專利名稱：一種毒殺植物寄生線蟲(chóng)的芽孢桿菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毒殺植物寄生線蟲(chóng)的芽孢桿菌及其制備方法和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲(chóng)是主要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一。由于植物寄生線蟲(chóng)具有地域分布廣、宿主種類多樣，并且容易使發(fā)生病蟲(chóng)害的植物繼發(fā)真菌或細(xì)菌感染，進(jìn)一步加重對(duì)植物危害，因此據(jù)不完全估計(jì)植物寄生線蟲(chóng)每年造成全球超過(guò)1000億美元的損失。我國(guó)線蟲(chóng)主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等主要經(jīng)濟(jì)作物，成為發(fā)展這些作物的重要限制因子。據(jù)全國(guó)煙草病蟲(chóng)害防治信息中心不完全統(tǒng)計(jì)，2001年全國(guó)煙草根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病面積已達(dá)55萬(wàn)公頃，直接經(jīng)濟(jì)損失5億多元。僅云南省發(fā)病面積就達(dá)2.7萬(wàn)公傾，直接經(jīng)濟(jì)損失1.2億元，間接損失更為嚴(yán)重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲(chóng)每年造成的損失達(dá)8億元之多。松材線蟲(chóng)被稱為無(wú)煙森林火災(zāi)，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺(tái)灣、香港等部份地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，并有向全國(guó)漫延的趨勢(shì)。雖然可以通過(guò)傳統(tǒng)輪作、土壤改良等途徑可以控制某些植物的線蟲(chóng)病，但是其應(yīng)用容易受到地域和線蟲(chóng)本身具有長(zhǎng)期潛伏性等因素的影響；目前我們所主要依賴化學(xué)防治方法，由于大多數(shù)化學(xué)殺蟲(chóng)劑為高毒、高殘留或破壞臭氧層的農(nóng)藥，隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，其弊端日趨顯著，逐步的限制了化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用。因此，病原線蟲(chóng)生物防治日益受到重視。目前世界上研究開(kāi)發(fā)的線蟲(chóng)生防制劑中主要是真菌殺線蟲(chóng)劑，由于土壤存在的抑真菌作用等因素的影響，限制了線蟲(chóng)生防的發(fā)展。同時(shí)，在微生物家族中，細(xì)菌是工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)最成熟的種類，研究開(kāi)發(fā)細(xì)菌殺線蟲(chóng)劑受到各國(guó)科學(xué)家重點(diǎn)關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，通過(guò)對(duì)一株具有毒殺植物寄生線蟲(chóng)功能的芽孢桿菌研究，開(kāi)發(fā)細(xì)菌源生物殺線蟲(chóng)劑。
本發(fā)明采用的細(xì)菌是食線蟲(chóng)芽孢桿菌(Bacillus nematocidus)B16菌株，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國(guó).北京.中關(guān)村；保藏日期2004年4月5日；保藏登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No.1128。
食線蟲(chóng)芽孢桿菌(Bacillus nematocidus)系本發(fā)明人在開(kāi)展胞外蛋白酶對(duì)線蟲(chóng)侵染機(jī)制的研究中，從大量土壤細(xì)菌中篩選到芽孢桿菌屬1個(gè)新種。研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)線蟲(chóng)具極高的毒殺活性，通過(guò)多批次殺線蟲(chóng)活性試驗(yàn)確定其活性后，委托武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，確定為食線蟲(chóng)芽孢桿菌新種，Bacillus nematocidus。
菌株主要形態(tài)特征為長(zhǎng)桿狀，個(gè)體較大，兩端鈍圓，多以散在形式存在。在LB平板培上菌落呈圓形，表面粗糙無(wú)光澤，類似細(xì)小粉末狀，菌苔白色。在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)72小時(shí)以上可見(jiàn)極少數(shù)的內(nèi)生孢子形成或釋放到胞外的芽孢，5天后菌體幾乎全生成芽孢。芽孢為長(zhǎng)柱形，亞端生。
本發(fā)明采用的是從食線蟲(chóng)芽孢桿菌Bacillus nematocidus新種中分離出的1株綜合性狀較好的菌株B16，鑒于該菌株可能由于(自發(fā)的、物理的或化學(xué)的)突變、原生質(zhì)體融合，轉(zhuǎn)化或其他通過(guò)生物技術(shù)而發(fā)生變化或被改造，本菌種任何菌株的突變株、變種和衍生物均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
對(duì)B16菌株毒殺線蟲(chóng)作用機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，其殺線蟲(chóng)功能主要源于蛋白、酶成份。主要作用機(jī)理是菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶分解線蟲(chóng)體壁，破壞線蟲(chóng)體壁的完整，使線蟲(chóng)內(nèi)容物外瀉，最終將線蟲(chóng)殺死。在整個(gè)殺線蟲(chóng)過(guò)程中，伴隨著產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶對(duì)線蟲(chóng)的作用，其毒力顯著。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)大培養(yǎng)B16菌株，提取殺線蟲(chóng)有效成分，進(jìn)行殺線蟲(chóng)藥效試驗(yàn)，確定其對(duì)線蟲(chóng)的作用。
B16培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為1-3％酵母提取物，0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1-3％NaCl；1.8-2％瓊脂；pH6-7。將B16菌體接種到培養(yǎng)基上，28-32℃下培養(yǎng)1-3天，獲得試管種；2、液體擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為1-3％酵母提取物；0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1-3％NaCl；pH6-7，余下為水。將試管種接種到500ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝200ml，于25-37℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間2-5天，轉(zhuǎn)速為200-300rpm。
3、提取殺線蟲(chóng)活性成份將發(fā)酵培養(yǎng)物于5000rpm/min離心10分鐘，取上清液，按0％-100％飽和度加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14000Da)于10-20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲(chóng)藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
B16殺線蟲(chóng)活性試驗(yàn)1、制備試驗(yàn)用藥劑按前述液體擴(kuò)大培養(yǎng)方法培養(yǎng)B16菌株，按前述提取殺線蟲(chóng)活性成份的方法制備試驗(yàn)用藥劑。
2、制備對(duì)照用藥劑對(duì)照1前述1制備試驗(yàn)用藥劑方法制備對(duì)照用藥劑，但培養(yǎng)基中不接入B16菌株。
對(duì)照2以50mM磷酸緩沖液作為對(duì)照。
對(duì)照3以透析后的透析溶液作為對(duì)照對(duì)照4為了證明殺線蟲(chóng)有效成份是蛋白，將制備供試藥劑煮沸滅活后作為對(duì)照。
3、制備試驗(yàn)用線蟲(chóng)(1)制備Panagrellus redivivus線蟲(chóng)將P.redivivus線蟲(chóng)接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲(chóng)用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無(wú)菌水洗滌，瞬時(shí)離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲(chóng)。用無(wú)菌水將線蟲(chóng)稀釋為含量為15條/μl的線蟲(chóng)懸浮液。
(2)制備松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲(chóng)，28℃培養(yǎng)15至20天。用無(wú)菌水將線蟲(chóng)洗下，制成含量為15條/μl的線蟲(chóng)懸浮液。
3、試驗(yàn)方法(1)藥效試驗(yàn)方法取試驗(yàn)用藥劑200μl于1.5ml離心管中，加入活線蟲(chóng)150條，離心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus線蟲(chóng)分別于12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)；松材線蟲(chóng)分別于24小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)檢查計(jì)算線蟲(chóng)的死亡率。并在光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察線蟲(chóng)體壁變化情況鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲(chóng)僵直，活蟲(chóng)則卷曲或扭動(dòng)。
分別用3種對(duì)照藥劑，每處理重復(fù)三次。

4、試驗(yàn)結(jié)果表1 B16對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)毒殺效果

表2 B16對(duì)松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus毒殺效果

結(jié)果表明，從B16菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的試驗(yàn)用藥劑對(duì)Panagrellusredivivus、Bursaphelenchus xylophilus線蟲(chóng)均具較好的殺蟲(chóng)效果，48小時(shí)線蟲(chóng)的平均死亡率在90％以上。將處理后線蟲(chóng)在光鏡下觀察，與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組線蟲(chóng)體壁由完整—部分溶解—完全溶解變化明顯。由于線蟲(chóng)體壁的破壞，線蟲(chóng)內(nèi)容物大量外瀉，致使線蟲(chóng)最終死亡。但由于供試線蟲(chóng)不同，其作用時(shí)間也不相同。Panagrellus redivivus線蟲(chóng)36小時(shí)死亡率已達(dá)98％，而松材線蟲(chóng)60小時(shí)死亡達(dá)95％。
結(jié)果同時(shí)表明，在B16菌株中，殺線蟲(chóng)的主要活性成份是酶類。而將同批提取的試驗(yàn)用藥劑(對(duì)照4)經(jīng)過(guò)煮沸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性后，其殺線蟲(chóng)活性非常小，且線蟲(chóng)體壁不出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，這也進(jìn)一步確證了B16對(duì)線蟲(chóng)的活性成份主要為酶類。
本發(fā)明B16菌株是一類全新發(fā)現(xiàn)的具有顯著的殺線蟲(chóng)活性的食線蟲(chóng)芽孢桿菌，其主要作用成份是酶。同時(shí)B16菌株在本發(fā)明培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)快，容易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，具備了很好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例一將食線蟲(chóng)芽孢桿菌(Bacillus nematocidus)B16菌體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為2％酵母提取物，1.5％蛋白胨；2％葡萄糖；1-3％NaCl；1.8％瓊脂；pH7。將B16菌體接種到培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中(每瓶裝100ml)，液體培養(yǎng)基配方為2％酵母提取物；1.5％蛋白胨；2％NaCl；3％葡萄糖；pH7，余下為水。于30℃搖床培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間3天，轉(zhuǎn)速為220rpm。
將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按100％飽和度的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14000Da)于10-20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲(chóng)藥液。
實(shí)施例二基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為3％酵母提取物；0.5％蛋白胨；1％NaCl；1％葡萄糖。
實(shí)施例三基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為1％酵母提取物；2％蛋白胨；3％NaCl；4％葡萄糖。
權(quán)利要求
1.一種具有毒殺植物寄生線蟲(chóng)的芽孢桿菌，其特征在于該細(xì)菌為食線蟲(chóng)芽孢桿菌Bacillus nematocidus B16，B16菌株已于2004年4月5日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.1128。
2.一種具有毒殺植物寄生線蟲(chóng)的芽孢桿菌的制備方法，由常規(guī)方法培養(yǎng)，其特征在于液體培養(yǎng)基配方為1-3％酵母提取物；0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1-3％NaCl；pH6-7。
3.權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的食線蟲(chóng)芽孢桿菌，其特征在于該細(xì)菌對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)具有毒殺作用，可以應(yīng)用于植物寄生線蟲(chóng)生物防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毒殺植物寄生線蟲(chóng)的芽孢桿菌及其制備方法和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為食線蟲(chóng)芽孢桿菌Bacillus nematocidus B16，采用常規(guī)方法制備，其液體培養(yǎng)基配方為1－3％酵母提取物；0.5－2％蛋白胨；1－4％葡萄糖；1－3％NaCl；pH6－7。本發(fā)明菌株具有的殺線蟲(chóng)主要活性成分是酶類，將菌株液體發(fā)酵后，按常規(guī)酶類提取方法從代謝產(chǎn)物中提取殺線蟲(chóng)有效成分。本發(fā)明食線蟲(chóng)芽孢桿菌對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)松材線蟲(chóng)具有顯著的毒殺活性，同時(shí)在本發(fā)明培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)快，容易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，具備了很好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1690189SQ20041002237
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者黃曉瑋, 牛秋紅, 張克勤 申請(qǐng)人:云南大學(xué)