一株犁頭霉菌株及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株犁頭霉菌株及其應用，屬于微生物生防防治技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物寄生線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲已知種類就 達70多種，為害3000多種植物，每年造成巨大的損失。我國植物寄生線蟲主要危害煙草、 花丼、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等經(jīng)濟作物，造成的損失十分驚人。據(jù)全國煙草 病蟲害防治信息中心不完全統(tǒng)計，2000年全國僅煙草根結(jié)線蟲發(fā)病面積已達50萬公頃，直 接經(jīng)濟損失5億多元。僅云南省發(fā)病面積就達2. 7萬公頃，直接經(jīng)濟損失約1億元，間接損 失更為嚴重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲每年造成的損失達8億元之多。松材線蟲被稱為無 煙森林火災，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺灣、香港等部份地區(qū)嚴重發(fā)生， 有向全國漫延的趨勢。在山東、廣東、海南和云南等蔬菜主產(chǎn)區(qū)，蔬菜根結(jié)線蟲呈上升趨勢。 貴州省西洋參因嚴重發(fā)生根結(jié)線蟲而只好停產(chǎn)。更嚴重的是由于根結(jié)線蟲侵染后造成作物 傷口，致使作物根部病害嚴重發(fā)生。據(jù)不完全統(tǒng)計，線蟲病害使我國各種作物年平均產(chǎn)量損 失達10-15%，全球每年因線蟲造成的損失達1000億美元(Weischer，1994)。
[0003] 目前線蟲的防治主要依靠化學殺線蟲劑，但化學殺線蟲劑多為滅生性巨毒農(nóng)藥， 不僅產(chǎn)生抗藥性，更造成環(huán)境污染，危害人體健康。相繼有不少被禁用或即將禁用。美國溴 甲烷于2000年、二溴甲烷于2005年分別停止使用。目前生產(chǎn)上大量使用的鐵滅克雖然對 線蟲有很好的防效，但毒性高，破壞土壤微生物區(qū)系?；瘜W殺線蟲劑在防治線蟲危害，保障 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的同時，給人類健康和環(huán)境帶來了嚴重的負面影響。由于農(nóng)藥殘留超標，我國對外 出口的茶葉、三七、鴨梨、哈密瓜、果汁、花丼、蜂蜜及多種畜禽產(chǎn)品屢屢發(fā)生商品退賠事件， 直接影響農(nóng)產(chǎn)品出口。同時目前國內(nèi)使用的化學殺線蟲劑主要為國外進口產(chǎn)品，價格過于 昂貴。因此，研制開發(fā)線蟲生防制劑顯得尤為重要。
[0004] 線蟲生防制劑早在上個世紀70年代就已上市。但經(jīng)過幾十年的發(fā)展，到今天其使 用和推廣仍不廣泛，包括中國在內(nèi)的很多國家仍未使用。許多在室內(nèi)試驗中對線蟲表現(xiàn)出 很強侵染能力的菌株在實際應用中的效果不理想。在田間試驗中，生防菌的防治效果會受 各種因素的影響。土壤環(huán)境（有機質(zhì)含量、濕度、溫度等）對生防菌劑在土壤中的存活、定 殖、擴散等有重要的影響。此外，土壤中殘留的化學農(nóng)藥，土壤中存在的一些金屬離子都會 影響生防菌劑在土壤中的存活、定殖以及對線蟲的防治效果。
[0005] 生防菌株是研宄生防菌劑的一個重要前提。不同菌株的生物學特性，對線蟲的防 治效果差異較大。自然界中，線蟲的天敵是很多的，主要有：真菌、細菌、螨、捕食性線蟲等。 其中最多的是真菌，目前研宄最多且成為產(chǎn)品上市的也主要是真菌。根據(jù)其侵染線蟲的特 性主要分為： 1、 捕食菌物：通過營養(yǎng)菌絲特化形成的捕食器捕捉線蟲； 2、 寄生菌物：通過寄生線蟲的卵、雌蟲、胞囊等的菌物； 3、 產(chǎn)毒菌物：能夠產(chǎn)生毒素毒殺線蟲的菌物。
[0006] 目前成為產(chǎn)品進入市場的主要是食線蟲菌物，包括捕食菌物和寄生菌物。迄今國 內(nèi)外已報道的的食線蟲菌物約有400種，其中捕食線蟲菌物約有12個屬，常見的有輪蟲霉 屬、節(jié)叢孢屬、及單頂孢屬和隔孢屬。內(nèi)寄生線蟲菌物有關(guān)屬約有13個，常見的有毒蟲霉 屬、鉤絲孢屬和被毛孢等。機會菌物約200種，確定的屬大約有71個，研宄較多的有節(jié)叢孢 屬、隔指孢屬、綠僵菌屬、擬青霉屬、及普可尼亞屬和木霉屬。產(chǎn)毒菌物主要有絲霉屬和側(cè)耳 屬。迄今為止，公開文獻已報道了能抑制根結(jié)線蟲的犁頭霉菌株，但能殺滅根結(jié)線蟲的犁頭 霉菌株還未見公開文獻的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有生防技術(shù)菌株之不足，提供一株能殺滅植物根結(jié)線 蟲的犁頭霉菌株及其應用。
[0008] 本發(fā)明用常規(guī)方法從自然界中進行菌株分離、培養(yǎng)、獲得犁頭霉 210LTM，該菌株2014年10月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏號為：CGMCC No. 9777。保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0009] 本發(fā)明通過以下方式實現(xiàn)： 一、菌株的獲得： 本發(fā)明的菌株按微生物土壤分離的常規(guī)普通方法進行涂布分布，挑取單菌落，進行純 化培養(yǎng)獲得，采用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)，經(jīng)真菌ITS鑒定為，定名為210LTM ; 形態(tài)：菌絲生長迅速，頂端膨大，菌絲呈白色長毛狀，不產(chǎn)色素，無匍匐菌絲和假 根，菌絲無隔膜、有較多分枝，頂端膨大形成圓形的孢子囊。孢子囊與中軸基合成卵形，囊 軸為圓錐型，孢子表面光滑，較多，小圓形。
[0010] 二、210LTM菌株的培養(yǎng)： 首先，按常規(guī)平板培養(yǎng)方法培養(yǎng)210LTM菌株，在無菌條件下收集平板上培養(yǎng)已產(chǎn)生 的孢子；然后，按常規(guī)液體培養(yǎng)方法培養(yǎng)210LTM菌株液體種。將孢子接種到預先滅菌并 含有玻璃珠的液體PDA培養(yǎng)基中，28°C 145rpm/min培養(yǎng)2-3天，視培養(yǎng)基中長滿細小的 菌絲球為止備用，此為液體種子；最后，按常規(guī)液體發(fā)酵方法培養(yǎng)210LTM菌株。將長好的 液體種子無菌接入預先滅菌的液體PDA培養(yǎng)基中，接入量按新培養(yǎng)基裝液量的10%計算， 28°C 145rpm/min培養(yǎng)4-7天，線蟲常規(guī)生測達到最大殺蟲效果是時，即為210LTM有效培養(yǎng) 物，停止發(fā)酵。
[0011] 三、210LTM對植物根結(jié)線蟲的防治效果測定： 取出含有大量卵囊番茄根系，用水輕輕沖洗，小心取下卵囊，放在〇. 5%次氯酸鈉中消 毒3 min，再用無菌水沖洗3次，把卵囊放在內(nèi)有少量無菌水的培養(yǎng)皿里，25°C恒溫箱中培 養(yǎng)，24h后收集一次新孵化的二齡幼蟲備用。
[0012] 將有效培養(yǎng)物加入32孔的培養(yǎng)板中，每孔加入100 μ 1有效培養(yǎng)物，分別向處理和 對照中各加入新孵化的根結(jié)線蟲二齡幼蟲，每孔50條。放入25°C培養(yǎng)箱中，10min、60min 后調(diào)查擊倒率，12h后記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率。
[0013] 本發(fā)明有益效果在于：犁頭霉（^sii/iasp.) 210LTM菌株能有效防治植物寄生線 蟲，能在制備防治植物根結(jié)線蟲制劑中應用；菌株的培養(yǎng)物對植物根結(jié)線蟲的防治效果大 于 60%〇
【具體實施方式】
[0014] 實施例的
【發(fā)明內(nèi)容】
法同
【發(fā)明內(nèi)容】
部分的描述。下面通過實施例對本發(fā)明作詳細的 說明。
[0015] 實例一： 1. 用PDA平板培養(yǎng)210LTM菌株，待平板上長出孢子時，取出備用； 2. 在無菌條件下收集平板上的孢子，將孢子接入含有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)中， 28°C 145rpm/min 培養(yǎng)； 3. 培養(yǎng)2天，視培養(yǎng)基中長滿細小的菌絲球為止備用，此為液體種子； 4. 將長好的液體種子無菌接入預先滅菌的液體PDA培養(yǎng)基中，接入量按新培養(yǎng)基裝 液量的10%計算，28°C 145rpm/min培養(yǎng)4天； 5. 線蟲常規(guī)生測60min后，線蟲致死率達到60%，停止發(fā)酵，即為210LTM有效培養(yǎng)物。
[0016] 實例二： 1. 用PDA平板培養(yǎng)210LTM菌株，待平板上長出孢子時，取出備用； 2. 在無菌條件下收集平板上的孢子，將孢子接入含有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)中， 28°C 145rpm/min 培養(yǎng)； 3. 培養(yǎng)3天，視培養(yǎng)基中長滿細小的菌絲球為止備用，此為液體種子； 4. 將長好的液體種子無菌接入預先滅菌的液體PDA培養(yǎng)基中，接入量按新培養(yǎng)基裝 液量的10%計算，28°C 145rpm/min培養(yǎng)5天； 5. 線蟲常規(guī)生測60min后，線蟲致死率達到75%，停止發(fā)酵，即為210LTM有效培養(yǎng)物。
[0017] 實例三： 1. 用PDA平板培養(yǎng)210LTM菌株，待平板上長出孢子時，取出備用； 2. 在無菌條件下收集平板上的孢子，將孢子接入含有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)中， 28°C 145rpm/min 培養(yǎng)； 3. 培養(yǎng)3天，視培養(yǎng)基中長滿細小的菌絲球為止備用，此為液體種子； 4. 將長好的液體種子無菌接入預先滅菌的液體PDA培養(yǎng)基中，接入量按新培養(yǎng)基裝 液量的10%計算，28°C 145rpm/min培養(yǎng)7天； 5. 線蟲常規(guī)生測60min后，線蟲致死率達到97%，停止發(fā)酵，即為210LTM有效培養(yǎng)物。
[0018] 實例四： 1. 用PDA平板培養(yǎng)210LTM菌株，待平板上長出孢子時，取出備用； 2. 在無菌條件下收集平板上的孢子，將孢子接入含有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)中， 28°C 145rpm/min 培養(yǎng)； 3. 培養(yǎng)3天，視培養(yǎng)基中長滿細小的菌絲球為止備用，此為液體種子； 4. 將長好的液體種子無菌接入預先滅菌的液體PDA培養(yǎng)基中，接入量按新培養(yǎng)基裝 液量的10%計算，28°C 145rpm/min培養(yǎng)7天； 5. 線蟲常規(guī)生測60min后，線蟲致死率達到100%，停止發(fā)酵，即為210LTM有效培養(yǎng)物。
[0019] 實例五： 1. 用PDA平板培養(yǎng)210LTM菌株，待平板上長出孢子時，取出備用； 2. 在無菌條件下收集平板上的孢子，將孢子接入含有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)中， 28°C 145rpm/min 培養(yǎng)； 3. 培養(yǎng)2天，視培養(yǎng)基中長滿細小的菌絲球為止備用，此為液體種子； 4. 將長好的液體種子無菌接入預先滅菌的液體PDA培養(yǎng)基中，接入量按新培養(yǎng)基裝 液量的10%計算，28°C 145rpm/min培養(yǎng)7天； 5. 線蟲常規(guī)生測60min后，線蟲致死率達到95%，停止發(fā)酵，即為210LTM有效培養(yǎng)物。
[0020] 實例六：田間試驗結(jié)果 將210LTM有效培養(yǎng)物分別在云南省陸良縣大棚蕃茄和玉溪煙草種植地進行田間試 驗，結(jié)果如下： 210LTM有效培養(yǎng)物田間使用對根結(jié)線蟲的防治效果
結(jié)果表明：210LTM有效培養(yǎng)物作用后作物的病株率/%、根結(jié)百分率/%都低于空白對 照、阿魏菌素和呋喃丹，平均防效高于阿魏菌素和化學呋喃丹。用本發(fā)明在田間防治作物根 結(jié)線蟲，有較好的防治效果。
【主權(quán)項】
1?一株犁頭霉（^wit/iasp.) 210LTM菌株，保藏號：CGMCCNo. 9777。2.權(quán)利1所述犁頭霉) 210LTM菌株在制備防治植物根結(jié)線蟲制劑中的應 用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株犁頭霉菌株及其應用，屬于微生物生防防治技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的犁頭霉(Absidiasp.)210LTM菌株，于2014年10月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC No.9777。本發(fā)明的犁頭霉(Absidiasp.)210LTM菌株在制備防治植物根結(jié)線蟲制劑中的應用。本發(fā)明有益效果在于：犁頭霉(Absidiasp.)210LTM菌株能有效防治植物寄生線蟲，能在制備防治植物根結(jié)線蟲制劑中應用，菌株的培養(yǎng)物對植物根結(jié)線蟲的防治效果大于60%。CGMCC No.977720141027
【IPC分類】C12N1/14, A01N63/04, C12R1/645, A01P5/00
【公開號】CN104928193
【申請?zhí)枴緾N201510360474
【發(fā)明人】喬敏, 余澤芬, 謝志丹, 賈東晨, 張克勤
【申請人】云南大學
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月26日