專利名稱：利用Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因培育抗病轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因在培育抗 病轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于植物具有不能移動(dòng)的性質(zhì)，其在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展出各種機(jī)制，以自身生化和 生理調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)和應(yīng)對(duì)各種環(huán)境和脅迫。其中，無(wú)論在鹽生植物還是甜土植物中，都保守 存在著液泡區(qū)隔化鈉離子的能力；該過(guò)程包括通過(guò)液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將胞 質(zhì)中的鈉離子區(qū)隔化進(jìn)入液泡，從而減少有毒的鈉離子對(duì)胞質(zhì)中各種酶的毒害(Blumwald E(2000)Sodium transport and salt tolerance in plants. Curr Opin Cell Biol. 12 431-434)。迄今為止，研究人員從許多物種中克隆了液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基 因，例如已經(jīng)從擬南芥(AtNHXl 和 AtNHX2) (Gaxiola RA, Rao R, Sherman A, Grisafi P, Alper SL, Fink GR(1999)The Arabidopsis thaiiana proton transporters, AtNhxland Avpl, can function in cation detoxification in yeast. P Natl Acad Sci USA 96:1480-1485)、小麥(TaNHXl 禾口 TaNHX2) (Brini F, Hanin Μ, Mezghani I， Berkowitz GA,Masmoudi K (2007)Overexpression of wheat Na+/H+ antiporter TNHXland ^-pyrophosphatase TVPlimprove salt—and drought-stress tolerance in Arabidopsis thaliaha plants. J Exp Bot. 58 :301_308)、/K稻(OsNHXl)(Fukuda A,Nakamura A,Tanaka Y (1999)Molecular cloning and expression of the Na./H+exchanger gene in Oryza sativa. BBA-GeneStruct Exp 1446 149-155)和大豆(GmNHXl)等物種中克隆出 NHXl 基 因(Li WYF，Wong FL, Tsai SN, Phang TH, Shao GH，Lam HM(2006) Tonoplast-Iocated GmCLCland GmNHXlfrom soybean enhance NaCl tolerance in transgenic bright yellow (BY)-2cells. Plant Cell and Environ 29:1122—1137)。在TAIRftittp://www, arabidopsis. org)網(wǎng)站上，我們對(duì)擬南芥的 AtNHXl 進(jìn)行考 察，發(fā)現(xiàn)擬南芥的NHXl基因可以被非生物脅迫包括鹽，滲透，氧化脅迫所誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)； 同時(shí)也可以被丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)和灰霉病(Botrytis cinerea)等生 物脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。這些證據(jù)說(shuō)明NHXl積極響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)。近年來(lái)， 對(duì)NHXl基因在提高植物抗鹽性方面的功能研究已經(jīng)開展得很深入。在擬南芥(Apse MP, Aharon GS，Snedden WA,Blumwald E (1999)Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiportor in Arabidopsis. Science 285 :1256-1258)、番前 (Zhang HX, BlumwaldE(2001)Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nat Biotechnol 19 :765_768)和多年生黑麥草 (Wu YY, Chen QJ, Chen M，Chen J，Wang XC (2005) Salt-tolerant transgenic perennial ryegrass (Lolium perenne L.)obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated
3transformation of the vacuolar Na+Afantiporter gene. Plant Sci 169:65-73)中都已 經(jīng)研究證明過(guò)表達(dá)液泡膜上的NHXl基因可以明顯提高植株的抗鹽性。同時(shí)，研究也證明 植物的NHXl基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞離子平衡和胞質(zhì)pH的重要作用(SunJ，Chen S,Dai S, Wang R, Li N, Shen X, Zhou X，Lu C, Zheng X，Hu Ζ, Zhang Ζ, Song J, Xu Y(2008)NaCl-Induced Alternat ions of Cel lular and Tissue Ion Fluxes in Roots of Salt-Resistant and Salt-Sensitive Poplar Species. Plant Physiol 149:1141—1153)。盡管許多報(bào)道都證明植物中NHXl具有抗鹽功能，但很少研究關(guān)注NHXl基因的其 他功能，特別是該基因在生物脅迫中所起的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因在培育抗病轉(zhuǎn)基因植 物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因可以用來(lái)培育抗病轉(zhuǎn)基因植物， 所述Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如GeneBank號(hào)AAN08157所示。所述編碼基因的核苷酸序列如Genbank號(hào)AY131235所示。所述抗病轉(zhuǎn)基因植物為抗細(xì)菌性病害和/或真菌性病害的轉(zhuǎn)基因植物。所述細(xì)菌性病害為野火病；所述真菌性病害為黑脛病。所述植物為煙草。本發(fā)明的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因還可用來(lái)培育抗病和抗鹽轉(zhuǎn)基因植 物。所述Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如Genbank號(hào)AAN08157所示；所述編碼基 因的核苷酸序列如Genbank號(hào)AY131235所示。本發(fā)明的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因還可用來(lái)培育抗氧化脅迫轉(zhuǎn)基因植 物。本發(fā)明的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因還可用來(lái)培育具系統(tǒng)獲得性抗性的 轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，與野生型和轉(zhuǎn)空載體植株相比，轉(zhuǎn)SeNHXl基因煙草除了抗鹽 性得到增強(qiáng)，其抗病性也得到提高，并且抗氧化酶活性更高，其系統(tǒng)獲得性抗性的標(biāo)志基因 O3R基因)的表達(dá)量更多。


圖1為NaCl脅迫對(duì)種子萌發(fā)、地上部分干重和K+/Na+的影響圖。圖2為H2O2誘導(dǎo)煙草葉片細(xì)胞死亡檢測(cè)圖。圖3為轉(zhuǎn)SeNHXl基因煙草對(duì)野火病的抗性分析圖。圖4為轉(zhuǎn)SeNHXl基因煙草對(duì)黑脛病的抗性分析圖。圖5為測(cè)定轉(zhuǎn)基因TSll株系和空載體植株在接菌后0、12、24和36小時(shí)的抗氧化 反應(yīng)圖。圖6為將轉(zhuǎn)基因TSll株系和空載體株系中PRla(a)和Gnsl (b)基因在接菌后0， 6，12，18，24和36小時(shí)進(jìn)行表達(dá)模式分析。
圖7為轉(zhuǎn)基因、野生型和空載體煙草在不同濃度水楊酸下萌發(fā)。其中，圖1-圖7中標(biāo)準(zhǔn)誤差線上相同的字母表示在P < 0. 05情況下統(tǒng)計(jì)分析沒
有顯著性差異。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中，所述百分含量如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1.轉(zhuǎn)基因煙草的抗性實(shí)驗(yàn)一、植物材料的獲得1、獲得野生型煙草、空載體煙草和轉(zhuǎn)基因煙草植物材料野生型煙草品種‘威斯康辛38，(Nicotiana tabacum cv ‘Wisconsin 38，)(中國(guó) 農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草種資資源庫(kù)購(gòu)買)，用WT表示。轉(zhuǎn)基因煙草通過(guò)農(nóng)桿菌葉盤法將Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因SeNHXl轉(zhuǎn)化 野生型煙草‘威斯康辛 38，( “W38”)獲得(Zhou SF, Chen XY, Zhang XG, Li YX(2008) Improved salt tolerance in tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH and a vacuolar Na./H+antiporter gene SeNHX1. Biotechnol Lett 30 =369-376)。其中，SeNHXl基因是以下述引物1和2為引物，用鹽角草的RNA合成的第一 鏈cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增出核苷酸序列如Genbank號(hào)為AY131235的第301-2200位的編 碼基因，該編碼基因編碼氨基酸序列如Genbank號(hào)為AAN08157所示的蛋白。引物 1:5' -TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC-3 ’；引物 2 5 ‘ -GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT-3 ‘。擴(kuò)增得到的SeNHXl基因插入含35S啟動(dòng)子的pBI 121的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建了 PBI121-35S: SeNHXl基因表達(dá)載體，測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤后，將載體成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌 株。隨后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，對(duì)“W38”的葉盤組織進(jìn)行菌液侵染轉(zhuǎn)化，侵染后 的葉盤放置于含有卡那霉素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。通過(guò)卡那霉素的篩選，將具有抗性的煙 草再生苗轉(zhuǎn)移到溫室培養(yǎng)，并對(duì)再生苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，最終得到11株轉(zhuǎn)化陽(yáng)性苗，然后隨機(jī) 從11株陽(yáng)性苗中選取5株，進(jìn)行Southern和Northern分析；并通過(guò)雜交結(jié)果，選擇了 TO 代SeNHXl基因能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)、并單拷貝插入基因組的T1、T11和Τ15株系。在進(jìn)行Tl代轉(zhuǎn) 基因煙草功能鑒定時(shí)，我們對(duì)這三個(gè)株系使用TS1、TS11和TS15編號(hào)以區(qū)別TO代煙草?？蛰d體植株是轉(zhuǎn)pBI121空表達(dá)載體的Tl代煙草植株，用pBI表示。2、植物材料的培養(yǎng)野生型種子消毒后播于MS培養(yǎng)基上，而SeNHXl轉(zhuǎn)基因和空載體植株種子播在含 有150mg πιΓ1卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。兩周之后，將有活力的野生型和存活的 卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因萌發(fā)苗轉(zhuǎn)移到溫室，種植在含有蛭石、泥炭和腐殖質(zhì)(1 1 1;體積 比)的塑料盆中。溫室條件控制為溫度白天為23-27°C，夜間為18-22°C ；每天光照16小 時(shí)；相對(duì)濕度50士 10%。苗期每周澆l/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液一次。二、煙草的抗性實(shí)驗(yàn)
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1、抗鹽性實(shí)驗(yàn)將野生型、由TO代轉(zhuǎn)基因和空載體植株所結(jié)的種子播于含有200mmol/L (mM)NaCl 的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)。同時(shí)，以不含NaCl的MS培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。植物培養(yǎng)如上所述。移苗后30天，每一周用含有200mM NaCl的l/^Hoagland營(yíng) 養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。六周后，選擇頂部完全展開的葉片來(lái)測(cè)定Na+和K+含量。另外，生物量減少 率的計(jì)算選用以下公式減少率(％ ) = [l-(NaCl處理后地上部分的干重/未處理地上部 ^>〒i)]X100%。卞艮ig (Alian A, Altman A, Heuer B(2000)Genotypic difference in salinity and water stress tolerance of fresh market tomato cultivars. Plant Sci 152 59-65)的方法利用火焰分光光度計(jì)(Corning Ltd, Essex, England)進(jìn)行葉片Na+和 K+含量測(cè)定?？果}性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，其中(a)是在200mM NaCl下種子萌發(fā)的結(jié)果；(b) 200mM NaCl處理6周后對(duì)轉(zhuǎn)基因、野生型和空載體植株進(jìn)行地上部分生物量的測(cè)定；(c) 200mM NaCl處理6周后，對(duì)轉(zhuǎn)基因、野生型和空載體植株進(jìn)行K+/Na+比分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，萌發(fā)試驗(yàn)2周時(shí)，萌發(fā)結(jié)果如圖Ia所示，轉(zhuǎn)基因株系的種子比對(duì)照 表現(xiàn)出更高的萌發(fā)率。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，煙草幼苗在200mM NaCl下脅迫6周，野生型和空 載體植株比轉(zhuǎn)基因株系的干重有更顯著減少(圖lb)。同時(shí)，在受鹽脅迫情況下，轉(zhuǎn)基因株 系表現(xiàn)出更高的K+/Na+比，例如野生型和空載體植株K+/Na+比為0. 7左右，而TSl株系的 K+/Na+比為0. 96，TSll為1. 01，TS15為0. 97 (圖Ic)。所有這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)SeNHXl基因 煙草比野生型和空載體植株表現(xiàn)出更高的NaCl耐受性。2、H2O2誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)所用植株與上述抗鹽性實(shí)驗(yàn)中所用株系相同，選取從頂部往下充分展開的 第三片葉進(jìn)行H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡測(cè)定。葉片剪成IcmX Icm大小，先真空滲透10分鐘，然 后分別在不同濃度的H202 (0、l、10和IOOmM)中浸泡4小時(shí)和8小時(shí)。另外，選取各個(gè)葉片 病斑附近的區(qū)域進(jìn)行病害引起的細(xì)胞死亡分析。細(xì)胞死亡用伊文斯藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定(Harding SA,Roberts DM(1998)Incompatible pathogen infection results in enhanced reactive oxygen and cell death responses in transgenic tobacco expressing a hyperactive mutant calmodulin. Planta 206 :253_258)。按照文獻(xiàn)中所述用吸光率 A600/A680 來(lái)衡量， 死亡倍數(shù)統(tǒng)計(jì)由各個(gè)時(shí)期的吸光率與0小時(shí)的吸光率相比得到。結(jié)果見圖2，其中(a)是葉片組織塊在不同濃度的H2O2 (0，1，10和IOOmM)中浸泡4 小時(shí)的結(jié)果圖；(b)是葉片組織塊在不同濃度的H2O2 (0，1，10和IOOmM)中浸泡8小時(shí)的結(jié) 果圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，在IOmM和IOOmM H2O2處理4小時(shí)后，轉(zhuǎn)基因植株比野生型和空載體 植株表現(xiàn)出更少的葉片細(xì)胞死亡(圖2a)。相似的，在ImMUOmM和IOOmM H2O2中浸泡處理 8小時(shí)后，野生型和空載體植株比轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更多葉片細(xì)胞死亡(圖2b)。這些結(jié)果 說(shuō)明轉(zhuǎn)SeNHXl基因煙草抗氧化脅迫能力提高了。3、野火病病菌侵染參考(GuoZJ,Chen XJ, Wu XL, Ling JQ, Xu P (2004) Overexpression of the AP2/ EREBP transcription factor 0PBP1 enhances disease resistance and salt tolerance in tobacco. Plant Mol Biol 55 :607_618)提供的方法，通過(guò)無(wú)頭塑料注射器將含有 Bf (Pseudomonas syringae pv tabaci) ( _ 15 胃禾中 呆胃中 (American TypeCulture Collection, (ATCC)又稱美國(guó)模式菌種收集中心)保藏號(hào)11527)的IOmMMgCl2 懸浮液(病菌終濃度是107CFU/ml)注射進(jìn)轉(zhuǎn)基因、野生型和空載體植株的離體葉片。其 中，以注射IOmM MgClpK溶液的葉片組織作為對(duì)照。侵染6天后，取侵染部位附近的葉片 組織進(jìn)行細(xì)菌生長(zhǎng)量測(cè)定。用MgCl2對(duì)葉盤組織進(jìn)行研磨和稀釋，并涂板于KB培養(yǎng)基(蛋 白胨20g Γ1，無(wú)水氯化鎂1.4g Γ1，無(wú)水硫酸鉀IOg Γ1，瓊脂15g Γ1，甘油IOml Γ1)上。 (Bertoni G, Mills D(1987)A simple method to monitor growth of bacterial-populations in leaf tissue. Phytopathology 77 832-835) W^feiiifIlJ 定，結(jié)果用Iogltl (CFU cm"2)來(lái)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果如圖3所示，在注射MgCl2的對(duì)照組中，轉(zhuǎn)基因、野生型和空載 體植株都具有相似的菌斑數(shù)目；但在注射病菌的實(shí)驗(yàn)組中，我們可以清楚地看到野生型和 空載體植株比轉(zhuǎn)基因株系呈現(xiàn)出更多的菌斑數(shù)目。結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)SeNHXl基因煙草對(duì)野火病 的抗性增強(qiáng)了。4、黑脛病病菌侵染及分析1)黑脛病病菌侵染選取煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica var. hicotianae)O 號(hào)生理小種 (ATCC保藏號(hào)13611)，菌種用PDA固體培養(yǎng)基(土豆200g Γ1 ；蔗糖20g Γ1 ；瓊脂15g Γ1 ； PH 6.5)培養(yǎng)并保存。黑脛病菌侵染葉片方法如文獻(xiàn)(Guo ZJ, Chen XJ, Wu XL, Ling JQ, Xu P (2004)Overexpression of the AP2/EREBP transcription factor OPBP lenhances disease resistance and salt tolerance in tobacco. Plant Mol Biol55 :607_618)所 示，當(dāng)病菌長(zhǎng)滿培養(yǎng)基平板的時(shí)候，用塑料取孔器從平板上取等面積的菌塊用于接菌。選擇 煙草頂部往下的第三片葉進(jìn)行離體接種試驗(yàn)，并在葉脈兩側(cè)各用牙簽對(duì)稱扎2個(gè)孔。菌斑 塊接種于葉脈右側(cè)兩個(gè)傷口，不接種的葉脈左側(cè)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。接種葉片培養(yǎng)在墊著濕潤(rùn) 濾紙的平板中，放于溫度28士2°C，16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗的培養(yǎng)室內(nèi)。2)植物感病情況對(duì)接菌后0，24，36和48小時(shí)的葉片進(jìn)行拍照，然后測(cè)量病斑直徑，每個(gè)數(shù)值都是 通過(guò)20個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，并按照步驟2中H2O2誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)提供的方法進(jìn)行細(xì)胞死亡分析，實(shí) 驗(yàn)重復(fù)5次。如圖4a(hpi表示病菌接種后的小時(shí)數(shù))所示，在所有侵染時(shí)間內(nèi)，葉片的對(duì)照部 位(葉脈左側(cè)無(wú)接種的傷口)都沒有發(fā)病的跡象。如圖4a和圖4b所示，在接種黑脛病的 部位，野生型和空載體植株在接菌24小時(shí)后都出現(xiàn)了病斑；36小時(shí)后病斑擴(kuò)散迅速；到48 小時(shí)時(shí)，病菌已經(jīng)大面積的爆發(fā)，呈現(xiàn)大面積的組織壞死。然而，轉(zhuǎn)基因煙草在接菌后的前 24小時(shí)，沒有出現(xiàn)明顯的病斑；同時(shí)，在接菌后36和48小時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株比野生型和空載 體植株表現(xiàn)出更緩慢的病程發(fā)展。細(xì)胞死亡倍數(shù)的結(jié)果如圖4c所示，在接菌36小時(shí)以內(nèi)，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型和空 載體植株表現(xiàn)出更少的細(xì)胞死亡。這些結(jié)果都說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)黑脛病的抗性增強(qiáng)了。3)黑脛病誘導(dǎo)的氧化傷害檢測(cè)為了更深入闡述SeNHXl在植物抗病中的作用，選取TSll轉(zhuǎn)基因株系和空載體植 株，來(lái)考察轉(zhuǎn)SeNHXl基因煙草是否可以緩解由黑脛病病菌侵染而引起的氧化傷害。
DAB 染色首先對(duì)轉(zhuǎn)基因TSll株系和空載體株系在不同接種時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行DAB染色，方法參 照 Hernandez JA, Rubio Μ, Olmos Ε, Ros-Barcelo A, Martinez-Gomez P (2004)Oxidative stress induced by long-term plum pox virus infection in peach(Prunus persica). Physiol Plantarum 122 :486_495的方法進(jìn)行，染色圖片見圖5a(hpi表示病菌接種后的小 時(shí)數(shù))，然后進(jìn)行DAB染色斑的直徑測(cè)量，DAB染色斑直徑倍數(shù)(圖5b)通過(guò)比染色前病斑 直徑獲得，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。從圖5a和圖5b發(fā)現(xiàn)，在接菌后24和36小時(shí)，空載體植株比轉(zhuǎn)基因株系在病菌 侵染部位附近呈現(xiàn)出更大面積的染色褐斑，說(shuō)明在病菌侵染后，空載體植株產(chǎn)生了更多的 H2O2。CAT和POD酶活分析對(duì)轉(zhuǎn)基因TSll和空載體株系CAT和POD酶活進(jìn)行分析，酶液提取所有步驟都 在4°C條件下完成。過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的酶活性根據(jù)(Rao MV, Paliyath G, Ormrod DP(1996)Ultraviolet-B-and ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 110:125—136 禾口 Wang YS, Tian SP, Xu Y, Qin GZ, Yao HJ (2004) Changes in the activities of pro-and anti-oxidant enzymes in peach fruit inoculated with Cryptococcus laurentii or Penicillium expansum at Oor 20°C . Postharvest Biol Tec 34:21—28)的方法進(jìn)行測(cè) 定。酶活比率通過(guò)比較O小時(shí)的酶活得到。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。結(jié)果如圖5c所示，轉(zhuǎn)基因煙草CAT活性在所有侵染的時(shí)間內(nèi)都比空載體植株的酶 活要高；同樣，圖5d顯示出，比較于CAT活性，轉(zhuǎn)基因植株的POD活性在接菌后12小時(shí)比對(duì) 照酶活也有顯著提高。這些結(jié)果表明在受到病菌侵染后，轉(zhuǎn)基因植株清除病害引起的氧化 傷害能力增強(qiáng)了。4)系統(tǒng)獲得性抗性的標(biāo)志基因的表達(dá)量分析許多研究普遍認(rèn)為PR-I (PRla)和PR_2 (Gnsl)是系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的標(biāo)志基 因(Yasuda M(2007)Regulation mechanisms of systemic acquired resistance induced by plant activators. J Pestic Sci 32 :281_282)。PRla和Gnsl (GenBank序列號(hào)為 X06361 和EU867448)分別編碼病程相關(guān)蛋白I3Rla和β _1，3_葡聚糖酶。本發(fā)明也對(duì)空載體和TSii株系進(jìn)行接菌后ra基因表達(dá)量的考察。接種黑脛病后 0，6，12，18，24和36小時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因TSll株系和空載體株系各選擇5片葉片，進(jìn)行RT-PCR 分析。對(duì)病斑周圍的組織塊進(jìn)行RNA的提取，并混合組成一個(gè)RNA池。用Promega的MLV 反轉(zhuǎn)錄酶和相應(yīng)操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)使用I3Rla和Gnsl特異引物(PRla上游 5，TTG CCT TCA TTT CTT CTT GTC TC 3，，下游5’ CCT CCA TTG TTA CAC TGA ACC CT 3，； Gnsl 上游:5，GCC CTG TCA CTGGCA CAT CTT ACC T 3，，下游:5，GTT GTT CTC ATC AAA CAT GGC AAA T 3’)，并進(jìn)行24，28和32三個(gè)不同循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增重復(fù)。Actin基因在煙草中的 表達(dá)量作為內(nèi)參用于配平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果如圖6所示，圖中的相對(duì)表達(dá)量是通過(guò)與O小時(shí)的表達(dá)量比較 得到；Hpi，表示病菌接種后的小時(shí)數(shù)。在接菌后第24小時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草比空載體植株有更 高的I3Rla基因表達(dá)；類似地，在接菌后第36小時(shí)之前，轉(zhuǎn)基因株系中Gnsl基因的表達(dá)量比
8對(duì)照基因表達(dá)量都有顯著提高。這些結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)基因植株I3R基因(raia和Gnsl)在植株 受到病菌侵染后呈現(xiàn)更高的表達(dá)量，暗示了 SeNHXl可能通過(guò)參與SAR途徑來(lái)調(diào)節(jié)I3R基因 表達(dá)。5)機(jī)理研究將轉(zhuǎn)基因、野生型和空載體TO代種子播于含有不同濃度的SA(水楊酸)的MS平 板上，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果如圖7所示，(a)是萌發(fā)照片，(b)是萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)圖。在不含 SA或者低濃度SA (0. OlmM)的MS平板上，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照都表現(xiàn)出相似的萌發(fā)率(圖7a和 圖7b)。在0. 1和0.5mM SA濃度下，大部分野生型和空載體植株種子都不能正常萌發(fā)，而 TSll株系表現(xiàn)出90%和80%的萌發(fā)率(圖7b)。相似的，如圖7b所示，在0. 1和0. 5mM SA 濃度下，TSl和TS15株系也比野生型和空載體植株表現(xiàn)出更高的種子萌發(fā)率。這些結(jié)果說(shuō) 明，轉(zhuǎn)基因煙草在高濃度水楊酸下具有更高的種子萌發(fā)率。已有研究表明，H2O2作為次級(jí)信號(hào)分子參與誘導(dǎo)ra基因的表達(dá)和起始SAR反 應(yīng)(Kvaratskhelia M, George SJ, Thorneley RN(1997)Salicylic acid is a reducing substrate and notan effective inhibitor of ascorbate peroxidase. J Biol Chem 272:20998-21001)。同時(shí)，許多證據(jù)也顯示，抗氧化酶活性的提高(為消除H202)與I3R 基因表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)生在SA誘導(dǎo)的SAR反應(yīng)中(Ananieva EA, Christov KN, Popova LP(2004)Exogenous treatment with Salicylic acid leads to increased antioxidant capacity in leaves of barley plants exposed to Paraquat. J Plant Physiol 161 319-328)。如圖6顯示，轉(zhuǎn)基因植株在受到病菌侵染后，兩個(gè)SAR標(biāo)志基因都比對(duì)照有更 高的表達(dá)量?，F(xiàn)在也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與野生型和空載體植株對(duì)水楊酸有不同程度的響應(yīng) (圖7)。此外，本文研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株受病菌侵染后CAT和POD活性的增加、H2O2 濃度的減少與I3R基因表達(dá)增強(qiáng)相偶聯(lián)，這與前人報(bào)道的SAR反應(yīng)結(jié)果一致(Chan Z，Wang Q，Xu X，Meng X，Qin G，B Li，S Tian(2008)Functions of defense-related proteins and dehydrogenases in resistance response induced by salicylic acid in sweet cherry fruits at different maturity stages. Proteomics 8:4791-4807 禾口 Xu XB, Tian SP(2008)Salicylic acid alleviated pathogen-induced oxidative stress in harvested sweet cherry fruit. Postharvest Biol Tec 49 :379_385)。這些結(jié)論表明， SeNHXl可能參與了 SAR反應(yīng)途徑，從而表現(xiàn)其在植物中的抗病功能。
權(quán)利要求
Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因在培育抗病轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列 如 Genbank 號(hào) AAN08157 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如 Genbank 號(hào) AY131235 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗病轉(zhuǎn)基因植物為抗細(xì)菌性 病害和/或真菌性病害的轉(zhuǎn)基因植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)菌性病害為野火?。凰稣婢圆?害為黑脛病。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為煙草。
7.Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因在培育抗病和抗鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列 如Genbank號(hào)AAN08157所示；所述編碼基因的核苷酸序列如Genbank號(hào)AY131235所示。
9.Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因在培育抗氧化脅迫轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.Na+AT逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其編碼基因在培育具系統(tǒng)獲得性抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因在培育抗病轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如Genbank號(hào)AAN08157所示；所述編碼基因的核苷酸序列如Genbank號(hào)AY131235所示。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因可以用來(lái)提高植物抗病性和抗鹽性。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因還可以用來(lái)提高植物抗氧化脅迫能力和提高植物系統(tǒng)獲得性抗性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101906433SQ20091008654
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者李銀心, 陳顯揚(yáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所