本發(fā)明涉及吡咯伯克霍爾德氏菌的應(yīng)用及其降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法，屬于環(huán)境微生物應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：鄰苯二甲酸2-乙基己酯（Bison（2-ethylhexyl）ortho-phthalate），簡(jiǎn)稱DEHP，是一類重要的環(huán)境激素類有機(jī)合成化合物，在工業(yè)生產(chǎn)中主要用作聚氯乙烯(PVC)塑料增塑劑，提高塑料的可塑性和易彎曲性。塑料中，DEHP與塑料分子以氫鍵或范德華力連接，很容易通過淋洗、遷移或蒸發(fā)等方式進(jìn)入食物、空氣、飲用水及其它物質(zhì)中；DEHP也可以在塑料生產(chǎn)或燃燒過程中通過煙塵沉降釋放到環(huán)境中。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示DEHP具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、胚胎毒性、肝臟毒性及致癌性等多種毒性，并具有引起甲狀腺素代謝改變的類雌激素活性。美國(guó)環(huán)保局（EPA）、歐盟以及中國(guó)國(guó)家環(huán)境監(jiān)測(cè)中心均已將其列入優(yōu)先控制污染物黑名單。環(huán)境中DEHP的分解、轉(zhuǎn)化方法及技術(shù)探索已成為環(huán)境污染治理的重要研究方向。但是DEHP在自然環(huán)境中的水解、光解速度非常緩慢，屬于難降解物質(zhì)。有研究表明，DEHP的水解半衰期達(dá)2000年，光解半衰期也需要105年。與水解及光解等物理降解相比，基于微生物代謝的生物降解過程具有功能微生物多樣性、過程簡(jiǎn)單、成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn)，使得微生物降解被認(rèn)為是自然環(huán)境中DEHP完全礦化的最有效途徑。因此，篩選高效分解DEHP的微生物并闡明其分解代謝途徑，對(duì)于深化有關(guān)消除DEHP環(huán)境危害的研究及應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義。近年來，DEHP的微生物降解已經(jīng)得到廣泛的研究，大量能高效降解DEHP的菌株已經(jīng)從各類環(huán)境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性污泥等，微生物類別包括大量細(xì)菌以及部分真菌。研究表明，不同來源以及不同類型的微生物在DEHP降解途徑方面具有較大差異性，所呈現(xiàn)的降解機(jī)制也不盡相同。所述降解機(jī)制包括發(fā)揮降解作用的關(guān)鍵酶及酶系、降解途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及關(guān)鍵影響因素、微生物自身代謝與降解效果之間的關(guān)系、微生物降解廣譜性與特異性及其與DEHP結(jié)構(gòu)的關(guān)系等。吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia），其應(yīng)用主要在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和植物病害的生物防治；目前未見有關(guān)利用吡咯伯克霍爾德氏菌降解DEHP的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的新菌株；及該菌株的應(yīng)用和采用該菌株降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法。技術(shù)方案本發(fā)明從土壤中篩選并分離出了一株新的菌株；是桿狀的革蘭氏陰性菌，且不能形成芽孢；經(jīng)鑒定，該菌株是一種吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）；命名為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213；保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號(hào)為CGMCCNo.12806；保藏時(shí)間為2016年7月21日。本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯；吡咯伯克霍爾德氏菌B1213對(duì)鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率可高達(dá)55.66-73.49%。采用本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的其中一種方法為：在酵母提取物存在的條件下，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213與DEHP接觸。其中，酵母提取物的量會(huì)影響降解率。所以，上述方法，優(yōu)選的，在改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基存在的條件下，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213與DEHP接觸；所述改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉4.0g，三水合磷酸鉀0.5g，七水合硫酸鎂0.4g，蒸餾水余量；pH7.0。具體的，是將DEHP加入改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基；將吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液接種于改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，在150-200rpm、30-35℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)。上述方法，優(yōu)選的，改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中酵母提取物的含量為7g/L。上述方法，優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速175rpm，溫度30℃，其他條件相同情況下，此條件下菌B1213的降解率最高。上述方法，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液相對(duì)于改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的接種量的變化，對(duì)單位時(shí)間內(nèi)的DEHP降解率有明顯影響；通常情況下，接種量越多，單位時(shí)間內(nèi)降解率越高；但是對(duì)最終降解率（發(fā)酵液中DEHP含量達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的降解率）沒有明顯影響。上述方法，所述吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液是由吡咯伯克霍爾德氏菌B1213培養(yǎng)獲得的。在獲得吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)操作即可以獲得吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液。本發(fā)明中，對(duì)于某個(gè)成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比（w/w）。本發(fā)明所用專業(yè)術(shù)語說明：rpm是轉(zhuǎn)速單位，1rpm是指每分鐘旋轉(zhuǎn)一轉(zhuǎn)。有益效果：（1）首次分離培養(yǎng)出能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213；（2）吡咯伯克霍爾德氏菌B1213對(duì)鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率為55.66-73.49%；（3）本發(fā)明降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法，與本發(fā)明之前細(xì)菌、真菌降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法相比，在菌種來源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作簡(jiǎn)單。保藏信息：保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2016年7月21日；保藏編號(hào)：CGMCCNo.12806；分類命名：吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）。附圖說明圖1為本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213在顯微鏡下的形態(tài)特征；圖1中，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213為桿狀的革蘭氏陰性菌，且不能形成芽孢；圖2為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析；圖3為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的recA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常用方法。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1菌株B1213的鑒定菌株B1213分離自土壤，其形態(tài)如圖1所示，屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，不能形成芽孢。提取其基因組DNA，并利用16srDNA和BCR1引物對(duì)于該基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,簡(jiǎn)稱NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行菌株比對(duì)。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1492R：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，如SEQIDNO.2所示；擴(kuò)增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全長(zhǎng)為1411bp。將該擴(kuò)增所得16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)菌株的基因序列進(jìn)行比較，用MEGA4.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用臨位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算Bootstrap值，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標(biāo)的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1213”與模式菌株BurkholderiastabilisLMG28156、同源性達(dá)99.7％。(2)recA基因序列分析BCR1基因正向引物：5'-TgACCgCCgAgAAgAgCAA-3'，如SEQIDNO.4所示；BCR2基因反向引物：5'-CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC-3'，如SEQIDNO.5所示；擴(kuò)增所得recA基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全長(zhǎng)為974bp。將該擴(kuò)增所得recA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)菌株的基因序列進(jìn)行比較，用用MEGA4.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用臨位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算Bootstrap值，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標(biāo)的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出出菌株“B1213”與模式菌株BurkholderiapyrrociniaDSM10685T(CP011503)同源性達(dá)97.9％。因此可以判定B1213為一種全新的吡咯伯克霍爾德氏菌。經(jīng)過鑒定確認(rèn)其所屬菌種后，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213于2016年7月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏編號(hào)為CGMCCNo.12806；此生物材料已經(jīng)存活試驗(yàn)測(cè)試并通過該試驗(yàn)。實(shí)施例2吡咯伯克霍爾德氏菌B1213液體搖瓶培養(yǎng)液制備（1）斜面培養(yǎng)：吡咯伯克霍爾德氏菌B1213接種于斜面培養(yǎng)基上，在40℃下培養(yǎng)48小時(shí)，得斜面菌株。所用斜面培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、瓊脂1.8g、蒸餾水余量，pH為中性，115℃滅菌20min。（2）取斜面菌株接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在175rpm、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液。所用種子培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、瓊脂粉15g、酵母提取物5g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌25min。（3）將10μL的DEHP（工業(yè)純）以無菌操作加入含有50mL的改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的搖瓶中，將吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的種子培養(yǎng)液以1mL的接種量接種到搖瓶中，在175r/min、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)72h；得發(fā)酵液。所用改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：酵母提取物5g、硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌15min。實(shí)施例3DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線制定與含量測(cè)定（1）高效液相色譜法（HPLC）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取600μLDEHP標(biāo)品以甲醇為溶劑，制備成1mg/mL的DEHP溶液，稀釋十倍后分別取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL定容至2mL離心管中，即濃度梯度（μg/mL）為10、20、30、40、50、60、70分別用0.45μm有機(jī)濾膜過濾后置于液相小瓶中待測(cè)。本實(shí)施例3中的高效液相檢測(cè)條件為：色譜柱為SepaxGp-C18柱（150mm*4.6mm，5.0μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（83：17，V/V）；進(jìn)樣量10μL；流速1.0mL/min；柱溫25C°；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210nm。以DEHP的峰面積為橫坐標(biāo)，以DEHP的濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；進(jìn)而獲得峰面積-濃度方程。實(shí)施例4高效液相法檢測(cè)DEHP的降解率（1）向?qū)嵤├?獲得的發(fā)酵液中加入與發(fā)酵液等量的乙腈對(duì)DEHP進(jìn)行提取，超聲（40KHZ，300W）輔助提取30min后取2mL溶液用乙腈定容至10mL混合后離心（12000rpm,10min），將離心后的上清液用有機(jī)濾膜（0.45μm）進(jìn)行過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液置于液相小瓶中，以實(shí)施例3步驟（1）的檢測(cè)條件，采用高效液相色譜儀（HPLC）進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)行時(shí)間為20分鐘，讀取保留時(shí)間在7min左右的峰面積值，根據(jù)實(shí)施例3的峰面積-濃度方程，得續(xù)濾液中DEHP的濃度，進(jìn)而計(jì)算出發(fā)酵液中DEHP的殘留濃度。（2）降解率的計(jì)算公式：降解率%=(C0-C)/C0*100%，C0為用吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解之前的DEHP質(zhì)量濃度（μg/mL）（即實(shí)施例2步驟（3）發(fā)酵培養(yǎng)之前搖瓶中混合液的DEHP質(zhì)量濃度：0.1713μg/mL）中，C為發(fā)酵液中的DEHP殘留濃度（μg/mL）。經(jīng)計(jì)算，實(shí)施例2的降解率為66.73%。實(shí)施例5吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解DEHP的優(yōu)化將實(shí)施例2步驟（3）中的種子液接種量依次改為2、3、4、5、6mL，其他操作同實(shí)施例2。按照實(shí)施例4的步驟測(cè)定發(fā)酵液的DEHP濃度，進(jìn)而計(jì)算DEHP的降解率。在不同接種量條件下，DEHP降解率如表1所示。實(shí)施例6吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解DEHP的優(yōu)化將實(shí)施例2步驟（3）中所用改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的酵母提取物的含量依次修改為2、3、4、6、7、8、10g/L；其他操作同實(shí)施例2。按照實(shí)施例4的步驟測(cè)定發(fā)酵液的DEHP濃度，進(jìn)而計(jì)算DEHP的降解率。在不同酵母提取物的含量條件下，DEHP降解率如表2所示。表1種子液接種量（mL）DEHP降解率（%）00166.73268.29370.25470.63570.54670.21；表2酵母提取物的含量（g/L）DEHP降解率（%）00255.66358.35459.18566.73670.38773.49872.151072.08<110>北京工商大學(xué)<120>吡咯伯克霍爾德氏菌的應(yīng)用及其降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>2ACGGTTACCTTGTTACGACTT21<210>3<211>1411<212>DNA<213>人工合成<400>3ACATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAG60TAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCG120CATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGAT180GGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTG240AGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG300TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG360CCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGCTCTAATACAGTCGGGG420GATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG480TAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAG540ACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGT600ATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAAT660ACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGA720GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGG780GATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCG840CAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTA900ATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCCGCTGAGAGG960TGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC1020GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAG1080AGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCT1140CATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAA1200CCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTC1260GAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTC1320CCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAG1380TCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTA1411<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4TgACCgCCgAgAAgAgCAA19<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC21<210>6<211>974<212>DNA<213>人工合成<400>6TCATGCGCATGGGCGACGGCGAGGCGGCCGAAGACATCCAGGTCGTCTCCACGGGTTCGC60TGGGGCTCGACATCGCGCTTGGCGTCGGCGGCTGCCGCGCGGCCGGGTGGTCGAGATCTA120CGGCCCGGAATCGTCCGGTAAAACCACGCTCACGCTGCAGGTCATCGCCGAACTGCAGAA180GATCGGCGGCACGGCCGCGTTCATCGACGCCGAACACGCGCTCGACGTTCAATATGCGTC240GAAGCTCGGCGTGAACGTGCCGGAACTGCTGATCTCGCAGCCGGACACCGGCGAACAGGC300ACTGGAAATCACCGATGCGCTGGTGCGCTCGGGCTCGGTCGACATGATCGTCATCGACTC360GGTCGCGGCGCTCGTGCCGAAGGCCGAAATCGAAGGCGAGATGGGCGATTCGCTGCCGGG420CCTGCAGGCTCGCCTGATGTCGCAGGCGCTGCGCAAGCTGACCGGCACGATCAAGCGCAC480GAACTGCCTGGTGATCTTCATCAACCAGATTCGCATGAAGATCGGCGTGATGTTCGGCAA540CCCGGAAACCACGACGGGCGGCAACGCGCTGAAGTTCTATGCGTCGGTGCGTCTCGATAT600CCGCCGGATCGGCTCGATCAAGAAGAACGACGAGGTGATCGGCAACGAAACCCGCGTGAA660GGTCGTCAAGAACAAGGTGTCGCCGCCGTTCCGCGAAGCGATCTTCGACATCCTGTATGG720CGAGGGCATTTCGCGTCAGGGCGAGATCATCGATCTCGGCGTGCAGGCAAAGATCGTCGA780CAAGGCGGGCGCCTGGTACAGCTACAACGGCGAGAAGATCGGCCAGGGCAAGGACAACGC840GCGTGAATTCCTGCGCGAGAATCCGGAAATCGCACGCGAGATCGAAAACCGCATCCGCGA900ATCGCTCGGCGTCGTCGCCAAGGCGCTGGCGGCCGCACTCGCGCAGATCGAGAAGCAGTT960CGGCAAAGGGTCGA974當(dāng)前第1頁1 2 3