專利名稱：食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應用，屬于生物技 術(shù)領域。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲具有地域分布廣泛、宿主種類多樣等特征，并容易使已發(fā)生線蟲病害 的植物繼發(fā)真菌或細菌感染，從而給農(nóng)作物、林木和食用菌帶來很大的危害。而我們現(xiàn) 今所依賴的化學防治，由于對環(huán)境的破壞以及對人畜安全性的影響，其使用正逐步受到 限制，因此生物防治病原線蟲成了植物線蟲病害綜合治理研究的前言和熱點。在線蟲侵 染過程中，無論是對于蟲體本身還是線蟲蟲卵來說，其覆蓋于表面的體壁或卵殼都是線 蟲防止侵染的重要保護結(jié)構(gòu)，而蛋白酶能有效地降解線蟲體壁，協(xié)助殺線蟲生物完成侵 染過程，是線蟲侵染的重要毒力因子之一，但目前從殺線蟲細菌中獲得的可降解線蟲體 壁的蛋白酶基因非常有限。因此在食線蟲細菌的研究中，新的可降解線蟲體壁的中性蛋 白酶基因發(fā)現(xiàn)，克隆及其功能研究，不僅能進一步完善食線蟲細菌侵染線蟲的分子機理， 并可促進線蟲生防研究向基因工程方向發(fā)展，為線蟲生防菌的遺傳改良及將侵染性蛋白 酶基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物構(gòu)建培育出抗性品種奠定重要基礎。
經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報道

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應用。 本發(fā)明人在開展殺線蟲細菌研究中，獲得一株對線蟲具有強侵染作用的食線蟲細菌 新種feci""s /7e歷atowV"s B16， feci"〃s / e鵬tocj'c/"s B16，保藏在中國微生物菌種
保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2004年4月5
日；保藏號CGMCC No. 1128。
本發(fā)明通過分離純化、性質(zhì)鑒定、兼并引物設計等技術(shù)，在該芽孢桿菌屬的細菌中 克隆出了一種新的可降解線蟲體壁、且具殺線蟲活性的中性蛋白酶基因，提交GenBank， 序列號為AY708654。編碼胞外侵染性中性蛋白酶的開放性閱讀框架長1566bp，共編碼 521個氨基酸殘基。其中含有27個氨基酸殘基的信號肽，194個氨基酸殘基的前肽，成 熟肽具有300個氨基酸殘基。
本發(fā)明利用^ET30載體系統(tǒng)在大腸桿菌宿主細胞BL21中得到成功異源表達，重組 蛋白大部分是以包涵體形式存在。經(jīng)鎳離子親和層析柱純化、SDS-PAGE電泳分析顯示， 重組蛋白分子量為42kD，經(jīng)過復性后其活性達到原來的76. 05°/。，該重組蛋白酶對線蟲 /^/7agre"〃s. re力Vi〃s的半致死率為1. 70 ii g mr'24h—'，對線蟲^xnsa/ 力e〗e/7c/ 〃s 《Wop力j7^的半致死率為2.28y g m廠'24h—'。同時利用該蛋白酶處理純化的線蟲體壁， 在解剖顯微鏡下觀察到大量的不完整的線蟲體壁碎片，證實胞外侵染性中性蛋白酶對線 蟲體壁的降解作用以及殺線蟲活性。
本發(fā)明通過分析驗證實驗，證實來源于殺線蟲芽胞桿菌的胞外侵染性中性蛋白酶基 因及其編碼產(chǎn)物能有效降解線蟲體壁、并具有殺線蟲活性。故該基因用來研究蛋白酶在 侵染線蟲過程中的生化本質(zhì)，并作為獲得高效生防菌株的靶基因。
附表胞外中性蛋白酶純化過程中各酶液及異源表達重組蛋白的酶活和對線蟲的毒殺作用
對線蟲對線蟲
蛋白酶液樣品蛋白酶活性(U ml—')/Wj'""s的半致死
率(P g mr'24h,死率(Ugmr24h—1)
卿(SD)
培養(yǎng)上清液88.53.09(1.6)7.87(1.9)
粗酶液106. 92. 13(1.8)2. 56(2. 1)
離子柱收集137.01. 72(2. 7)2. 35(1. 3)
中性蛋白酶250. 51. 69(2. 1)2. 26(2. 3)
表達重組中性蛋白 酶1.70(1.4)2.28(1.2)
190. 5BSA250.0一_
本發(fā)明具有安全性高、環(huán)境無污染、殺蟲效佳等優(yōu)點。


圖1為本發(fā)明基因所編碼的胞外侵染性中性蛋白酶的純化與SDS-PAGE分析。 A為粗酶液經(jīng)過陽離子層析的結(jié)果。其中只有洗脫峰具有蛋白酶活和殺線蟲活性； B為疏水層析結(jié)果。其中洗脫峰1具有蛋白酶活和殺線蟲活性； C為洗脫峰1組分進行SDS-PAGE分析，顯示得到電泳純的目的蛋白，即胞外侵染 性中性蛋白酶。
圖2為本發(fā)明編碼的胞外侵染性中性蛋白酶在大腸桿菌BL21中異源表達后進行 SDS-PAGE電泳。M泳道代表蛋白分子量標準；泳道1代表具有重組表達質(zhì)粒的大腸 桿菌菌株用IPTG誘導4小時；泳道2代表異源表達的目的蛋白經(jīng)過Ni-NTA親合 柱純化；泳道3、 4代表純化后的重組蛋白酶經(jīng)過復性。
圖3 : a為本發(fā)明基因編碼的胞外侵染性中性蛋白酶2.50ng ml—'處理線蟲
尸.re力'w'"52天的作用。 b為本發(fā)明基因編碼的胞外侵染性中性蛋白酶2.50u g m1—1處理線蟲
尸.re力'w'iAs2. 5天的作用。 c為本發(fā)明基因在大腸桿菌BL21中異源表達的重組蛋白酶2. 50u g mr處理線蟲 尸.re力Vi"s 3天的作用。 d為本發(fā)明基因在大腸桿菌BL21中異源表達的重組蛋白酶2.50ug mr處理線蟲 尸.re力Vks 3. 5天的作用。 e為陰性對照。
具體實施例方式
實施例一胞外侵染性中性蛋白酶的純化
I、蛋白樣品的處理
1. 取殺線蟲芽胞桿菌單菌落接種到500mlYPD液體培養(yǎng)基中，37。C200rpm培養(yǎng)3 天。
2. 將500ml發(fā)酵培養(yǎng)物于5000rpm/min離心10分鐘，取上清液，并檢測培養(yǎng)上清 液的蛋白酶活性及其殺線蟲活性，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清液的蛋白酶活性為88. 5U m1—1，對線蟲尸.re力Vi"s的半致死率為3. 09 y g mr'24h—'，對線蟲A "Vc^^7iA 的半致死率為7.87ng ml—'24h—'(見附表)。
3. 按40%-70%飽和度加入硫酸銨，于4。C靜置2小時，然后8000rpm/min離心30 分鐘，棄上清。
4. 用50函磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH 為6. 0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW: 8， 000-14000Da) 于10倍的50mM磷酸緩沖液中透析至其電導小于2 ms/cm，即得粗酶液。檢測粗 酶液的蛋白酶活性與殺線蟲活性，發(fā)現(xiàn)粗酶液的酶活為106.9Uml—1，對線蟲尸. re力Vi"s的半致死率為2. 13 u g m廣24h—\對線蟲5. ^^oa^7"s的半致死率 為2. 56y g mr24h—1 (見附表)。
II、電泳純的目標蛋白酶的純化
1. 將以上得到的10ml粗酶液上HiTrap SP FF柱，并用10mM PBS(pH 6.0)平衡洗 脫，然后用含0.5 mo1/ L NaCl平衡緩沖液直線梯度洗脫，檢測洗脫峰成分的蛋 白酶活性及殺線蟲活性；
2. 將活性樣品加入2 M(NH4)2S04并調(diào)至pH7.0,上HiPiVM 16/10 Phenyl FF柱， 用平衡緩沖液(IO mM PBS;1 M (NH》2S(\ pH 7. 0)沖洗，再用含1-0 M (NH4)2S04 平衡緩沖液洗脫，收集5 ml具有蛋白酶活性和殺線蟲活性的洗脫液成分。
3. 將具有蛋白酶活性和殺線蟲活性的洗脫液組分進行SDS-PAGE分析，得到電泳純 的侵染性中性蛋白酶，其分子量約40 kDa (見圖l)。
4.檢測純化后的胞外侵染性中性蛋白酶的酶活與殺線蟲活性，結(jié)果顯示純化的胞 外侵染性中性蛋白酶的酶活為250.5U ml—1,對線蟲尸.re力'w'"s的半致死率為 L69y g mr'24h、對線蟲A ;^A^/ W"s的半致死率為2. 26 P g m1—1241^ (見附 表)。
實施例二胞外侵染性中性蛋白酶基因克隆 I、引物設計
將從食線蟲芽胞桿菌中純化得到的電泳純的侵染性中性絲氨酸蛋白酶經(jīng)過電轉(zhuǎn)移 到PVDF膜后，送中國醫(yī)學科學研究院基礎醫(yī)學研究所進行N-末端氨基酸檢測，測序結(jié) 果為AAATGTGTTL。將該蛋白酶N末端序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST,與來自 feci""s. a/^A^'^ye/^^'e/7s的叩r序列有90%的同源性，序列號為GI: 143248。由 此選取啟始密碼與終止密碼附近同源性較高的片段設計兼并引物，上游 GGGGGATTTATGTGGGTTT和下游TACAATCCG(A) ACT(A)GCATTCCA用于中性蛋白酶基因擴增。 II、基因克隆
1. 提取殺線蟲細菌的基因組DNA
2. 以基因組DNA為模板，以上設計的簡并引物為擴增引物，擴增目的蛋白酶基因。。 PCR擴增共進行35個循環(huán)，條件為95t:變性l min , 55 。C退火l min , 72 。C 延伸1.5 min ，最后72 。C保溫10 min
3. PCR后將目的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收
4. 將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T vector進行連接
5. ￡DH 5a感受態(tài)的制備
6. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和重組子的藍白斑篩選 III、質(zhì)粒測序及序列分析
測序結(jié)果用看圖軟件Chromas校讀、經(jīng)初步分析排除錯誤堿基。 胞外侵染性中性蛋白酶基因的開放性閱讀框架全長1566個堿基，編碼一個521個 氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其中含有27個氨基酸殘基的信號肽(編碼序列為l-81bp)， 194 個氨基酸殘基的前肽(編碼序列為82-663bp)，成熟肽具有300個氨基酸殘基(編碼序列 為664-1563bp)，而成熟肽的起始10個氨基酸序列與蛋白質(zhì)N末端測序獲得結(jié)果完全一 致。該基因登記GeneBank，接受號為AY 708654。用本序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST, 與5.柳^oJi^/e/acie/w的叩r的基因序列有94%的同源性，同時與幾種其他細菌產(chǎn)生 的叩r基因序列有82%-98%的同源性。
實施例三胞外侵染性中性蛋白酶基因表達
I、重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)胞外侵染性中絲蛋白酶基因設計上下游分別含有AfcoI和X力oI的一對引物
5， -CCATGGCCGCTCAACCGGAACAG， ； 5， - CTCGAGCAATCCAACTGCATTCCAGGC-3， PCR后 將擴增得到的DNA片段進行回收、酶切，并與大腸桿菌表達載體pET30a連接、轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a ，篩選得到中性蛋白酶的表達重組質(zhì)粒。
II、 蛋白誘導表達及SDS-PAGE:
1. 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21，以含質(zhì)粒^ET30a的BL21為對照菌株作誘導表 達。
2. 分別挑取轉(zhuǎn)化菌落接種到2 ml含50 ug/ml kanamycin的LB培養(yǎng)基中，37 。C下 培養(yǎng)14 16 h。
3. 以5 %的接種量接至新鮮的相同培養(yǎng)基中，至6ft。。為0.5 0.7時加入l mmo1/ L 的異丙基硫代-e-Z^半乳糖苷(IPTG)誘導4 h。
4. 離心收集菌體，采用SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物(分離膠濃度12 %，濃縮膠濃度4 %)。 電泳分析可看到異源表達的目標重組蛋白酶為42kDa，且主要以包涵體形式表達
(見圖2，泳道l)。
III、 包涵體的分離和純化
1. 將離心收集的菌體用50 mmol/L的Tris-HC1緩沖液(pH7.5)洗滌2次。
2. 將菌體懸浮于溶液A (50 mmo1/ L Tris-HCl， 20畫1/ L DTT， lramol/L EDTA， pH7. 5)中，冰浴超聲破碎15 min， 10 000 rtm離心15 min收集沉淀。
3. 用溶液B (2 mo1/L尿素，1% TritonX-100， 50 mmo1/L Tris-HC1， 20咖ol/L DTT， 1腸1/ L EDTA， pH7. 5)洗滌包涵體2次。
4. 將包涵體在變性緩沖液(8 mo1/ L尿素，50 mmo1/ L Tris-HC1， 20 mrao1/ L DTT， pH8.0)中室溫溶解2 h，離心后將上清液通過0.2um的纖維素濾膜除去 不溶物。
5. 將樣品上l mL的Ni-NTA親合柱，用pH6. 3的變性緩沖液洗滌2次，共計10個柱 體積后，用pH4. 5的變性緩沖液洗脫。純化后的重組表達蛋白進行SDS-PAGE電 泳(見圖2，泳道2)。
IV、 包涵體蛋白的復性
1. 將上述純化得到的純化酶液分別調(diào)節(jié)pH為4.0、 6.0和9.0，用變性緩沖液調(diào)蛋 白濃度為2 mg/ mL。
2. 用復性緩沖液(50腿o1/ L甘氨酸，2咖o1/ L DTT， 10 %甘油，150腿o1/ L NaCl， 50畫1/ L H3P04， 3 ,1/ L GSH， 0.3 ,1/ L GSSG)稀釋50倍。
3. 靜置12h后，將pH為4.0和9.0的復性液調(diào)為pH6.0，然后測活性。為避免在稀 釋過程中產(chǎn)生大量沉淀而影響復性效果，上述操作均應在低溫(〈5。C)下進行。
4. 將復性后的蛋白酶進行SDS-PAGE電泳檢測復性情況，發(fā)現(xiàn)原有的包涵體部分溶 解(見圖2，泳道3、 4)。
5. 檢測復性后的重組蛋白酶的酶活及其殺線蟲活性，結(jié)果顯示在大腸桿菌中異源
表達的中性蛋白酶經(jīng)過復性后其活性達到原來的76.05%，對線蟲尸.re力'w》s 的半致死率為l. 70ug ml—'241"r'，對線蟲A ;^7叩力W"s的半致死率為2. 28ug mlH1 (見附表)。
實施例四蛋白酶活性及殺線蟲活性測定
I 、蛋白酶活性測定
1. 取125u 1的待測酶液與125 u 1 10. 5%的Casein混合，置于37 'C水浴中孵育 20 min。
2. 未被降解的底物用250u 1的10y。的TCA(三氯醋酸)來沉淀，并12000rpm5min離 心。
3. 取500 ul的上清與2.5ml的Na2C03、 500^1的福林酚試劑混合，3(TC水浴 15min。
4. 于680nm下測定該混合物的吸收光值。陰性對照通過酶液與底物不經(jīng)水浴直接 用TCA沉淀獲得。
II、殺線蟲活性測定
1. 無菌的1.5 ml Eppendorf管中加入150 ul待測酶溶液，再加入一定數(shù)量
(50-60條)用無菌水洗滌干凈的線蟲，26 t:孵化8-72小時，隔一定時間用 顯微鏡觀察線蟲體壁的分解和線蟲的死亡情況。對照分別用50 mM的磷酸鹽緩 沖液和加熱失活的粗酶樣品
2. 將待測蛋白酶液加入純化的線蟲體壁中，每12hr用光學顯微鏡觀察線蟲體壁變 化(見圖3)，由此再次確定其蛋白酶降解線蟲體壁的功能。
根據(jù)上述的研究結(jié)果，本發(fā)明中的基因編碼一個可降解線蟲體壁、具有殺線蟲活性 的胞外侵染性中性蛋白酶。該基因的異源表達產(chǎn)物對線蟲尸.re力ViiAS的半致死率為 1.70iig mr24h—'，對線蟲及xj^^^AAS的半致死率為2.28ixg mlK且利用該蛋 白酶處理純化的線蟲體壁，可以發(fā)現(xiàn)大量線蟲體壁被降解的碎片。由于該基因來自細菌， 而細菌又很容易培養(yǎng)，繁殖快。所以該基因能用來研究蛋白酶在侵染線蟲過程中的生化 本質(zhì)，并可作為獲得高效生防菌株的靶基因。
中性蛋白酶序列.txt
SEQUENCE LISTING
<110> 云南大學
<120>食線蟲芽胞桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應用 <130> 1 <160> 1
<170〉 Patentln version 3. 1
<210> 1
<211> 1566
<212> 腿
〈213〉 Bacillus neaiatocida 〈220〉
〈221〉開放性閱讀框架
<222〉 (1)..(1563) <223>
〈220〉
<221>信號肽 〈222〉 (1). . (81) <223〉
<220>
<221> 前肽
〈222> (82).. (663)
<223〉
<220>
<221> 成熟肽
<222> (664).. (1563)
<223>
<300〉
中性蛋白酶序列.txt
<308〉 GenBank/AY708654 <309〉 2006-08-15 〈313> (1)..(1563)
<400〉 1 gtgggtttaggt犯gELaatl:gtctgttgctgtcgccgctt cctttatgagtttaaccatc60
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cgggacctttacggctctcaagacgctgcaagcgtagaag cggcctggaatgcagUgga1560
ttgtaa156權(quán)利要求
1、一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因，其特征在于該基因全長1566bp DNA序列，共編碼521個氨基酸殘基，其中包括27個氨基酸殘基的信號肽，194個氨基酸殘基的前肽，以及300個氨基酸殘基成熟肽。
2、 權(quán)利要求1所述食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因的應用，其特征在 于該基因能用來研究蛋白酶在侵染線蟲過程中的生化本質(zhì)，并作為獲得高效生防菌株的 靶基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應用，屬于生物技術(shù)領域。該基因是從食線蟲芽孢桿菌G4中得到，全長1566bp DNA序列，共編碼521個氨基酸殘基。其中含有27個氨基酸殘基的信號肽，194個氨基酸殘基的前肽，成熟肽具有300個氨基酸殘基。該基因編碼的蛋白酶具有解線蟲體壁、殺線蟲活性；在大腸桿菌BL21中異源表達的重組蛋白也具有蛋白酶活性和殺線蟲活性。該胞外侵染性中性蛋白酶基因是食線蟲芽孢桿菌侵染線蟲過程中的一個重要的毒性因子。該基因用來研究蛋白酶在侵染線蟲過程中的生化本質(zhì)，并作為獲得高效生防菌株的靶基因。本發(fā)明具有安全性高、環(huán)境無污染、殺蟲效果佳等優(yōu)點。
文檔編號C12N9/52GK101113455SQ20071006591
公開日2008年1月30日 申請日期2007年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日
發(fā)明者張克勤, 牛秋紅, 黃曉瑋 申請人:云南大學