本發(fā)明涉及一株吡咯伯克霍爾德氏菌及其應用，屬于環(huán)境微生物應用領域。
背景技術：
：鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutylphthalate），簡稱：DBP，屬于鄰苯二甲酸酯(PhhtalicAicdEasters,PAEs)的一種，是一類重要的環(huán)境激素類有機合成化合物，具有色澤淺、揮發(fā)性低、氣味小和耐低溫等特點，是近年來產量最大、用量最多的增塑劑，廣泛用于橡膠、塑料、香料等行業(yè)。DBP與載體連接不穩(wěn)定，極易擴散到環(huán)境中，可通過食物、空氣、飲用水、化妝品等多種途徑進入人體并富集。DBP對水生植物具有毒性效應，對動物雌激素具有顯著干擾作用，能降低細胞膜表面蛋白的表達從而抑制巨噬細胞的吞噬能力，甚至誘導神經細胞凋亡，是一種重要的環(huán)境內分泌干擾物及致癌、致畸、致突變物質，引起了各國環(huán)保部門的高度重視。美國環(huán)保局（EPA）、歐盟以及中國國家環(huán)境監(jiān)測中心均已將其列入優(yōu)先控制污染物黑名單。我國也相應地規(guī)定了生活飲用水中DBP的最大檢出濃度。環(huán)境中DBP的分解、轉化方法及技術探索已成為環(huán)境污染治理的重要研究方向。但是DBP在自然環(huán)境中的水解、光解速度非常緩慢，屬于難降解物質。有研究表明，BBP的水相中光解半衰期長于100天。與水解及光解等物理降解相比，基于微生物代謝的生物降解過程具有功能微生物多樣性、過程簡單、成本低、環(huán)境友好等特點，使得微生物降解被認為是自然環(huán)境中DBP完全礦化的最有效途徑。因此篩選高效分解以DBP為代表的PAEs類物質的微生物并闡明其分解代謝途徑，對于深化有關消除DBP環(huán)境危害的研究及應用具有現(xiàn)實意義。近年來，DBP的微生物降解已經得到廣泛的研究，大量能高效降解DBP的菌株已經從各類環(huán)境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性污泥等，微生物類別包括大量細菌以及部分真菌。研究表明，不同來源以及不同類型的微生物在DBP降解途徑方面具有較大差異性，所呈現(xiàn)的降解機制也不盡相同。所述降解機制包括發(fā)揮降解作用的關鍵酶及酶系、降解途徑中的關鍵節(jié)點及關鍵影響因素、微生物自身代謝與降解效果之間的關系、微生物降解廣譜性與特異性及其與DBP結構的關系等。吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia），其應用主要在促進植物生長和植物病害的生物防治；目前未見有關利用吡咯伯克霍爾德氏菌降解DBP的報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能夠降解鄰苯二甲酸二丁酯的新菌株；及該菌株的應用和采用該菌株降解鄰苯二甲酸二丁酯的方法。技術方案本發(fā)明從土壤中篩選并分離出了一株新的菌株；屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，不能形成芽孢；經鑒定，該菌株是一種吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）；命名為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號為CGMCCNo.12806；保藏時間為2016年7月21日。本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213能夠降解鄰苯二甲酸二丁酯；吡咯伯克霍爾德氏菌B1213對鄰苯二甲酸二丁酯的降解率可高達45.5-75.35%。采用本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解鄰苯二甲酸二丁酯的其中一種方法為：在酵母提取物存在的條件下，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213與鄰苯二甲酸二丁酯接觸。其中，酵母提取物的量會影響降解率。所以，上述方法，優(yōu)選的，在改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基存在的條件下，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213與鄰苯二甲酸二丁酯接觸；所述改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉4.0g，三水合磷酸鉀0.5g，七水合硫酸鎂0.4g，蒸餾水余量；pH7.0。具體的，是將鄰苯二甲酸二丁酯加入改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基；將吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液接種于改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基，在150-200rpm、30-35℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)。上述方法，優(yōu)選的，改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基中酵母提取物的含量為7g/L。上述方法，優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為轉速175rpm，溫度30℃。其他條件相同情況下，在此培養(yǎng)條件下，鄰苯二甲酸二丁酯的降解率更高。上述方法，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液相對于改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基的接種量的變化，對單位時間內的鄰苯二甲酸二丁酯降解率有明顯影響；通常情況下，接種量越多，單位時間內降解率越高；但是對最終降解率（發(fā)酵液中鄰苯二甲酸二丁酯含量達到穩(wěn)定時的降解率）沒有明顯影響。上述方法，所述吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液是由吡咯伯克霍爾德氏菌B1213培養(yǎng)獲得的。在獲得吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的條件下，本領域技術人員通過常規(guī)操作即可以獲得吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液。本發(fā)明中，對于某個成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比（w/w）。本發(fā)明所用專業(yè)術語說明：rpm是轉速單位，1rpm是指每分鐘旋轉一轉。有益效果：（1）首次分離培養(yǎng)出能夠降解鄰苯二甲酸二丁酯的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213；（2）吡咯伯克霍爾德氏菌B1213對鄰苯二甲酸二丁酯的降解率為45.5%-75.35%；（3）本發(fā)明降解鄰苯二甲酸二丁酯的方法，與本發(fā)明之前細菌、真菌降解鄰苯二甲酸二丁酯的方法相比，在菌種來源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作簡單。保藏信息：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學院微生物研究所；保藏日期：2016年7月21日；保藏編號：CGMCCNo.12806；分類命名：吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）。附圖說明圖1為本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213在顯微鏡下的形態(tài)特征；圖1中，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213為桿狀的革蘭氏陰性菌，不能形成芽孢；圖2為通過高效液相色譜法測得的實施例2的DBP降解效果；圖2中：a圖是DBP空白對照的高效液相圖譜，b圖是DBP經過降解后的高效液相圖譜；DBP基本在第7.825min出峰，降解后，DBP的峰面積減少；圖3為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析；圖4為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的recA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析。具體實施方式下述實施例中，如無特殊說明，均為本領域常用方法。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。實施例1菌株B1213的鑒定菌株B1213分離自土壤，其形態(tài)如圖1所示，屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，不能形成芽孢。提取其基因組DNA，并利用16srDNA和BCR1引物對于該基因組DNA進行聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美國國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,簡稱NCBI)數據庫進行菌株比對。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1492R：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，如SEQIDNO.2所示；擴增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全長為1411bp。將該擴增所得16SrDNA序列與GenBank數據庫中的相關菌株的基因序列進行比較，用MEGA4.1軟件進行序列比對，采用臨位連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，經1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數值，上標的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1213”與模式菌株BurkholderiastabilisLMG28156、同源性達99.7％。(2)recA基因序列分析BCR1基因正向引物：5'-TgACCgCCgAgAAgAgCAA-3'，如SEQIDNO.4所示；BCR2基因反向引物：5'-CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC-3'，如SEQIDNO.5所示；擴增所得recA基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全長為974bp。將該擴增所得recA基因序列與GenBank數據庫中的相關菌株的基因序列進行比較，用用MEGA4.1軟件進行序列比對，采用臨位連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，經1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數值，上標的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1213”與模式菌株BurkholderiapyrrociniaDSM10685T(CP011503)同源性達97.9％。因此可以判定B1213為一種全新的吡咯伯克霍爾德氏菌。經過鑒定確認其所屬菌種后，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213于2016年7月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號為CGMCCNo.12806；此生物材料已經存活試驗測試并通過該試驗。實施例2吡咯伯克霍爾德氏菌B1213液體搖瓶培養(yǎng)液制備（1）斜面培養(yǎng)：吡咯伯克霍爾德氏菌B1213接種于斜面培養(yǎng)基上，在40℃下培養(yǎng)48小時，得斜面菌株。所用斜面培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、瓊脂1.8g，蒸餾水余量，pH為中性，115℃滅菌20min。（2）取斜面菌株接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在175rpm、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液。所用種子培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、瓊脂粉15g、酵母提取物5g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌25min。（3）將10μL的DBP（工業(yè)純）以無菌操作加入含有50mL的改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基的搖瓶中，將吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的種子培養(yǎng)液以1mL的接種量接種到搖瓶中，在175r/min、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)72h；得發(fā)酵液。所用改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：酵母提取物5g、硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌15min。實施例3DBP標準曲線制定與含量測定（1）高效液相色譜法（HPLC）制作標準曲線：取600μLDBP以甲醇為溶劑，制備成1mg/mL的DBP溶液，稀釋十倍后分別取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL定容至2mL離心管中，即濃度梯度（μg/mL）為10、20、30、40、50、60、70分別用0.45μm有機濾膜過濾后置于液相小瓶中待測。本實施例3中的高效液相檢測條件為：色譜柱為SepaxGp-C18柱（150mm*4.6mm，5.0μm）；流動相為乙腈-水（83：17，V/V）；進樣量10μL；流速1.0mL/min；柱溫25C°；紫外檢測器波長210nm。以DBP的峰面積為橫坐標，以DBP的濃度為縱坐標，制作標準曲線；進而獲得峰面積-濃度方程。實施例4高效液相法檢測DBP的降解率（1）向實施例2獲得的發(fā)酵液中加入與發(fā)酵液等量的乙腈對DBP進行提取，超聲（40KHZ，300W）輔助提取30min后取其中2mL用乙腈定容至10mL，混合均勻后離心（12000rpm,10min），將離心后的上清液用有機濾膜（0.45μm）進行過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液置于液相小瓶中，以實施例3步驟（1）的檢測條件，采用高效液相色譜儀（HPLC）進行檢測。運行時間為20分鐘，讀取保留時間在7min左右的峰面積值，根據實施例3的峰面積-濃度方程，得續(xù)濾液中DBP的濃度，進而計算出發(fā)酵液中DBP的殘留濃度。（2）降解率的計算公式：降解率%=(C0-C)/C0*100%，C0為用吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解之前的DBP質量濃度（μg/mL）（即實施例2步驟（3）發(fā)酵之前搖瓶中混合液的DBP質量濃度：0.1713μg/mL），C為發(fā)酵液中的DBP殘留濃度（μg/mL）。經計算，實施例2的降解率為55.96%。實施例5吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解DBP的優(yōu)化將實施例2步驟（3）中的種子液接種量依次改為2、3、4、5、6mL，其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發(fā)酵液的DBP濃度，進而計算DBP的降解率。在不同接種量條件下，DBP降解率如表1所示。實施例6將實施例2步驟（3）中所用改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基的酵母提取物的含量依次修改為2、3、4、5、6、7、8、10g/L；其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發(fā)酵液的DBP濃度，進而計算DBP的降解率。在不同酵母提取物的含量條件下，DBP降解率如表2所示。表1種子液接種量（mL）DBP降解率（%）00155.96256.52358.95463.51569.64675.35；表2酵母提取物的含量（g/L）DBP降解率（%）00245.5345.8446.32555.96665.32775.35869.841067.78<110>北京工商大學<120>一株吡咯伯克霍爾德氏菌及其應用<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>2ACGGTTACCTTGTTACGACTT21<210>3<211>1411<212>DNA<213>人工合成<400>3ACATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAG60TAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCG120CATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGAT180GGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTG240AGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG300TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG360CCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGCTCTAATACAGTCGGGG420GATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG480TAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAG540ACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGT600ATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAAT660ACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGA720GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGG780GATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCG840CAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTA900ATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCCGCTGAGAGG960TGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC1020GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAG1080AGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCT1140CATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAA1200CCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTC1260GAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTC1320CCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAG1380TCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTA1411<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4TgACCgCCgAgAAgAgCAA19<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC21<210>6<211>974<212>DNA<213>人工合成<400>6TCATGCGCATGGGCGACGGCGAGGCGGCCGAAGACATCCAGGTCGTCTCCACGGGTTCGC60TGGGGCTCGACATCGCGCTTGGCGTCGGCGGCTGCCGCGCGGCCGGGTGGTCGAGATCTA120CGGCCCGGAATCGTCCGGTAAAACCACGCTCACGCTGCAGGTCATCGCCGAACTGCAGAA180GATCGGCGGCACGGCCGCGTTCATCGACGCCGAACACGCGCTCGACGTTCAATATGCGTC240GAAGCTCGGCGTGAACGTGCCGGAACTGCTGATCTCGCAGCCGGACACCGGCGAACAGGC300ACTGGAAATCACCGATGCGCTGGTGCGCTCGGGCTCGGTCGACATGATCGTCATCGACTC360GGTCGCGGCGCTCGTGCCGAAGGCCGAAATCGAAGGCGAGATGGGCGATTCGCTGCCGGG420CCTGCAGGCTCGCCTGATGTCGCAGGCGCTGCGCAAGCTGACCGGCACGATCAAGCGCAC480GAACTGCCTGGTGATCTTCATCAACCAGATTCGCATGAAGATCGGCGTGATGTTCGGCAA540CCCGGAAACCACGACGGGCGGCAACGCGCTGAAGTTCTATGCGTCGGTGCGTCTCGATAT600CCGCCGGATCGGCTCGATCAAGAAGAACGACGAGGTGATCGGCAACGAAACCCGCGTGAA660GGTCGTCAAGAACAAGGTGTCGCCGCCGTTCCGCGAAGCGATCTTCGACATCCTGTATGG720CGAGGGCATTTCGCGTCAGGGCGAGATCATCGATCTCGGCGTGCAGGCAAAGATCGTCGA780CAAGGCGGGCGCCTGGTACAGCTACAACGGCGAGAAGATCGGCCAGGGCAAGGACAACGC840GCGTGAATTCCTGCGCGAGAATCCGGAAATCGCACGCGAGATCGAAAACCGCATCCGCGA900ATCGCTCGGCGTCGTCGCCAAGGCGCTGGCGGCCGCACTCGCGCAGATCGAGAAGCAGTT960CGGCAAAGGGTCGA974當前第1頁1 2 3