2-3 ， MHZ-0112-4 ， MHZ-0112-5 。
[0099] 將所得到的兩個(gè)菌株及13869-yggBA106V-〇化Adal菌株分別接種于含有表6所示 成分的培養(yǎng)基中，于3rC下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期，分別對(duì)菌體內(nèi)谷氨酸脫氨酶(GDH)及 巧樣酸合酶(CS)的表達(dá)量的測(cè)定，兩個(gè)酶活的測(cè)定方法如下：
[0100] GDH酶活測(cè)定方法:將培養(yǎng)后的細(xì)菌在4°C下WlOO(K)巧m/min離屯、5min，收集菌體， 用O.Olmol/L憐酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)洗一次，再重懸于1/10原菌液體積的PBS中，冰浴， 超聲破菌(350W，持續(xù)5s，間隔IOs，共20次）后，10000巧m/min離屯、IOmin，去沉淀，得到粗酶 溶液，WNADP+為輔酶進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)體系為:0.5mmol/L NADP% 15mmol/L谷氨酸，25mmol/L Tris-HCl，p冊(cè).0。取樣品酶液測(cè)定GDH催化輔酶NADH+還原所引起的光吸收值在340nm波長(zhǎng) 處的變化，每分鐘催化1皿〇1 NADP+還原所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位化）。酶活=A OD340 X 0.2 X 2 /0.04 8 6，蛋白濃度=1.45 X OD280-0.74 X OD260，單位酶活=酶活/蛋白濃度。 所有測(cè)定都在邸CKMAN DU800分光光度計(jì)上完成。WProtien Assay(Bio-Rad)測(cè)定粗酶液 中的蛋白質(zhì)濃度，使用牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
[0101] CS酶活測(cè)定方法:離屯、培養(yǎng)液W分離菌體。W含有200mmol/L谷氨酸鋼的50mmol/L 化iS緩沖液(pH 7.5)清洗細(xì)胞，然后再W相同溶液懸浮。冰浴，超聲破菌(350W，持續(xù)5s，間 隔10s，共20次）后，10000;rpm/min離屯、IOmin，去沉淀，得到粗酶溶液，根據(jù)Methods Enzymol. 13,3-11 (1969)測(cè)定巧樣酸合成酶的活性。具體而言，將此粗酶溶液加入含有 lOOmmo/L IYis-HCKpH 8)，0.1mmol/L DTNB，200mmol/L谷氨酸鋼，0.3mmol/L乙獻(xiàn)基輔酶A 的反應(yīng)液中，然后W分光光度計(jì)在3(TC，412nm測(cè)定其吸光度增加，W此最為背景值，進(jìn)一步 加入草醋酸使其最終濃度為0.5mmol/L。測(cè)定在412nm處吸光值的增加，從背景值推算獲得 巧樣酸合成酶的酶活。WProtienAssay (Bio-Rad)測(cè)定粗酶液中的蛋白質(zhì)濃度，使用牛血清 蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
[0102] 表6谷氨酸生產(chǎn)能力及酶活測(cè)定的檢測(cè)
[0103]
[0104] 將祀C-g化，祀C-g 1 tA轉(zhuǎn)入MHZ-0112-2菌株中，制得菌株MHZ-0112-4和MHZ-0112-5，谷氨酸的產(chǎn)量分別為23.4g/L和26.4g/L，與野生菌株相比，菌株MHZ-Ol 12-4和MHZ-Ol 12-5極顯著(P<0.01)提高了谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。與M監(jiān)-0112-3相比，M監(jiān)-0112-4比M監(jiān)-0112-3GDH表達(dá)量提高4倍，CS表達(dá)量基本持平，谷氨酸提高41.8 % ; M監(jiān)-0112-5比MHZ-0112-3GDH 表達(dá)量基本持平，CS表達(dá)量提高7.4倍，谷氨酸提高60%。血12-0112-4和血12-0112-5極顯著 (P<0.01)提高了谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0105] (3)整合質(zhì)粒地18斗3〇(1邑化，91(18-1:證邑114的構(gòu)建
[0106] W谷氨酸棒桿菌ATCC13869的基因組為模板，分別WC3/C4，C5/C6，C7/C8引物對(duì) (序列見表7)在Phusion超保真聚合酶的作用下PCR擴(kuò)增，得到gdh起始密碼子的上游同源 臂、SOd啟動(dòng)子和起始密碼子的下游同源臂，PCR參數(shù)為98°(：1〇3,5〇1：2〇3,721：2〇3，共30個(gè) 循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行割膠回收。W上述所得片段混合物為模板， WC3/C8引物對(duì)進(jìn)行over lap PCR擴(kuò)增，并割膠回收，產(chǎn)物用Sal I和Hindi II雙酶切， pKlSmobsacB用同樣的酶進(jìn)行切割，利用T4DNA連接酶在22°C下連接1-化，轉(zhuǎn)化Transl Tl感 受態(tài)細(xì)胞，挑取卡那抗性克隆，Sal I/Hindl 11酶切鑒定得到over lap PCR片段插入 pKlSmobsacB的陽性克隆，進(jìn)一步通過測(cè)序鑒定插入的片段確實(shí)為添加了Psod啟動(dòng)子的g化 基因上下游同源臂。所得到的質(zhì)粒命名為地18-Psodg化(測(cè)序結(jié)果如SEQ ID No.37所示。）。
[0107] pK18-tufgltA(測(cè)序結(jié)果如SEQ ID齡.38所示。）的構(gòu)建過程與上述類似，所用引 物對(duì)為D3/D4，D7/D8擴(kuò)增gltA起始密碼子的上下游同源臂，WD5/D6擴(kuò)增啟動(dòng)子Ptuf, Overlap PCR所用引物對(duì)為D3/D8。
[010引表7引物序列
[0109]
[0110] (4)高表達(dá)菌株的制備
[0111] 同實(shí)施例1中所述，制備MHZ-Ol 12-2菌株的感受態(tài)細(xì)胞，分別將質(zhì)粒pK18-Psodg化，地18-tufgltA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0112] 在含有15mg/L的卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上選擇單交換轉(zhuǎn)化體，其中帶有sod(tuf) 啟動(dòng)子的序列通過與內(nèi)源gdh(gltA)基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用 Fast hq DNA聚合酶，WC3/T2，T1/C6引物對(duì)（或D3/T2，T1/D6引物對(duì))進(jìn)行菌落PCR鑒定 KanK克隆，PCR參數(shù)同上，兩個(gè)引物對(duì)均擴(kuò)增出目的片段的克隆為陽性克隆。將挑選出的陽 性克隆接種入無抗BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-1地，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在含有10%薦 糖的固體BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)36h，將所篩選出的菌株進(jìn)一步進(jìn)行卡那抗性表型驗(yàn)證，挑選 KanW重組子利用C3/C6引物對(duì)(或D3/D6引物對(duì))擴(kuò)增目的片段，陽性克隆的目的片段比野 生型所擴(kuò)增的片段大，將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得到SOd啟動(dòng)子成功整合至g化基因ATG之 前的菌株，命名為血12-〇112-6;測(cè)序結(jié)果如56〇10齡.39所示。
[0113] 得到化f啟動(dòng)子成功整合至gltA基因ATG之前的菌株，命名為MHZ-0112-7。測(cè)序結(jié) 果如沈Q ID No.40所示。
[0114] 同理，制備M監(jiān)-0112-6感受態(tài)細(xì)胞，將地18-tuf gl tA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)兩輪重組篩選， 得到肖化與肖1*4疊加的突變株血12-〇112-8，測(cè)序結(jié)果如56〇10齡.41所示。
[0115] (5)高表達(dá)菌株相應(yīng)酶活測(cè)定及谷氨酸產(chǎn)量確定
[0116] 將所得到的菌株M監(jiān)-0112-6，MHZ-0112-7及MHZ-0112-8接入BHI培養(yǎng)基中，于3TC 下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期，測(cè)定GDH及CS酶表達(dá)活性;將其接于實(shí)施例2中所述的發(fā)酵培 養(yǎng)基中培養(yǎng)至糖消耗完全后，測(cè)定谷氨酸的產(chǎn)量及0D，各結(jié)果列于表8中。
[0117]表8酶活測(cè)定及谷氨酸產(chǎn)量結(jié)果 [01181
[0119] 如表8所示，在單獨(dú)利用強(qiáng)啟動(dòng)子Psod表達(dá)gdh基因，GDH酶活較野生型提高約2.5 倍，谷氨酸產(chǎn)量提高約1.8倍，與野生菌株相比，該菌株極顯著(P<0.01)提高了谷氨酸的發(fā) 酵產(chǎn)量。
[0120] 單獨(dú)利用Ptuf啟動(dòng)子表達(dá)gltA基因?qū)S酶活增加了約4倍，谷氨酸產(chǎn)量提高至 30.8g/L，與野生菌株相比，該菌株極顯著(P<0.01)提高了谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0121] ]\1監(jiān)-0112-8與]\1監(jiān)-0112-6、]\1監(jiān)-0112-7相比，谷氨酸產(chǎn)量提高19.2%與14.6%。
[0122] 將兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行過表達(dá)后，谷氨酸產(chǎn)量繼續(xù)提高至35.5g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到約 59%，與野生菌株相比，該菌株極顯著(P<0.01)提高了谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0123] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組菌株，其特征在于，其包含編碼突變yggB蛋白質(zhì)的突變yggB基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，所述突變yggB蛋白質(zhì)為A106氨基酸處 具有突變； 所述突變yggB蛋白質(zhì)具有A106V突變； 還包括編碼降低ODHC活性的突變odhA基因；所述突變odhA基因?yàn)閷?duì)odhA基因進(jìn)行失活 改造。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌株，其特征在于，還包括突變gdh基因；所述突變gdh 基因?yàn)檫^表達(dá)gdh基因； 還包括突變gltA基因；所述突變gltA基因?yàn)檫^表達(dá)gltA基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌株，其特征在于，所述過表達(dá)gdh基因或過表達(dá)gltA基 因中的所述過表達(dá)通過構(gòu)建過表達(dá)載體或者插入啟動(dòng)子的方式增強(qiáng)所述基因的表達(dá)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌株，其特征在于，所述過表達(dá)載體為pEC-gdh或pEC-gltA;所述啟動(dòng)子為sod或tuf〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的重組菌株，其特征在于，其保藏編號(hào)為CGMCC No.11941。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟： 以野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13869為出發(fā)菌株； 步驟1、在yggB中引入點(diǎn)突變A106V; 步驟2、對(duì)odhA基因進(jìn)行失活改造； 步驟3、過表達(dá)gdh基因； 步驟4、過表達(dá)gltA基因。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3或步驟4中所述過表達(dá)通過構(gòu)建 過表達(dá)載體或者插入啟動(dòng)子的方式增強(qiáng)所述基因的表達(dá)；所述過表達(dá)載體為pEC-gdh或 pEC-gltA;所述啟動(dòng)子為sod或tuf〇10. -種發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的方法，其特征在于，以如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的重組菌 株為發(fā)酵菌株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及重組菌株及其應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13869在未經(jīng)改造前基本不產(chǎn)谷氨酸，本發(fā)明提供的菌株MHZ-0112-1谷氨酸的產(chǎn)量為4.7g/L；MHZ-0112-2谷氨酸的產(chǎn)量為18.5g/L；菌株MHZ-0112-4和MHZ-0112-5谷氨酸的產(chǎn)量分別為23.4g/L和26.4g/L。在單獨(dú)利用強(qiáng)啟動(dòng)子Psod表達(dá)gdh基因，谷氨酸產(chǎn)量提高約1.8倍，單獨(dú)利用Ptuf啟動(dòng)子表達(dá)gltA基因?qū)S酶活增加了4倍，谷氨酸產(chǎn)量提高至30.8g/L；將兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行過表達(dá)后，谷氨酸產(chǎn)量繼續(xù)提高至35.5g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到約59％。CGMCC No.1194120151225
【IPC分類】C12R1/15, C12N15/74, C12N1/21, C12P13/14
【公開號(hào)】CN105695383
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610119402
【發(fā)明人】馬雯雯, 胡丹, 程江紅, 毛賢軍, 刁劉洋
【申請(qǐng)人】廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年3月2日