本發(fā)明涉及莫海威芽胞桿菌的應(yīng)用及其降解萘的方法，屬于環(huán)境微生物應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：萘(naphthalene,NAP)是環(huán)境中普遍存在的具有代表性的一類重要持久性有機(jī)污染物(persistentorganicpollutants，POPs)。大量研究已經(jīng)證明，萘具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變的“三致”作用，是環(huán)境中一類危險而且需重點研究的、也是各國優(yōu)先控制的污染物。由于大氣沉降、污水灌溉、固體廢棄物填埋滲漏、油田開采和石油產(chǎn)品大量使用等，造成全球范圍內(nèi)地方土壤萘污染，在我國許多地方已出現(xiàn)較嚴(yán)重污染的情況。萘由于性質(zhì)穩(wěn)定、難于降解，在土壤環(huán)境中呈不斷積累的趨勢，嚴(yán)重危害著土壤的生產(chǎn)和生態(tài)功能、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人類健康。目前，治理污染土壤的方法主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。其中生物修復(fù)技術(shù)因具有成本低、無二次污染、可大面積應(yīng)用等獨(dú)特優(yōu)點而越來越受到人們的重視，是目前最具潛力的土壤修復(fù)技術(shù)之一。莫海威芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）主要應(yīng)用在脂肪酶的發(fā)酵，目前未見有關(guān)利用莫海威芽孢桿菌降解萘的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能夠降解萘的新菌株；及該菌株的應(yīng)用和采用該菌株降解萘的方法。技術(shù)方案本發(fā)明從土壤中篩選并分離出了一株新的菌株；是桿狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢；經(jīng)鑒定，該菌株是一種莫海威芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）；命名為莫海威芽孢桿菌B1811；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號為CGMCCNo.12805；保藏時間為2016年7月21日。本發(fā)明的莫海威芽孢桿菌B1811能夠降解萘（NAP）；莫海威芽孢桿菌B1811對NAP的降解率可高達(dá)96.4-99.6%。采用本發(fā)明的莫海威芽孢桿菌B1811降解NAP的其中一種方法為：在酵母提取物存在的條件下，莫海威芽孢桿菌B1811與NAP接觸。其中，酵母提取物的量會影響降解率。所以，上述方法，優(yōu)選的，在改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基存在的條件下，莫海威芽孢桿菌B1811與NAP接觸；所述改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有以下成分：酵母提取物3-8g，硫酸銨0.5g，氯化鈉4.0g，三水合磷酸鉀0.5g，七水合硫酸鎂0.4g，蒸餾水余量；pH7.0。具體的，是將NAP加入改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基；將莫海威芽孢桿菌B1811種子液接種于改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，在150-200rpm、30-35℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)。上述方法，優(yōu)選的，改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中酵母提取物的含量為6g/L。上述方法，優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速175rpm，溫度30℃，其他條件相同情況下，此條件下菌B1811的降解率最高。上述方法，莫海威芽孢桿菌B1811種子液相對于改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的接種量的變化，對單位時間內(nèi)的NAP降解率有明顯影響；通常情況下，接種量越多，單位時間內(nèi)降解率越高；但是對最終降解率（發(fā)酵液中NAP含量達(dá)到穩(wěn)定時的降解率）沒有明顯影響。上述方法，所述莫海威芽孢桿菌B1811種子液是由莫海威芽孢桿菌B1811培養(yǎng)獲得的。在獲得莫海威芽孢桿菌B1811的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)操作即可以獲得莫海威芽孢桿菌B1811種子液。本發(fā)明中，對于某個成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比（w/w）。本發(fā)明所用專業(yè)術(shù)語說明：rpm是轉(zhuǎn)速單位，1rpm是指每分鐘旋轉(zhuǎn)一轉(zhuǎn)。有益效果：（1）首次分離培養(yǎng)出能夠降解萘的莫海威芽孢桿菌B1811；（2）莫海威芽孢桿菌B1811對萘的降解率最高為99.6%；（3）本發(fā)明降解萘的方法，與本發(fā)明之前細(xì)菌、真菌降解萘的方法相比，在菌種來源上具有新意，其對萘的降解效果顯著，降解周期短，操作簡單。保藏說明：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所保藏日期：2016年7月21日保藏編號：CGMCCNo.12805分類命名：莫海威芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）。附圖說明圖1為本發(fā)明中所述莫海威芽孢桿菌B1811的顯微鏡下形態(tài)特征；圖1中，莫海威芽孢桿菌B1811為桿狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢；圖2為采用紫外分光光光度法獲得的吸光值（OD）-萘濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為莫海威芽孢桿菌B1811與相關(guān)種的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析；圖4為莫海威芽孢桿菌B1811與相關(guān)種的recA序列系統(tǒng)發(fā)育分析。具體實施方式下述實施例中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常用方法；所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1菌株B1811的鑒定菌株B1811分離自土壤，其形態(tài)如圖1所示，屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢。提取其基因組DNA，并利用16srDNA和BCR1引物對于該基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,簡稱NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行菌株比對。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，如SEQIDNO.2所示；擴(kuò)增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全長為1461bp。將該擴(kuò)增所得16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌株的基因序列進(jìn)行比較，用MEGA4.1軟件進(jìn)行序列比對，采用臨位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機(jī)抽樣，計算Bootstrap值，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標(biāo)的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1811”與模式菌株BacillusmojavensisRO-H-1T/JH600280同源性達(dá)99.8％。(2)gyrB基因序列分析gyrB-34F基因正向引物：5'-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3'，如SEQIDNO.4所示；gyrB-977R基因反向引物：5'-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3'，如SEQIDNO.5所示；擴(kuò)增所得gyrB基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全長為887bp。將該擴(kuò)增所得gyrB基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌株的基因序列進(jìn)行比較，用用MEGA4.1軟件進(jìn)行序列比對，采用臨位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機(jī)抽樣，計算Bootstrap值，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標(biāo)的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1811”與模式菌株B.malacitensisCECT5687(DQ903179)同源性達(dá)99.5％。因此可以判定B1811為一種全新的莫海威芽孢桿菌。經(jīng)過鑒定確認(rèn)其所屬菌種后，莫海威芽孢桿菌B1811于2016年7月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號為CGMCCNo.12805；此生物材料已經(jīng)存活試驗測試并通過該試驗。實施例2莫海威芽孢桿菌B1811液體搖瓶培養(yǎng)液制備（1）斜面培養(yǎng)：莫海威芽孢桿菌B1811接種于斜面培養(yǎng)基上，在40℃下培養(yǎng)48小時，得斜面菌株。所用斜面培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、瓊脂1.8g、蒸餾水余量，pH為中性，115℃滅菌20min。（2）取斜面菌株接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在175rpm、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、瓊脂粉15g、酵母提取物5g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌25min。（3）將5.0mg的NAP以無菌操作加入含有50mL的改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的搖瓶中，將莫海威芽孢桿菌B1811的種子培養(yǎng)液以1mL的接種量接種到搖瓶中，在175r/min、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)72h；所述改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：酵母提取物5.0g、硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌15min。實施例3NAP標(biāo)準(zhǔn)曲線制定與含量測定（1）以正己烷為溶劑配制400mg/L的萘母液，分別稀釋20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、80倍、100倍、200倍以備用，取2.5mL不同稀釋倍數(shù)的萘溶液置于3mL石英比色皿中，用紫外分光光度計分別測定275nm波長下的吸光值，并以吸光值為縱坐標(biāo)，萘的濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示；進(jìn)而獲得吸光值-濃度方程：y=0.0424x-0.0033，x為萘的濃度，y為吸光值。（2）取2.5mL實施例1獲得的發(fā)酵液置于3mL石英比色皿中，用紫外分光光度計分別測定275nm波長下的吸光值；然后根據(jù)吸光值-濃度方程計算出萘的濃度。（3）降解率的計算公式：降解率%=(C0-C)/C0*100%，C0為用莫海威芽孢桿菌B1811降解之前的NAP質(zhì)量濃度（mg/L）（即實施例1步驟（3）發(fā)酵培養(yǎng)之前搖瓶中混合液的NAP質(zhì)量濃度89.29mg/L）中，C為發(fā)酵液中的NAP殘留濃度（mg/L）。經(jīng)計算，實施例1的降解率為98.1%。實施例4莫海威芽孢桿菌B1811降解萘條件（接種量）的優(yōu)化將實施例2步驟（3）中的種子液接種量依次改為2、3、4、5、6mL，其他操作同實施例1。按照實施例3的步驟測定發(fā)酵液的NAP濃度，進(jìn)而計算NAP的降解率。在不同接種量條件下，NAP降解率如表1所示。實施例5莫海威芽孢桿菌B1811降解萘條件（改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的酵母提取物的含量）的優(yōu)化將實施例2步驟（3）中所用改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的酵母提取物的含量依次修改為3、4、5、6、7、8g/L；其他操作同實施例2。按照實施例3的步驟測定發(fā)酵液的NAP濃度，進(jìn)而計算NAP的降解率。在不同酵母提取物的含量條件下，NAP降解率如表2所示。表1種子液接種量（mL）NAP降解率（%）00198.1298.3398.9499.2599.5699.5；表2酵母提取物的含量（g/L）NAP降解率（%）00396.4496.7598.1699.6799.2899.2<110>北京工商大學(xué)<120>莫海維芽胞桿菌的應(yīng)用及其降解萘的方法<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>2AAGGAGGTGATCCAGCC17<210>3<211>1461<212>DNA<213>人工合成<400>3ATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG60AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA120CCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC180AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGC240GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC300GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT360GAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCG420AATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG480CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAG540GCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACT600GGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA660GATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGC720GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT780GCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC840TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT900GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG960ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC1020GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTA1080GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG1140GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAC1200AGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCG1260GATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT1320GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGT1380AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA1440TTGGGGTGAAGTCGTAACAAG1461<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>4ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5CCSgCAgARTCACCCTCTACg21<210>6<211>887<212>DNA<213>人工合成<400>6AACGCGTTATCAACAGAGCTTGATGTGACTGTTCACCGTGACGGAAAAATCCATCGCCAA60GTCTATAACCGCGGTGTCCCGGTTTCTGATCTTGAGGTTATTGGCGAAACGGATCATACA120GGAACGACTACACACTTTGTTCCAGATCCTGAAATCTTCACGGAAACAACTGAGTATGAA180TATGATTTGCTTGCTAACCGTGTTCGCGAACTAGCCTTTTTGACAAAAGGCGTAAACATC240ACGATTGAAGATAAACGTGAAGGCCAAGAGCGCAAAAATGAGTATCATTACGAAGGCGGA300ATTAAAAGCTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCCAAAGAAGTTGTCCATGAAGAGCCGATT360TATATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTCGCTCTGCAATACAATGACAGC420TACACAAGCAATATTTACTCATTTACAAACAATATCAACACGTACGAAGGCGGTACCCAC480GAAGCCGGTTTTAAAACGGGGCTGACTCGTGTCATCAATGATTACGCCAGAAAAAAAGGA540CTCATAAAAGAAAATGATCCAAACTTAAGCGGAGATGATGTGAGAGAAGGGCTTACCGCG600ATTATCTCGATCAAACACCCGGATCCGCAGTTCGAAGGCCAAACGAAAACAAAACTAGGC660AACTCAGAGGCGCGGACGATCACAGATACGTTATTTTCTGCTGCGTTGGAAACCTTTATG720CTGGAAAATCCAGATGCGGCCAAAAAAATCGTTGACAAAGGCTTAATGGCAGCAAGAGCA780AGAATGGCTGCGAAAAAAGCGCGTGAATTAACGCGCCGCAAAAGTGCTTTGGAGATTTCA840AACCTTCCTGGTAAATTAGCGGACTGCTCTTCGAAAGACCCGAGCAT887當(dāng)前第1頁1 2 3