)定成活率測(cè)定：使用I-KI試劑對(duì)藻體進(jìn)行染色，以確定存活細(xì)胞和死亡細(xì)胞，以1:1體積比將I-KI試劑添加至菌藻液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)存活細(xì)胞；活藻細(xì)胞除以初始藻細(xì)胞量即為成活率。試驗(yàn)結(jié)果：如表1可以看出，混合發(fā)酵中的金藻半年后成活率還可以達(dá)到51.2%，而對(duì)照組只在常溫下存活90天存活率只有45.4%，另外，按金藻的凈含量即使保存了半年后，其存活藻含量也達(dá)到了2099萬(wàn)個(gè)/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)培養(yǎng)的藻含量（初始金藻含量為320萬(wàn)個(gè)/ml）。表1金藻常溫保存成活率的變化。時(shí)間/成活率30天60天90天120天150天180天試驗(yàn)組98.6%93.7%88.9%79.9%65.8%51.2%對(duì)照組82.4%66.4%45.4%21.8%10.4%4.1%實(shí)施例3混合發(fā)酵的金藻與光合細(xì)菌在海灣扇貝(Argopectonirradians)幼體及稚貝培育期水質(zhì)凈化劑及輔助餌料育苗生產(chǎn)試驗(yàn)2015年2月8日-3月20日，在湛江市覃斗鎮(zhèn)某海水育苗場(chǎng)80m3水體育苗池中，每天施用量為1L金藻與光合細(xì)菌混合發(fā)酵液；試驗(yàn)結(jié)果：浮游幼體生長(zhǎng)速度提高了38.4%，浮游期成活率提高60.3%，幼體提前40個(gè)小時(shí)出現(xiàn)眼點(diǎn)，稚貝變態(tài)平提高24.5%，產(chǎn)量提高195%，取得了顯著效果。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3