本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一株堅強芽孢桿菌及其用途。

背景技術(shù)：

無花果，為?？茻o花果屬落葉灌木或喬木，引進(jìn)栽培近千年。果實可溶性固形物含量達(dá)24％，甘甜味美，含有18種氨基酸，其中8種是人體必需氨基酸。無花果具有極高的藥用價值，能凈化腸道，促進(jìn)有益菌類增殖，它的抗癌功效也得到世界各國公認(rèn)，被譽為“21世紀(jì)人類健康的守護(hù)神”。

石榴，為石榴科石榴屬落葉果樹，灌木或小喬木，引進(jìn)栽培近兩千年。石榴具有豐富的營養(yǎng)價值和保健功能，含抗氧化劑最高，其抗氧化能力是檸檬的11倍。石榴汁富含可溶性多酚化合物，具有抗動脈粥硬化的性質(zhì)。同時石榴還是重要的觀賞樹種。

無花果、石榴已成為新興的經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)。但由于氣候的變化和栽培方式的改變、栽培面積的迅速擴大，無花果、石榴等小漿果病蟲害已呈現(xiàn)多發(fā)、頻發(fā)、重發(fā)的態(tài)勢，尤其是炭疽病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。目前，防治措施以依賴化學(xué)農(nóng)藥為主，導(dǎo)致病原菌抗藥性逐年增加，防治效果下降，農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題，嚴(yán)重影響果品質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境安全。

生物防治是植物病蟲害防治的必然趨勢，因此利用拮抗微生物防治無花果、石榴炭疽病有望成為代替化學(xué)藥劑的一種安全、無毒及有效的新方法。拮抗微生物不僅可以防病，而且還能促進(jìn)植物生長，對改善林地生態(tài)系統(tǒng)，保持林間生物多樣性，以及維護(hù)林田生態(tài)平衡實現(xiàn)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展將起到重要作用。為了順利完成制定的《到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動方案》，農(nóng)業(yè)部正大力推廣利用生物藥劑。與其他生物農(nóng)藥相比，微生物源生物農(nóng)藥生防因子繁殖速度快、防治效果持久、開發(fā)利用途徑多、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)酵工藝簡單及生產(chǎn)成本低，成為生物農(nóng)藥領(lǐng)域的研究熱點，依然是未來較長一段時間生物農(nóng)藥登記的主要選擇。尤其是利用拮抗微生物防治無花果、石榴炭疽病還未見報道。

本發(fā)明申請人于2009年公開了一株堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)Bf-02CGMCC No.3129(專利號：ZL200910256465.2)，該菌株的殺菌譜廣，主要用來防治核桃炭疽病、黃瓜灰霉病、小麥紋枯病、蘋果輪紋病、煙草赤星病、玉米小斑病、冬棗黑斑病、棉花枯萎病、棉花紅腐病、小麥赤霉病等多種植物病害，其中防治黃瓜灰霉病、核桃炭疽病效果顯著。但是室內(nèi)對峙試驗表明：它對無花果、石榴炭疽病的抑菌率分別為60.30％和61.12％，防治效果較差。因此尋找一種高效防治無花果、石榴炭疽病的拮抗微生物是當(dāng)前需要解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株能高效防治無花果、石榴炭疽病的堅強芽孢桿菌菌株Bf-01，該菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大，在無花果、石榴根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)菌株Bf-01，是從山東省林業(yè)科學(xué)研究院試驗苗圃無花果根際土壤中，采用稀釋分離法分離獲得的，已于2009年4月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No.3039。其具有以下微生物學(xué)特性：Bf-01菌體桿狀，革蘭氏陽性菌，周生鞭毛，好氧生長。NA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落圓形，白色，平展，表面粗糙，中間有圓環(huán)形突起，邊緣整齊，不產(chǎn)色素。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。

本發(fā)明的堅強芽孢桿菌菌株Bf-01的培養(yǎng)方法或繁殖方法：普通培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基保存。實驗室液體培養(yǎng)采用略加修改的NB液體培養(yǎng)基。NB配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，水1000mL，pH 7.3。大量發(fā)酵培養(yǎng)配方(重量比)：黃豆粉2.5％，玉米粉3％，輕質(zhì)碳酸鈣0.2％，氯化鈉0.1％，其余為水，pH 7.3。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28℃，初始pH7.3，裝液量75％，接菌量3.0％，培養(yǎng)時間36h，通風(fēng)1：0.8。采用此培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，菌數(shù)≥100億/g。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有該菌株的微生物菌劑，其制備方法包括以下步驟：

(1)將保存的堅強芽孢桿菌菌株Bf-01轉(zhuǎn)移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)48-72h；

(2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的堅強芽孢桿菌菌株Bf-01用無菌水按體積比1：10稀釋后，吸取1mL，置于裝有NB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)18-20h得到種子液；

(3)按體積比3.0％將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間24h，通風(fēng)1：0.8。發(fā)酵完成后，菌數(shù)≥100億/g。

上述微生物菌劑優(yōu)選為水分散粒劑，所述水分散粒劑通過包括以下步驟的方法制得：

(4)將堅強芽孢桿菌發(fā)酵液加入基質(zhì)進(jìn)行混勻，然后進(jìn)行干燥，得到原粉；所述基質(zhì)選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種；所述基質(zhì)與發(fā)酵液的質(zhì)量比為0.5～1.5：1，優(yōu)選1：1；

(5)按重量份，干燥好的堅強芽孢桿菌原粉1-30、輕質(zhì)碳酸鈣1-60、葡萄糖0.5-60、羧甲基纖維素0.02-10、濕潤劑1004 0.5-30、動物蛋白0.2-30，將上述原料混合均勻，使混合料的堅強芽孢桿菌Bf-01含量為0.1-100億活菌/g；

(6)控制加工溫度0-50℃，在氣流粉碎機或其它高目粉碎機中粉碎到150篩目以上，然后進(jìn)行沸騰造?；驍D壓造粒，水分控制在6-8％，pH控制在7-7.5。

該微生物菌劑可以用作生物農(nóng)藥，用于防治無花果、石榴炭疽病。因此，又一方面，本發(fā)明提供了堅強芽孢桿菌菌株Bf-01或者本發(fā)明的微生物菌劑用于防治無花果、石榴炭疽病中的用途，以及在提高無花果和石榴鮮果重方面的用途。

本發(fā)明還提供一種用于防治無花果、石榴炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的無花果、石榴施用堅強芽孢桿菌菌株Bf-01或者上述微生物菌劑。

實驗表明，本發(fā)明的堅強芽孢桿菌株Bf-01具有菌株新穎、高效、生長速度快、產(chǎn)孢量大，在無花果、石榴葉片、果實表面能夠快速大量定殖的特點，其10億/g水分散粒劑300倍防治無花果、石榴炭疽病效果顯著，防治效果達(dá)到78.83％、80.10％，且無花果、石榴生長健壯，無藥害產(chǎn)生，鮮果增重達(dá)10％以上。同時具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，因而在生物防治無花果、石榴炭疽病中具有重要應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的Bf-01菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實施例1菌株的分離與鑒定

1.分離：

本發(fā)明的堅強芽孢桿菌是從山東省林業(yè)科學(xué)研究院試驗苗圃無花果根際土壤中采用土壤稀釋分離法分離獲得的，分離方法為：

(1)土樣采集：從土壤表層到15cm處取樣200g，一個地點采幾個樣本，實驗室陰干，混合過粗篩，取25g作分離用；

(2)培養(yǎng)基平板制備：將NA培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)和PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)基融化，分別倒入滅菌培養(yǎng)皿，冷卻，制成NA和PDA平板；

(3)稱取1g土樣于滅菌試管中，加100mL無菌水，振蕩，制成10^-2土壤懸浮液，靜置5min，按10倍梯度稀釋到10^-7；

(4)取上述土壤懸浮液0.5mL，加到培養(yǎng)基平板上，用彎玻棒涂勻。置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)5-7d。

(5)將單個菌落在NA培養(yǎng)基上劃線，得到單菌落，轉(zhuǎn)移至NA試管斜面培養(yǎng)基中，至28℃恒溫培養(yǎng)。

(6)以無花果炭疽病菌為靶標(biāo)菌，采用對峙培養(yǎng)法，篩選到一株對無花果炭疽病菌具有較強抑制活性的菌株，編號Bf-01。

所述NA培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g、牛肉膏3g、瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.3；所述PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯(去皮切塊)200g，葡萄糖20g，瓊脂14g，蒸餾水1000mL。

2.菌株鑒定

(1)微生物學(xué)特性：Bf-01菌體桿狀，革蘭氏陽性菌，周生鞭毛，好氧生長。NA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落圓形，白色，平展，表面粗糙，中間有圓環(huán)形突起，邊緣整齊，不產(chǎn)色素。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。其它特性見下表1：

表1 Bf-01菌株的生理生化特性

注：“+”表示生長或反應(yīng)陽性；“-”表示不生長或反應(yīng)陰性。

(2)分子生物學(xué)特性：

16S rRNA基因序列測定結(jié)果如下(SEQ-1)：

將Bf-01菌株的16S rRNA擴增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，與B.firmus(DQ355388)同源性為99.51％，結(jié)合Bf-01菌株的形態(tài)特征、生理生化特性，確定Bf-01屬于堅強芽孢桿菌B.firmus。

此菌株已于2009年4月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No.3039。

實施例2堅強芽孢桿菌菌株Bf-01對無花果、石榴炭疽病室內(nèi)效果驗證

1.實驗方法

采用平板對峙培養(yǎng)法，將供試的無花果、石榴炭疽病菌菌餅(9mm)移至平板中央，四周2cm處接種Bf-01菌株，置27℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。待對照菌絲長滿平板時，采用十字交叉法測量菌落直徑、抑菌帶直徑，計算平均值和相對抑制率。

2.結(jié)果

由表2可以看出，Bf-01菌株對無花果、石榴炭疽病菌菌絲生長均具有較強的抑制作用，處理后菌落直徑分別為10.3mm、11.6mm，對照菌落直徑分別為70.6mm、72.9mm，菌絲生長抑制率分別為85.41％、84.09％。

表2.Bf-01對無花果、石榴炭疽病菌室內(nèi)抑菌活性測定

實施例3堅強芽孢桿菌菌株Bf-01水分散粒劑的制備

NB液體培養(yǎng)基配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，水1000mL，pH 7.3。

大量發(fā)酵培養(yǎng)配方(重量比)：黃豆粉2.5％，玉米粉3％，輕質(zhì)碳酸鈣0.2％，氯化鈉0.1％，其余為水，pH 7.3。

(1)將保存的堅強芽孢桿菌Bf-01轉(zhuǎn)移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)48-72h；

(2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的堅強芽孢桿菌Bf-01按體積比1：10用無菌水稀釋，吸取1mL，至于裝有NB液體培養(yǎng)基(100mL)的250mL三角瓶中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)18-20h得到種子液；

(3)按體積比3.0％將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間24h，通風(fēng)1：0.8。發(fā)酵完成后，菌數(shù)≥100億/g。

(4)將堅強芽孢桿菌發(fā)酵液加入等質(zhì)量的草炭進(jìn)行混合均勻，干燥；

(5)按重量份，干燥好的堅強芽孢桿菌原粉20、輕質(zhì)碳酸鈣13、葡萄糖50、羧甲基纖維素1、濕潤劑1004 6、動物蛋白10；將上述原料混合均勻，控制加工溫度20-30℃，在氣流粉碎機中，粉碎到200目，進(jìn)行擠壓造粒，水分控制在6-8％(質(zhì)量百分含量)，pH控制在7-7.5。所得到的水分散粒劑的堅強芽孢桿菌菌株Bf-01含量為10億活菌/g。

實施例4防效驗證

本實施例提供了堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑針對無花果、石榴炭疽病的相關(guān)實驗。

1.1供試藥劑

本發(fā)明實施例3制備的堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑；75％代森錳鋅水分散粒劑(市售)。

1.2供試作物與防治對象：

供試作物為無花果，品種為綠早；防治對象：炭疽?。?/p>

供試作物為石榴，品種為大青皮甜；防治對象：炭疽病。

1.3試驗地情況

于2013年分別在山東省嘉祥縣無花果種植園、棗莊市嶧城區(qū)石榴種植園中，進(jìn)行林間防治無花果、石榴炭疽病試驗。樹勢中等偏弱，病害發(fā)生嚴(yán)重。所有試驗小區(qū)栽培條件及管理措施一致，開花后3周用藥1次，6月10日起，每隔15d施藥1次，連用3次，共計4次。

1.4試驗設(shè)計及安排

本試驗設(shè)計了10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑300倍、500倍、700倍，75％代森錳鋅水分散粒劑400倍液及不施藥清水作對照共5個處理，重復(fù)4次，共20個小區(qū)，各小區(qū)隨機排列，每個小區(qū)10棵無花果樹、石榴樹。

1.5試驗調(diào)查及計算方法

1.5.1藥效調(diào)查、調(diào)查時間和次數(shù)

采收前10d調(diào)查，無花果每個處理隨機調(diào)查300個果實，石榴每個處理隨機調(diào)查50個果實，計算病情指數(shù)、防治效果，整個試驗調(diào)查1次。

1.5.2安全性調(diào)查

安全性調(diào)查：于第一次施藥后7d和14d觀察無花果、石榴的安全性，如有藥害發(fā)生，詳細(xì)描述藥害癥狀并按藥害程度分級標(biāo)準(zhǔn)確定藥害程度。

分級方法(以果實為單位)：

1.5.3病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)

0級：無病班；

1級：病班面積占整個果實面積的5％以下；

3級：病班面積占整個果實面積的6％-10％；

5級：病班面積占整個果實面積的11％-25％；

7級：病班面積占整個果實面積的26％-50％；

9級：病班面積占整個果實面積的51％以上。

1.5.4藥效計算方法

藥效按式(1)、(2)計算：

式中：CK₀——空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)；

CK₁——空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)；

PT₀————藥劑處理后施藥前病情指數(shù)；

PT₁————藥劑處理后施藥后病情指數(shù)；

1.6對作物的直接影響

觀察藥劑對作物有無藥害，記錄藥害的類型和程度。此外，也要記錄對作物的其他有益影響(例如促進(jìn)成熟、刺激生長等)。

用下列方式記錄藥害：

(a)如果藥害能被測量或計算，要用絕對值表示，例如株高、結(jié)實率。

(b)在其他情況下，可以按下列兩種方法估計藥害程度和頻率：

(1)按照藥害分級方法記錄每小區(qū)的藥害程度，以—、+、++、+++、++++表示。

藥害分級方法：

—：無藥害；

+：輕度藥害，不影響作物生長；

++：中度藥害，可復(fù)原，不會造成作物減產(chǎn)；

+++：中度藥害，影響作物正常生長，對作產(chǎn)量和質(zhì)量造成一定程度的損失；

++++：嚴(yán)重藥害，作物生長受阻，產(chǎn)量和質(zhì)量損失嚴(yán)重。

(2)將藥劑處理區(qū)與空白對照區(qū)比較，評價其藥害百分率。

同時，要準(zhǔn)確描述作物的藥害癥狀(矮化、褪綠、畸形等)

2.結(jié)果

2.1供試藥劑對無花果、石榴炭疽病的防治效果

表3結(jié)果顯示，10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑對無花果炭疽病具有較好的防治效果，其中10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑300倍、500倍防治效果最好，防治效果分別達(dá)78.83％、77.97％，在P<0.05水平上無顯著性差異，明顯高于700倍和75％代森錳鋅的防治效果。

表3堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑防治無花果炭疽病田間藥效試驗

注：表中數(shù)據(jù)后不同的小寫字母表示經(jīng)Duncan多重比較后差異顯著(P<0.05)。

表4堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑防治石榴炭疽病田間藥效試驗

注：表中數(shù)據(jù)后不同的小寫字母表示經(jīng)Duncan多重比較后差異顯著(P<0.05)。

表4結(jié)果顯示，10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑對石榴炭疽病具有較好的防治效果，其中10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑300倍、500倍處理后，防治效果最好，病情指數(shù)6.01％和6.16％，防治效果分別達(dá)80.10％、79.60％，在P<0.05水平上無顯著性差異，明顯高于700倍和75％代森錳鋅的防治效果。

2.2安全性調(diào)查：經(jīng)施藥7d和14d觀察，各藥劑處理區(qū)與對照區(qū)相比，無花果、石榴生長正常，無藥害產(chǎn)生，說明10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑在供試濃度對無花果、石榴安全。

2.3堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑對無花果、石榴增產(chǎn)效果

表5堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑對無花果鮮果重試驗結(jié)果

表5結(jié)果顯示，10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑不同濃度處理后，無花果鮮果重分別為99.8g、97.9g、94.1g，清水對照鮮果重為88.6g，不同處理均有增產(chǎn)效果，其中300倍處理后，增產(chǎn)率達(dá)12.64％，效果明顯。

表6堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑對石榴鮮果重試驗結(jié)果

表6結(jié)果顯示，10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01水分散粒劑不同濃度處理后，與清水對照相比，石榴鮮果重分別增加78.2g、57g、38.3g，其中300倍處理后，增產(chǎn)率達(dá)15.54％，效果明顯。

3.小結(jié)

從無花果病果率和防治效果來看，10億/g堅強芽孢桿菌Bf-01對無花果、石榴炭疽病具有較好的防治效果，稀釋300倍后防治效果可達(dá)78.83％、80.10％，明顯好于對照藥劑，差異顯著。

從對無花果、石榴安全性調(diào)查來看，堅強芽孢桿菌Bf-01對無花果、石榴具有明顯的防病促生效果，鮮果增重率達(dá)10％以上，安全可靠。