本發(fā)明屬于植物干細胞培養(yǎng)領域，尤其涉及一種富含植物甾醇大豆干細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：植物和人類的生活緊密相關(guān)，從衣、食、住、行各個方面都離不開植物，但其中最為重要的還是營養(yǎng)供給。從遠古時代，人類就意識到植物的價值，流傳至今的中草藥文化就是最珍貴的成果。近年來，植物的營養(yǎng)價值被各行各業(yè)的研究者發(fā)現(xiàn)，從烹制加工到植物提取再到組織培養(yǎng)，此領域的研究層面逐漸加深。但是為了適應復雜多變的環(huán)境、人為干擾等，植物不斷地調(diào)整自身器官的生長情況，導致不同時期，不同地域甚至是不同植株之間營養(yǎng)成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)均存在差異，導致各個領域?qū)ζ湎鄳拈_發(fā)與應用均受到限制。研究表明，植物干細胞的不斷自我更新以及極強的分化能力是植物能夠歷經(jīng)千年而不衰亡的奧秘，近些年逐漸受到重視。而如何成功培養(yǎng)植物干細胞確實是十分重要的研究方向，100多年來科學家一直投身于從植物中分化出植物干細胞的道路之中。植物干細胞技術(shù)已被認為是21世紀生物
技術(shù)領域：
最具競爭力的技術(shù)之一，從此引起化妝品、保健品等眾多領域的關(guān)注。概括而言，位于植物頂端分生組織和根尖分生組織的植物干細胞具有不斷自我更新，分化成許多成熟的細胞或組織的特點，可將其成功培養(yǎng)成完整的植株。植物甾醇比膽固醇更易形成膠束，降低膽固醇進入血液中的幾率，從一定程度上限制外源膽固醇的攝入量。根據(jù)文獻資料，每日植物甾醇攝入量為0.45g(折合植物甾醇酯0.73g)有降膽固醇的作用。每日攝入量為1g(折合植物甾醇酯1.6g)，降膽固醇作用明顯。世界眾多研究機構(gòu)也曾發(fā)出過相應聲明，例如，美國國家膽固醇教育項目建議：在特定人群的膳食中每日補充2g植物甾醇或甾烷醇酯可以降低血漿中LDL-C的水平，從而降低冠心病的發(fā)病風險；2000年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)就已經(jīng)將植物甾醇及甾醇酯列入一般公認安全的名單，批準添加植物甾醇或甾醇酯的產(chǎn)品可以使用“有益健康”標簽。2002年歐洲食品科學委員會通過了植物甾醇酯的安全性評估；2010年我國衛(wèi)生部批準植物甾醇酯可作為新資源食品食用。由此可見，植物甾醇已經(jīng)受到諸多國家的重視。現(xiàn)有獲取植物甾醇方法主要從植物油脫臭餾出物中提取精制，相應的提取方法主要有：溶劑萃取法、吸附法、溶劑結(jié)晶法、絡合法、超臨界流體萃取法、柱色譜法、分子蒸餾分離法及高速逆流色譜法等。為獲得高含量的植物甾醇，提高提取效率成為首要的入手點，近年來相應的研究與報道也層出不窮。獲得高含量植物甾醇的原料是提高植物甾醇產(chǎn)量的另一個關(guān)鍵方法，本發(fā)明旨在利用植物干細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)周期短、無污染、高純度、條件可控等優(yōu)勢，通過改變外界因素,培育出高植物甾醇含量的大豆干細胞培養(yǎng)物，供不同領域需求者使用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種富含植物甾醇的大豆干細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法主要利用植物干細胞培養(yǎng)技術(shù)，一方面通過采用高溫脅迫，誘導所培養(yǎng)大豆干細胞培養(yǎng)物合成植物甾醇，另一方面，通過增加穩(wěn)態(tài)磁場，增強合成植物甾醇關(guān)鍵酶活性，獲得高植物甾醇含量的大豆干細胞培養(yǎng)物。為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：一種富含植物甾醇的大豆干細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟：(1)將大豆種子用乙醇溶液浸泡，無菌水沖洗后，再用次氯酸鈉溶液浸泡，然后無菌水沖洗，獲得無菌大豆；(2)取上述無菌大豆的下胚軸，將其切成長度為1.5-2.5mm，獲取無菌大豆組織；(3)將獲得的無菌大豆組織，接種于誘導培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，獲得愈傷組織，其中，1g無菌大豆組織接種于25-35mL的誘導培養(yǎng)基；(4)將上述獲得的愈傷組織，接種于增殖培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，同時于第2天開始進行穩(wěn)態(tài)磁場干預，即可獲得富含植物甾醇的大豆干細胞培養(yǎng)物；所述誘導培養(yǎng)基為含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L檸檬酸銨和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.0-6.3；所述增殖培養(yǎng)基為含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.8-7.0。進一步地，上述方法中，所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為75-90％，次氯酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為2-10％。進一步地，所述誘導培養(yǎng)為暗培養(yǎng)，溫度為30-32℃，6-7天為一個培養(yǎng)周期，優(yōu)選培養(yǎng)2-3個培養(yǎng)周期。進一步地，所述增殖培養(yǎng)溫度為30-32℃，光照10-12h/d，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為110-130r/min，7天為一個培養(yǎng)周期，優(yōu)選培養(yǎng)2-3個培養(yǎng)周期。進一步地，在增殖培養(yǎng)中，穩(wěn)態(tài)磁場干預具體參數(shù)為每個培養(yǎng)周期中加載穩(wěn)態(tài)磁場5-6天，每天曝磁6-8h，強度為0.9-3T。如上述步驟所述，為成功獲取富含植物甾醇大豆干細胞培養(yǎng)物，第一步獲取分化能力強的組織細胞是首要任務，同時為保證后續(xù)操作順利進行，需對該植物細胞進行徹底的殺菌清潔。誘導培養(yǎng)時，特在MS培養(yǎng)基基礎上加入2,4-二氯苯氧乙酸、檸檬酸銨、萘乙酸，以促進細胞的分化；擴大培養(yǎng)中特使用增殖培養(yǎng)基，即在MS培養(yǎng)基基礎上加入2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、水解酪蛋白，以保證所培養(yǎng)大豆干細胞順利增殖。與此同時，培養(yǎng)過程中特采用高溫脅迫方法，誘導大豆干細胞合成植物甾醇，同時協(xié)同穩(wěn)態(tài)磁場處理，增強植物甾醇合成過程中△24-甾醇-C24-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，兩種物理方法相結(jié)合，使所培養(yǎng)大豆干細胞培養(yǎng)物中植物甾醇得到富集。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供一種富含植物甾醇的大豆干細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)方法，利用該方法可獲得安全無污染的富含植物甾醇的大豆干細胞培養(yǎng)物，培養(yǎng)周期短、安全高效，為植物甾醇的獲取提供了一種新途徑，可供各領域研究與應用。具體實施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明做進一步的說明。本領域技術(shù)人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1一種富含植物甾醇大豆干細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)技術(shù)及其制備方法，包括如下具體步驟：一、培養(yǎng)基配制1、誘導培養(yǎng)基：含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L檸檬酸銨和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.0-6.3；所述增殖培養(yǎng)基為2、增殖培養(yǎng)基：含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.8-7.0。二、獲取無菌大豆將大豆種子用75-90％的乙醇浸泡15min，無菌水洗凈；用2-10％的次氯酸鈉浸泡2-5min，無菌水洗凈；取上述無菌大豆下胚軸，將其切成長度為1.5-2.5mm。三、誘導培養(yǎng)取按照上述方法獲得的無菌大豆組織，放于以上所述誘導培養(yǎng)基中，于30-32℃條件下避光培養(yǎng)，按照1g樣品接種于25-35mL培養(yǎng)液的比例進行誘導，6-7天為一個周期，培養(yǎng)2-3個周期，獲得愈傷組織。四、高溫脅迫協(xié)同穩(wěn)態(tài)磁場誘導大豆干細胞培養(yǎng)物富集植物甾醇取按上述方法獲得的愈傷組織，將其接種在增殖培養(yǎng)基中，于30-32℃，光照10-12h/d條件下，進行搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為110-130r/min。從培養(yǎng)的第2天起加載穩(wěn)態(tài)磁場，每個周期(7天)加載5-6天，每天曝磁6-8h，強度為0.9-3T，培養(yǎng)2-3個周期，即可獲得富含植物甾醇的大豆干細胞培養(yǎng)物。植物甾醇測定一、植物甾醇提取準確稱取10g大豆或大豆干細胞培養(yǎng)物(大豆干細胞培養(yǎng)物使用前先作凍干處理)，將其粉碎過60目篩，以無水乙醇為提取液，按照料液比1:20，超聲波功率500W，提取溫度50℃，提取時間60min的工藝參數(shù)進行超聲波提取后，以4000r/min離心5分鐘，冷卻至室溫后真空抽濾，棄去沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容，得到植物甾醇粗提液。二、大豆甾醇含量的測定參照GB/T25223-2010甾醇總量測定方法測定甾醇含量，測定結(jié)果如下：名稱植物甾醇含量(mg/100g)本發(fā)明培育大豆干細胞培養(yǎng)物6025普通大豆310.63大豆干細胞培養(yǎng)物中植物甾醇含量為6025mg/100g，普通大豆中植物甾醇含量為310.63mg/100g，二者植物甾醇含量相差近20倍，而且大豆干細胞培養(yǎng)周期僅為普通大豆生長周期的1/3，可見本發(fā)明所述的大豆干細胞培養(yǎng)物不僅富集了高含量的植物甾醇，而且縮短了生長周期，極大降低了生產(chǎn)成本，具有重要的實際應用價值，可供各個領域研究與應用。顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。當前第1頁1 2 3