重組菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物領(lǐng)域，特別設(shè)及重組菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酸(Glutamic acid),其學(xué)名為2-氨基-5-梭基戊酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種常 見氨基酸之一。谷氨酸是目前世界上產(chǎn)量最大的氨基酸品種，全球每年對谷氨酸的需求量 達(dá)到2500萬噸。1^-谷氨酸是谷氨酸的左旋體，其具有增鮮、降低血氨、改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改 善兒童智力發(fā)育、擴(kuò)張血管、增強(qiáng)血液循環(huán)、促進(jìn)花穗發(fā)育等功能，并且可W生產(chǎn)許多重要 的下游產(chǎn)品，如k谷氨酸鋼、k蘇氨酸、聚谷氨酸等，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、人造制革、化 妝品、農(nóng)業(yè)等行業(yè)。
[0003] 谷氨酸的制備起始于18世紀(jì)。1866年德國化學(xué)家從小麥面筋的水解物中提取得到 谷氨酸，1957年日本率先從自然界分離得到谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)，開啟了利用糖和氨發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的研究，因發(fā)酵法具有原料成本低、反應(yīng) 條件溫和、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，目前仍是谷氨酸生產(chǎn)的主要方法。
[0004] 谷氨酸棒桿菌是一種好氧、不產(chǎn)抱子的革蘭氏陽性細(xì)菌，基因組大小為3282化，它 不僅能利用葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行生長，而且能利用包括乙酸和噓拍酸在內(nèi)的其它有機(jī)酸 和碳水化合物為唯一碳源或混合碳源進(jìn)行生長。谷氨酸棒桿菌為生物素缺陷型，需要補(bǔ)充 生物素才能生長。當(dāng)培養(yǎng)基中的生物素過量時(shí)，菌體不向細(xì)胞外分泌產(chǎn)生谷氨酸；當(dāng)生物素 被限量添加時(shí)，菌體則大量分泌產(chǎn)生谷氨酸，因而野生型的谷氨酸棒桿菌可通過生物素限 量添加來誘導(dǎo)分泌產(chǎn)生谷氨酸。此外，在生物素過量的情況下通過添加某種表面活性劑如 Twee40或TweenSO也能誘導(dǎo)谷氨酸棒桿菌過量合成谷氨酸。
[0005] 近年來，隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032基因組測序的完成W及谷氨酸棒 桿菌基因操作技術(shù)的不斷完善，使得通過分子生物學(xué)手段對谷氨酸棒桿菌進(jìn)行相關(guān)改造成 為現(xiàn)實(shí)。谷氨酸在生物體內(nèi)的合成代謝途徑也已相繼報(bào)道，見圖1。日本味之素株式會社依 據(jù)谷氨酸合成的代謝途徑對谷氨酸生產(chǎn)菌種作了一些基因改造，如引入棒狀細(xì)菌的巧樣酸 合成酶基因使腸細(xì)菌生產(chǎn)谷氨酸的能力增強(qiáng);增加丙酬酸脫氨酶基因的拷貝數(shù)而增強(qiáng)丙酬 酸脫氨酶活性，并使棒狀細(xì)菌的谷氨酸生產(chǎn)能力提高;過表達(dá)YHFK基因使k谷氨酸產(chǎn)量提 局等。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)往往需要在培養(yǎng)基中添加過量的生物素及表面活性劑如Twee40或 TweenSO，增加了生產(chǎn)成本，且產(chǎn)率往往較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種重組菌株及其應(yīng)用。與野生菌株相比，本發(fā)明提供的菌 株顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)提高了谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
[000引為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0009]本發(fā)明提供了一種重組菌株，其包含編碼突變yg濁蛋白質(zhì)的突變yg濁基因。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述重組菌株中所述突變yggB蛋白質(zhì)為A106氨 基酸處具有突變。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述重組菌株中所述突變yggB蛋白質(zhì)具有 A106V突變，獲得的菌株命名為MHZ-0112-1。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述重組菌株還包括編碼降低ODHC活性的突變 O化A基因；所述突變O^A基因?yàn)閷^A基因進(jìn)行失活改造。具體的，本發(fā)明提供的含有突變 O化A基因的菌株命名為MHZ-0112-2。制備方法如下：
[0013] 由谷氨酸合成代謝途徑（圖1)可知，S簇酸循環(huán)中由a-酬戊二酸脫氨酶復(fù)合體 (ODHC)催化的a-酬戊二酸向班巧酷輔酶A的轉(zhuǎn)化是谷氨酸合成代謝主要的競爭途徑，為了 降低0畑C的活性，需將其Elo亞基的編碼基因O^A進(jìn)行失活改造。采用的手段是引入堿基缺 失，使蛋白合成過程中出現(xiàn)移碼突變，從而達(dá)到失活的目的。
[0014] 在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutami州mATCC13869)o化A基因（Gene Bank N0.NCgll084)的核巧酸序列（SEQ ID No.9)， 由此核巧酸序列設(shè)計(jì)在特定位置引入堿基缺失W使OdM基因失活，基于堿基序列及所選缺 失位置合成了四條引物（如SEQ ID NO. 10-13所示）。利用化USion超保真聚合酶（New 化gland BioLabs)，WB1/B2，B3/B4作為引物，W谷氨酸棒桿菌ATCC 13869的基因組DNA作 為模板制備O^A堿基缺失位點(diǎn)的上下游片段。PCR程序?yàn)椋?8 °C變性IOs，50°C復(fù)性20s，72°C 延伸20s，循環(huán)30次后。所得兩個(gè)片段經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)純化后，利用引物組 B1/B4進(jìn)行overlap PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)純化后利用EcoRI/ BamHI進(jìn)行消化，同時(shí)將pK18-mobsacB利用EcoRI/BamHI進(jìn)行消化，并用T4DNA連接酶 (TransGen Biotech)將片段與載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans ITl感受態(tài)細(xì)胞（TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，EcoRI/BamHI酶切鑒定得到over lap PCR片段插入 pKlSmobsacB的陽性克隆，進(jìn)一步通過測序（Invitrogen公司）鑒定插入的片段確實(shí)為〇化八 基因待缺失位點(diǎn)的上下游片段。
[0015] 將所得到的質(zhì)粒命名為地18-0化Adal。將地18-0化Adal轉(zhuǎn)入M監(jiān)-Ol 12-1菌株中。 在含有15mg/L的卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上選擇單交換轉(zhuǎn)化體，其中帶有OdM堿基缺失的序 列通過與內(nèi)源O^A基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用化St化q DNA聚合酶 (TransGen Biotech), WB1/T2，T1/B4 引物對進(jìn)行菌落 PCR 鑒定 Kan^ 克隆，PCR 參數(shù)為：94°C 3〇3,5〇1：3〇3,721：4〇3，共26個(gè)循環(huán)，兩個(gè)引物對均擴(kuò)增出目的片段的克隆為陽性克隆。將 挑選出的陽性克隆接種入無抗冊I培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~1地，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在 含有10%薦糖的固體BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)36h，將所篩選出的菌株進(jìn)一步進(jìn)行卡那抗性表型驗(yàn) 證，挑選KanS的重組子利用B1/B4引物對擴(kuò)增目的片段，陽性克隆的目的片段較野生型所擴(kuò) 增的片段小，將陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，得到O^A堿基缺失的菌株，命名為MHZ-Ol 12-2。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述重組菌株還包括突變gdh基因；所述突變 g化基因?yàn)檫^表達(dá)g化基因。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述重組菌株還包括突變gltA基因；所述突變 gltA基因?yàn)檫^表達(dá)gltA基因。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述重組菌株中所述過表達(dá)通過構(gòu)建過表達(dá)載 體或者插入啟動子的方式增強(qiáng)所述基因的表達(dá)。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述重組菌株中所述過表達(dá)載體為祀c-gdh或 pEC-gltA;所述啟動子為sod或Uif。
[0020] 分別根據(jù)NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中g(shù)化基因（Gene Bank N0:NCgll084)的序列（SEQ N0.14)和gltA基因（GeneBankN0:NCgl0795)的序列（SEQN0.15)設(shè)計(jì)引物，如SEQID NO. 16~19所示。
[0021 ]整合質(zhì)粒地 18-Psodg 化，pKl8-1:ufgltA 的構(gòu)建：
[0022] W谷氨酸棒桿菌ATCC13869基因組作為模板，分別WC1/C2，D1/D2引物對擴(kuò)增g化 及gltA兩個(gè)基因的全長片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收純化后，將所得片段分別利用 EcoRI/Sall雙酶切，質(zhì)粒祀C-XK9犯(61:29164935)也進(jìn)行相同的雙酶切，利用140臟連接酶 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化化anslTl感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoRI/Sall雙酶 切鑒定，最后進(jìn)行測序確認(rèn)，所得質(zhì)粒分別命名為祀C-g化，祀C-gltA。制備M監(jiān)-Ol 12-2的感 受態(tài)細(xì)胞并將對照質(zhì)粒祀(：-乂1(9犯及上述所構(gòu)建96(：-肖化，96(：-肖114轉(zhuǎn)入順2-0112-2菌株 中。利用KanlSBHI平板篩選出陽性克隆，并提取質(zhì)粒驗(yàn)證，所得到的S個(gè)帶有復(fù)制性質(zhì)粒的 菌株分別命名為MHZ-0112-3，MHZ-0112-4，MHZ-0112-5。
[0023] W谷氨酸棒桿菌ATCC13869的基因組為模板，分別WC3/C4，C5/C6，C7/C8引物對 (如SEQ ID NO. 20~31所示)在化USion超保真聚合酶的作用下PCR擴(kuò)增，得到g化起始密碼 子的上游同源臂、SOd啟動子和起始密碼子的下游同源臂，PCR參數(shù)為98°C10s，50°C20s，72 °C20s，共30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行割膠回收。W上述所得片段混 合物為模板，WC3/C8引物對進(jìn)行overlap PCR擴(kuò)增，并割膠回收，產(chǎn)物用Sail和化ndIII雙 酶切，pKlSmobsacB用同樣的酶進(jìn)行切割，利用T4DNA連接酶在22°C下連接1-化，轉(zhuǎn)化 化anslTl感受態(tài)細(xì)胞，挑取卡那抗性克隆，SalIMindHI酶切鑒定得到overlap PCR片段插 入地ISmobsacB的陽性克隆，進(jìn)一步通過測序鑒定插入的片段確實(shí)為添加了Psod啟動子的 g化基因上下游同源臂。所得到的質(zhì)粒命名為地18-Psodg化。
[0024] 地18-tufgltA的構(gòu)建過程與上述類似，所用引物對為D3/D4，D7/D8擴(kuò)增gltA起始 密碼子的上下游同源臂，WD5/D6擴(kuò)增啟動子Ptuf ,Overlap PCR所用引物對為D3/D8。
[00巧]高表達(dá)菌株的制備：
[00%] 制備M監(jiān)-0112-2菌株的感受態(tài)細(xì)胞，分別將質(zhì)粒地18斗3〇(1旨化，91(18-1證旨11八進(jìn) 行轉(zhuǎn)化。
[0027] 在含有15mg/L的卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上選擇單交換轉(zhuǎn)化體，其中帶有sod(tuf) 啟動子的序列通過與內(nèi)源gdh(gltA)基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用 Fast hq DNA聚合酶，WC3/T2，T1/C6引物對（或D3/T2，T1/D6引物對)進(jìn)行菌落PCR鑒定 KanK克隆，PCR參數(shù)同上，兩個(gè)引物對均擴(kuò)增出目的片段的克隆為陽性克隆。將挑選出的陽 性克隆接種入無抗BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-1地，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在含有10%薦 糖的固體BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)36h，將所篩選出的菌株進(jìn)一步進(jìn)行卡那抗性表型驗(yàn)證，挑選 Kan%重組子利用C3/C6引物對(或D3/D6引物對)擴(kuò)增目的片段，陽性克隆的目的片段比野 生型所擴(kuò)增的片段大，將陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，得到sod(tuf)啟動子成功整合至gdh (gltA)基因 ATG 之前的菌株，命名為 MHZ-0112-6(MHZ-0112-7)。
[0028] 同理，制備M監(jiān)-0112-6感受態(tài)細(xì)胞，將地18-tufgltA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)兩輪重組篩選， 得到gdh與gltA疊加的突變株MHZ-0112-8。