本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離液泡和觀察液泡膜上蛋白分布和運(yùn)動的方法。

背景技術(shù)：

以往的科學(xué)研究只是在大量分子的綜合平均效應(yīng)上進(jìn)行科學(xué)探索，而單分子技術(shù)打破這一群體平均化的限制，逐一地對單個(gè)分子進(jìn)行追蹤。利用單分子技術(shù)，人們可以實(shí)時(shí)地監(jiān)測并分析分子間相互作用的過程、構(gòu)象變化以及生化反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。單分子技術(shù)的運(yùn)用在生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)以及納米材料等科學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義，提供了一種全新的手段以助于研究一些亟待解決的前沿問題。

細(xì)胞內(nèi)很多至關(guān)重要的生命活動過程都是在細(xì)胞膜表面完成的，例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。在生物學(xué)研究中，單分子顯微成像技術(shù)顯得尤其重要。全內(nèi)反射熒光技術(shù)是當(dāng)今最靈敏的單分子顯微成像和檢測方法之一，可以僅激發(fā)深度在100nm～300nm薄層范圍內(nèi)的熒光基團(tuán)，探測單個(gè)熒光分子而不受其它層面的熒光信號的干擾，與其它光學(xué)切片成像技術(shù)相比其在Z軸上的分辨率獨(dú)具優(yōu)勢?；谶@個(gè)想法，科學(xué)家們發(fā)明了基于全內(nèi)反射的熒光顯微鏡—全內(nèi)反射熒光顯微鏡(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM)。已有的研究報(bào)道，可利用TIRFM觀察植物細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的運(yùn)動，但尚未將該技術(shù)擴(kuò)展到觀察植物細(xì)胞器膜上蛋白質(zhì)的運(yùn)動，原因在于觀察植物細(xì)胞器存在提取困難、固定困難等種種問題。

液泡是植物細(xì)胞所特有的細(xì)胞器，體積約占成熟植物細(xì)胞的90％，并具有單層液泡膜將其與細(xì)胞質(zhì)分開。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何分離液泡和觀察液泡。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種觀察植物液泡的方法。

本發(fā)明提供的觀察植物液泡的方法，包括如下步驟：取植物組織，分離獲得液泡，然后將所述液泡置于經(jīng)多聚賴氨酸處理的裝置上進(jìn)行觀察。

上述觀察植物液泡的方法中，所述觀察采用TIRFM顯微鏡進(jìn)行。

上述觀察植物液泡的方法中，所述“多聚賴氨酸處理”可為將所述裝置置于濃度為0.01mg/mL以上的多聚賴氨酸水溶液中浸泡15min以上。

上述觀察植物液泡的方法中，所述“多聚賴氨酸處理”具體可為將所述裝置置于濃度為0.01mg/mL的多聚賴氨酸水溶液中浸泡15min。

所述裝置可為載玻片。

上述觀察植物液泡的方法中，所述“多聚賴氨酸處理”在置于所述多聚賴氨酸水溶液中浸泡之前，還可依次經(jīng)過如下處理：酸液浸4h、水(如自來水)中浸泡2h和去離子水潤洗。所述酸液可由濃HCl和70％(體積百分比)乙醇水溶液按照體積比1：100混合而成。所述去離子水潤洗次數(shù)為2次，每次潤洗10-15s。

上述觀察植物液泡的方法中，所述“分離獲得液泡”的方法，依次可包括如下步驟：

(1)取植物組織，用酶解液進(jìn)行處理，獲得原生質(zhì)體；所述酶解液中可含有0.3-0.5M甘露醇、15-25mM MES、8-12mM KCl、10-30U/mL纖維素酶、10-100U/mL離析酶、8-12mM CaCl₂、0.0005-0.0015g/mLBSA和0.5-0.9μL/mLβ-巰基乙醇；

(2)裂解所述原生質(zhì)體，獲得液泡。

所述步驟(1)中，所述酶解液和所述植物組織的配比可為10-15mL：1g。

所述步驟(1)中，所述酶解液和所述植物組織的配比具體可為10mL：1g。

所述酶解液具體可為含有0.4M甘露醇、20mM MES、10mM KCl、15U/mL纖維素酶、50U/mL離析酶、10mM CaCl₂、0.001g/mLBSA和0.7μL/mLβ-巰基乙醇的水溶液，pH值為5.7-5.9。

所述步驟(1)中，所述植物組織可為z1)或z2)或z3)或z4)或z5)：z1)植物的葉片；z2)擬南芥的葉片；z3)擬南芥的蓮座片；z4)表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的擬南芥的葉片；z5)表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的擬南芥的蓮座片。

所述步驟(1)中還可包括如下步驟：進(jìn)行所述處理前，對所述植物組織進(jìn)行表面消毒。所述表面消毒的具體方法可為：用70-75％乙醇水溶液沖洗所述植物組織2-3次，每次沖洗10-15s。

所述步驟(1)中，所述處理的參數(shù)可為a1)或a2)：a1)避光、25-29℃、3-4h；a2)避光、25-29℃振蕩3-4h。所述a2)中，所述振蕩的參數(shù)可為搖速40-70rpm(如40rpm、50rpm、60rpm或70rpm)，旋轉(zhuǎn)半徑可為40-60mm(如40mm、50mm或60mm)。

所述步驟(1)中，所述處理的參數(shù)具體可為27℃振蕩4h，振蕩的參數(shù)具體可為搖速70rpm，旋轉(zhuǎn)半徑50mm。

所述步驟(1)中還可包括如下步驟a：完成所述處理后，收集原生質(zhì)體。

所述步驟a中，所述收集原生質(zhì)體的方法可為：過濾，收集濾液，然后將所述濾液進(jìn)行離心并收集沉淀甲，所述沉淀甲中含有原生質(zhì)體。

所述步驟a中，收集原生質(zhì)體的方法中的離心可為4-6℃離心15-20min，離心參數(shù)可為60-100g、brake1-4。所述步驟a中，收集原生質(zhì)體的方法中的離心具體可為4℃離心20min，離心參數(shù)具體可為80g、brake1。

所述過濾可使用篩子(如目數(shù)為150孔)、尼龍網(wǎng)或醫(yī)用紗布進(jìn)行。所述過濾具體可使用孔徑為100μm的尼龍網(wǎng)進(jìn)行。

所述步驟(1)中還可包括如下步驟b：完成步驟a后，取沉淀甲，使用洗滌液洗滌，然后離心并收集沉淀乙，所述沉淀乙中含有原生質(zhì)體；所述洗滌液中含有0.3-0.5M甘露醇和15-25mM MES。

所述洗滌液具體可為含0.4M甘露醇和20mM MES的水溶液。

所述步驟b中，洗滌的方法中的離心可為4-6℃離心15-20min，離心參數(shù)可為60-100g、brake1-4。所述步驟b中，洗滌的方法中的離心具體可為4℃離心20min，離心參數(shù)具體可為80g、brake1。

所述步驟(2)中還可包括如下步驟c：完成所述裂解后，離心并收集上清液，所述上清液中含有液泡。

所述步驟c中，裂解后的離心可為4-6℃離心1-10min，離心參數(shù)可為60-150g、brake1－4。所述步驟c中，裂解后的離心具體可為4℃離心5min，離心參數(shù)具體可為100g、brake1。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種從植物組織中分離液泡的方法。

本發(fā)明所提供的從植物組織中分離液泡的方法，依次可包括如下步驟：

(A)取植物組織，用酶解液進(jìn)行處理，獲得原生質(zhì)體；所述酶解液中可含有0.3-0.5M甘露醇、15-25mM MES、8-12mM KCl、10-30U/mL纖維素酶、10-100U/mL離析酶、8-12mM CaCl₂、0.0005-0.0015g/mLBSA和0.5-0.9μL/mLβ-巰基乙醇；

(B)裂解所述原生質(zhì)體，獲得液泡。

所述步驟(A)中，所述酶解液和所述植物組織的配比可為10-15mL：1g。

所述步驟(A)中，所述酶解液和所述植物組織的配比具體可為10mL：1g。

所述酶解液具體可為含有0.4M甘露醇、20mM MES、10mM KCl、15U/mL纖維素酶、50U/mL離析酶、10mM CaCl₂、0.001g/mLBSA和0.7μL/mLβ-巰基乙醇的水溶液，pH值為5.7-5.9。

所述步驟(A)中，所述植物組織可為z1)或z2)或z3)或z4)或z5)：z1)植物的葉片；z2)擬南芥的葉片；z3)擬南芥的蓮座片；z4)表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的擬南芥的葉片；z5)表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的擬南芥的蓮座片。

所述步驟(A)中還可包括如下步驟：進(jìn)行所述處理前，對所述植物組織進(jìn)行表面消毒。所述表面消毒的具體方法可為：用70-75％乙醇水溶液沖洗所述植物組織2-3次，每次沖洗10-15s。

所述步驟(A)中，所述處理的參數(shù)可為a1)或a2)：a1)避光、25-29℃、3-4h；a2)避光、25-29℃振蕩3-4h。所述a2)中，所述振蕩的參數(shù)可為搖速40-70rpm(如40rpm、50rpm、60rpm或70rpm)，旋轉(zhuǎn)半徑可為40-60mm(如40mm、50mm或60mm)。

所述步驟(A)中，所述處理的參數(shù)具體可為27℃振蕩4h，振蕩的參數(shù)具體可為搖速70rpm，旋轉(zhuǎn)半徑50mm。

所述步驟(A)中還可包括如下步驟d：完成所述處理后，收集原生質(zhì)體。

所述步驟d中，所述收集原生質(zhì)體的方法可為：過濾，收集濾液，然后將所述濾液進(jìn)行離心并收集沉淀甲，所述沉淀甲中含有原生質(zhì)體。

所述步驟d中，收集原生質(zhì)體的方法中的離心可為4-6℃離心15-20min，離心參數(shù)可為60-100g、brake1-4。所述步驟a中，收集原生質(zhì)體的方法中的離心具體可為4℃離心20min，離心參數(shù)具體可為80g、brake1。

所述過濾可使用篩子(如目數(shù)為150孔)、尼龍網(wǎng)或醫(yī)用紗布進(jìn)行。所述過濾具體可使用孔徑為100μm的尼龍網(wǎng)進(jìn)行。

所述步驟(A)中還可包括如下步驟e：完成步驟d后，取沉淀甲，洗滌。

所述步驟e中，所述洗滌的方法可為：取所述沉淀甲，使用洗滌液洗滌，然后離心并收集沉淀乙，所述沉淀乙中含有原生質(zhì)體；所述洗滌液中含有0.3-0.5M甘露醇和15-25mM MES。

所述洗滌液具體可為含0.4M甘露醇和20mM MES的水溶液。

所述步驟e中，洗滌的方法中的離心可為4-6℃離心15-20min，離心參數(shù)可為60-100g、brake1-4。所述步驟e中，洗滌的方法中的離心具體可為4℃離心20min，離心參數(shù)具體可為80g、brake1。

所述步驟(B)中還可包括如下步驟f：完成所述裂解后，離心并收集上清液，所述上清液中含有液泡。

所述步驟f中，裂解后的離心可為4-6℃離心1-10min，離心參數(shù)可為60-150g、brake1－4。所述步驟f中，裂解后的離心具體可為4℃離心5min，離心參數(shù)具體可為100g、brake1。

上述任一所述分離液泡的方法和上述任一所述觀察植物液泡的方法在觀察液泡膜上蛋白質(zhì)的運(yùn)動、觀察液泡膜上蛋白質(zhì)的分布、觀察液泡膜上蛋白質(zhì)的胞吞途徑或判斷待測蛋白是否在液泡膜上表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)具體可為HIR1-EGFP蛋白。所述HIR1-EGFP蛋白可由表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)。所述表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥記載在如下文獻(xiàn)中：Natalie Luhtala RP.Structure-Function Analysis of Rny1 in tRNA Cleavage and Growth Inhibition[J].Plos One，2012，7(7)：362-364。

上文中，所述植物組織的質(zhì)量以濕重計(jì)。

上文中，所述離心時(shí)使用的離心機(jī)可為Eppendorf公司產(chǎn)品，型號可為Centrifuge5810R。

上文中，所述纖維素酶可為纖維素酶R-10。所述纖維素酶R-10具體可為北京科創(chuàng)匯達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品。纖維素酶R-10的比活力可為1000U/g。纖維素酶R-10酶活力定義可為：纖維素酶R-10在25℃條件下，每分鐘催化1μmol纖維素轉(zhuǎn)化為多糖所需要的酶量為1U。

上文中，所述離析酶可為離析酶R-10。所述離析酶R-10具體可為北京科創(chuàng)匯達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品。離析酶R-10的比活力可為10000U/g。離析酶R-10酶活力定義可為：離析酶R-10在25℃條件下，每分鐘催化1μmol果膠轉(zhuǎn)化為多糖所需要的酶量為1U。

實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所提供的方法可清晰的觀察液泡膜上蛋白質(zhì)的運(yùn)動和觀察液泡膜上蛋白質(zhì)的分布，可見，采用本發(fā)明所提供的方法分離的液泡是具有生理活性的液泡，其液泡膜上蛋白質(zhì)也是具有生理活性的。因此，本發(fā)明所提供的方法在液泡的分離及觀察中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3為實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

酶解液：將含甘露醇、MES和KCl的水溶液、纖維素酶R-10和離析酶R-10混合均勻，55℃水浴10min，冷卻至室溫后，再加入CaCl₂、BSA和β-巰基乙醇，用0.22μm除菌過濾器過濾滅菌，調(diào)節(jié)pH值至5.7，得到酶解液；酶解液中，甘露醇、MES、KCl、纖維素酶R-10、離析酶R-10、CaCl₂、BSA和β-巰基乙醇濃度依次為0.4M、20mM、10mM、0.015g/mL(15U/mL)、0.005g/mL(50U/mL)、10mM、0.001g/mL和0.7μL/mL；其中纖維素酶R-10和離析酶R-10均為北京科創(chuàng)匯達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品。

纖維素酶R-10的比活力為1000U/g。

纖維素酶R-10酶活力定義為：纖維素酶R-10在25℃條件下，每分鐘催化1μmol纖維素轉(zhuǎn)化為多糖所需要的酶量為1U。

離析酶R-10的比活力為10000U/g。

離析酶R-10酶活力定義為：離析酶R-10在25℃條件下，每分鐘催化1μmol果膠轉(zhuǎn)化為多糖所需要的酶量為1U。

洗滌液：含0.4M甘露醇和20mM MES的水溶液。

裂解液(參考如下文獻(xiàn)：Maretzki A，Thom M.Vacuoles:Isolation，Purification，and Uses[M].Plant Protoplasts and Genetic Engineering II.Springer Berlin Heidelberg，1989：459-479.)：向去離子水中加入1.822g甘露醇、0.15gTris和1mL濃度為0.5M的EDTA水溶液，然后用去離子水定容至50mL，用1mol/L HCl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值至7.5。

載玻片的規(guī)格為25.4×76.2mm，約1mm－1.2mm厚。

VA-TIRFM專用蓋玻片為BRAND公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為Cat.No.4708 20；規(guī)格為24×60mm。

酸液：由濃HCl和70％(體積百分比)乙醇水溶液按照體積比1：100混合而成。

下述實(shí)施例中的擬南芥為表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥(記載在如下文獻(xiàn)中：Natalie Luhtala RP.Structure-Function Analysis of Rny1 in tRNA Cleavage and Growth Inhibition[J].Plos One，2012，7(7)：362-364)。表達(dá)HIR1-EGFP蛋白的擬南芥具有GFP熒光分子標(biāo)簽，綠色熒光蛋白GFP的激發(fā)光一般在480nm左右。

中性紅溶液：向去離子水中加入0.1g中性紅、200μL 1％(體積百分比)乙酸水溶液和50μL氯仿，然后用去離子水定容至100mL。

下述實(shí)施例中離心時(shí)使用的離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品，型號為Centrifuge 5810R。

下述實(shí)施例中Tirfm顯微鏡的配置具體如下：成像系統(tǒng)：Olympus公司的IX-83型倒置顯微鏡，數(shù)值孔徑NA1.45的100倍油鏡，熒光信號的采集有2臺Andor公司的電子倍增電荷耦合器(Electron-Multiplying CCD)相機(jī)和控制軟件MetaMorph采集。Andor相機(jī)的像素大小是87×87nm。顯微鏡配備有4個(gè)波長的激光器，分別是405nm、488nm、561nm、647nm。

實(shí)施例1、擬南芥蓮座片液泡的分離和熒光顯微鏡檢測

1、取生長至4周的擬南芥幼苗的蓮座片(寬約1cm)，用70％(體積百分比)的乙醇水溶液沖洗葉片表面3次，每次15s。

2、完成步驟1后，取蓮座片，用刀片去除葉前緣和葉柄，將其切成1mm的寬長條(總質(zhì)量約1g)并置于玻璃培養(yǎng)皿；然后加入10mL酶解液，用錫紙避光(避光的目的有兩個(gè)，一是去除細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體，長時(shí)間暴露易受光損傷，二是保證原生質(zhì)體不進(jìn)行光反應(yīng))，27℃振蕩(搖速為70rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為50mm)4h。

3、完成步驟2后，用尼龍網(wǎng)(孔徑為100μm)過濾，獲得濾液。

4、完成步驟3后，取濾液，4℃離心(離心參數(shù)為80g，brake＝1)20min，收集沉淀甲(沉淀甲即為原生質(zhì)體)。

5、完成步驟4后，取沉淀甲，加入30mL洗滌液重懸，然后4℃離心(離心參數(shù)為80g，brake＝1)20min，收集沉淀乙(沉淀乙即為純化的原生質(zhì)體)。

6、完成步驟5后，取純化的原生質(zhì)體，加入15mL裂解液，先用100mm×0.2mm長針頭輕柔吹打，再用吸管輕柔吹打2min，得到液泡初提液。

7、完成步驟6后，取液泡初提液，4℃離心(離心參數(shù)為100g，brake＝1)5min，收集上清液(上清液即為液泡純化液)。

液泡純化液中含有擬南芥蓮座片液泡。

取液泡純化液，采用Leica DM 2500熒光顯微鏡觀察(選擇40X物鏡；調(diào)節(jié)參數(shù)為：曝光時(shí)間15.8s，增益3.7倍、飽和度1.44、伽馬1.7；選擇藍(lán)光激發(fā)波長450-490nm)。結(jié)果表明(見圖1)，可以利用Leica DM 2500熒光顯微鏡觀察到液泡膜上有微弱熒光，可見，擬南芥蓮座片液泡，其液泡膜上HIR1-EGFP蛋白的具有生理活性。

實(shí)施例2、液泡膜上HIR1-EGFP蛋白的TIRFM顯微鏡觀察

1、取載玻片，先置于酸液中浸泡4h，然后在自來水浸泡2h，再用去離子水潤洗2次(每次潤洗15s)，最后置于濃度為0.01mg/mL的多聚賴氨酸水溶液中浸泡15min。

2、完成步驟1后，取載玻片，置于超凈工作臺中紫外照射風(fēng)干，獲得多聚賴氨酸處理后的載玻片。

3、完成步驟2后，取步驟一中7獲得液泡純化液，滴加至多聚賴氨酸處理后的載玻片，用透明膠布粘貼玻片兩邊(避免粘附劑處理的玻片和蓋玻片互相粘附，以致壓碎液泡)，然后覆蓋VA-TIRFM專用蓋玻片，置于TIRFM顯微鏡下(設(shè)定“Acquisition Channel”為“PM1394Cam01-Monochrome 16-bit”。選擇488nm激光器，波長為530nm，設(shè)定激光強(qiáng)度為20％)，選擇曝光時(shí)間200ms、頻率10Hz、光學(xué)增益300倍，通過EMCCD記錄并采集連續(xù)圖像。

結(jié)果表明(見圖2)，在TIRFM顯微鏡下可觀察到液泡膜上HIR1-EGFP蛋白的快速運(yùn)動。

實(shí)施例3、擬南芥蓮座葉液泡的分離過程

1、同實(shí)施例1步驟1。

2、同實(shí)施例1步驟2。

3、同實(shí)施例1步驟3。

4、同實(shí)施例1步驟4。

5、同實(shí)施例1步驟5。

6、完成步驟5后，取純化的原生質(zhì)體，加入15mL裂解液和75μL中性紅溶液，先用100mm×0.2mm長針頭輕柔吹打，再用吸管輕柔吹打2min，然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

結(jié)果表明(圖3中A)，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到原生質(zhì)體釋放液泡的過程，即葉綠體向質(zhì)膜一側(cè)遷移，留下相對應(yīng)質(zhì)膜的另一側(cè)無葉綠體存在，然后液泡從質(zhì)膜的缺口中緩慢釋出,在釋放過程中會暫時(shí)被拉長變形,一但完全脫出后又恢復(fù)為球狀。

7、完成步驟6后，4℃離心(離心參數(shù)為100g，brake＝1)5min，收集上清液并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

結(jié)果表明(圖3中B)，經(jīng)離心除去膜碎片和未裂解的原生質(zhì)體，最終可見純化的液泡。

上述結(jié)果表明，實(shí)施例1中分離的擬南芥蓮座片液泡是具有生理活性的液泡。