本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高活性微囊藻休眠體藻泥的制備方法。
背景技術(shù)：
微囊藻水華頻繁暴發(fā)得益于微囊藻細(xì)胞在受到外界環(huán)境脅迫時能形成營養(yǎng)休眠體，以渡過生長環(huán)境惡劣時期，當(dāng)環(huán)境條件適宜時微囊藻休眠體啟動復(fù)蘇，再次種群暴發(fā)，形成水華，即微囊藻水華發(fā)生初期的藻細(xì)胞或種源主要來源于底泥表層“越冬”的微囊藻休眠體群。長期以來，許多水環(huán)境科學(xué)工作者一直圍繞微囊藻休眠體復(fù)蘇的機(jī)理開展研究，以期能找到從源頭控制微囊藻暴發(fā)水華的方法。因而，微囊藻休眠體是研究微囊藻復(fù)蘇的一種必備實驗材料。目前，試驗研究過程中微囊藻休眠體的來源主要有二種途徑：一是直接從暴發(fā)過微囊藻水華的水域底泥中篩選，這種從底泥中篩選實驗所需的休眠體需要的底泥量很大，工作量也大，且許多都是失去活性的休眠體，成活率和復(fù)蘇率低，復(fù)蘇實驗過程中很多休眠體無法復(fù)蘇，影響實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和實驗結(jié)果。二是在實驗室對微囊藻進(jìn)行簡單的生境脅迫，如化學(xué)試劑脅迫、低溫或暗光培養(yǎng)等人工迫使水體中微囊藻形成休眠體，但這種方法目前沒有統(tǒng)一的技術(shù)制備標(biāo)準(zhǔn)，絕大多數(shù)都是制備成純微囊藻休眠體藻泥，且微囊藻休眠體的成活率和復(fù)蘇率也較低。為此，本發(fā)明以提高微囊藻休眠體成活率和復(fù)蘇率角度為出發(fā)點(diǎn)，就“一種高活性微囊藻休眠體藻泥的制備”方法進(jìn)行了發(fā)明研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為滿足水環(huán)境科學(xué)工作者因研究微囊藻休眠體復(fù)蘇的機(jī)理而對微囊藻休眠體的需求，提供一種高活性微囊藻休眠體藻泥的制備方法。
制備本發(fā)明的高活性微囊藻休眠體藻泥包括如下步驟：
步驟一：將濃度為：1×107 ～9×107個/ ml微囊藻細(xì)胞的原液轉(zhuǎn)接到經(jīng)滅菌的BG11培養(yǎng)液中其體積比為：微囊藻原液：BG11培養(yǎng)液=1:20，再置于溫度（T）25℃、光照強(qiáng)度50uEm-2s-1的人工氣候箱內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)至指數(shù)生長期，并記錄指數(shù)生長期藻細(xì)胞濃度。
本步驟中，所述的微囊藻細(xì)胞的原液可以是銅綠微囊藻、水華微囊藻、惠氏微囊藻或魚害微囊藻等。
步驟二：取精制石英粉用400目、孔徑d=0.038mm的分樣篩進(jìn)行篩濾，取孔徑d≤0.038mm的石英粉用蒸餾水洗滌3次后進(jìn)行滅菌，冷卻待用。
本步驟中，所述滅菌環(huán)境為1kg/cm2,121℃，20min。
步驟三：將滅菌石英粉與指數(shù)生長期藻液按體積比1:4移入到經(jīng)滅菌的植物組織培養(yǎng)瓶中，再將植物組織培養(yǎng)瓶置于溫度（T）4～6℃、光照強(qiáng)度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下靜置培養(yǎng)45d。
本步驟中，所述培養(yǎng)瓶蓋帶透氣濾菌膜。
步驟四：將步驟三培養(yǎng)45d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，留底層混合物，再用導(dǎo)流棒沿培養(yǎng)瓶內(nèi)壁緩慢加入濃度稀釋1000倍的BG11培養(yǎng)液至500 ml刻度處，再次置于溫度（T）4～6℃，光照強(qiáng)度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下靜置培養(yǎng)15 d。
步驟五：將步驟四培養(yǎng)15d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，底層混合物即為含高活性微囊藻休眠體的藻泥。
制得含高活性微囊藻休眠體的藻泥后，測定并記錄此時藻泥體積及微囊藻休眠體濃度后保存，其保存的條件是：長期置于溫度（T）4～6℃，光照強(qiáng)度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下保存，且用稀釋1000倍的BG11培養(yǎng)液保持藻泥濕潤，復(fù)蘇試驗時可根據(jù)需要取適當(dāng)體積的藻泥。
本發(fā)明的休眠體成活率與復(fù)蘇率實驗及對比分析：
1、實驗材料與方法
（1）休眠體成活率的測定
取存放3、6、9、12、15、18、21、24個月的微囊藻休眠體藻泥各1ml于25 ml試管中，用8ml pecoll懸浮試劑使活性微囊藻休眠體懸浮，然后加1 ml 5%無菌Lugol's試液進(jìn)行固定再稀釋后用血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)，將折算出的藻泥微囊藻休眠體濃度與制備時的藻泥微囊藻休眠體濃度進(jìn)行對比（值），得出不同存放期微囊藻休眠體的成活率。
（2）休眠體復(fù)蘇率的測定
取存放3、6、9、12、15、18、21、24個月的微囊藻休眠體藻泥各1ml于120 ml三角瓶中，各加100ml BG11培養(yǎng)液，置于溫度（T）25℃、光照強(qiáng)度50uEm-2s-1的人工氣候箱內(nèi)復(fù)蘇培養(yǎng)7 d，每培養(yǎng)1d用血球計數(shù)板測定一次培養(yǎng)液中復(fù)蘇的藻細(xì)胞（休眠體）數(shù)量，然后棄去100 ml BG11培養(yǎng)液，再加入新BG11培養(yǎng)液100 ml，將7 d測得的總微囊藻休眠體數(shù)與復(fù)蘇前藻泥微囊藻休眠體數(shù)進(jìn)行比值，得到不同存放期微囊藻休眠體的復(fù)蘇率。
對照組：微囊藻休眠體制備過程中不加石英粉，即純微囊藻休眠體藻泥，檢測方法相同。
2、實驗結(jié)果：
休眠體成活率與復(fù)蘇率實驗及對比如上表，從上表中可以看出，石英粉與休眠體混合制備的藻泥休眠體成活率顯著高于純微囊藻休眠體藻泥，石英粉與休眠體混合制備的藻泥休眠體成活率在保存條件下保存24個月其成活率仍高達(dá)98%以上，復(fù)蘇率高達(dá)97%，而相應(yīng)的對照組純休眠體藻泥的休眠體成活率只有67%，復(fù)蘇率為66%。因此，利用石英粉與休眠體混合制備的藻泥來進(jìn)行微囊藻休眠體復(fù)蘇實驗，不僅能提高實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和實驗結(jié)果的可靠性，而且石英粉價格低，滅菌后可以重復(fù)使用，降低了科學(xué)研究的實驗成本。
具體實施方式
下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例,，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施方式，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實施例一：制備本發(fā)明的高活性微囊藻休眠體藻泥包括如下步驟：
步驟一：將濃度為5×107個/ ml水華微囊藻細(xì)胞的原液轉(zhuǎn)接到經(jīng)滅菌的BG11培養(yǎng)液中，再置于溫度（T）25℃、光照強(qiáng)度50uEm-2s-1的人工氣候箱內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)至指數(shù)生長期，并記錄指數(shù)生長期藻細(xì)胞濃度，其中所述微囊藻原液與BG11培養(yǎng)液的體積比為1:20，所述BG11培養(yǎng)液的配方由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫提供。
步驟二：取精制石英粉用400目、孔徑d=0.038mm的分樣篩進(jìn)行篩濾，取孔徑d≤0.038mm的石英粉用蒸餾水洗滌3次后進(jìn)行1kg/cm2,121℃20min滅菌，冷卻待用。
步驟三：將滅菌石英粉100 ml與指數(shù)生長期藻液400ml移入到550 ml經(jīng)滅菌的植物組織培養(yǎng)瓶中，再將植物組織培養(yǎng)瓶置于溫度（T）5℃、光照強(qiáng)度3uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下培養(yǎng)45d，所述培養(yǎng)瓶的瓶蓋帶有透氣濾菌膜。
步驟四：將步驟三培養(yǎng)45d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，留底層混合物，再用導(dǎo)流棒沿培養(yǎng)瓶內(nèi)壁緩慢加入稀釋1000倍的BG11培養(yǎng)液至500 ml刻度處，再次置于溫度（T）5℃，光照強(qiáng)度3 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下培養(yǎng)15 d。
步驟五：將步驟四培養(yǎng)15d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，底層混合物即為含高活性微囊藻休眠體的藻泥。
實施例二：制備本發(fā)明的高活性微囊藻休眠體藻泥包括如下步驟：
步驟一：濃度為8×107個/ ml銅綠微囊藻細(xì)胞的原液轉(zhuǎn)接到經(jīng)滅菌的BG11培養(yǎng)液中，再置于溫度（T）25℃、光照強(qiáng)度50uEm-2s-1的人工氣候箱內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)至指數(shù)生長期，并記錄指數(shù)生長期藻細(xì)胞濃度，其中所述微囊藻原液與BG11培養(yǎng)液的體積比為1:20。
步驟二：取精制石英粉用400目、孔徑d=0.038mm的分樣篩進(jìn)行篩濾，取孔徑d≤0.038mm的石英粉用蒸餾水洗滌3次后進(jìn)行1kg/cm2,121℃20min滅菌，冷卻待用。
步驟三：將滅菌石英粉100 ml與指數(shù)生長期藻液400ml移入到550 ml經(jīng)滅菌的植物組織培養(yǎng)瓶中，再將植物組織培養(yǎng)瓶置于溫度（T）6℃、光照強(qiáng)度5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下培養(yǎng)45d，所述培養(yǎng)瓶的瓶蓋帶有透氣濾菌膜。
步驟四：將步驟三培養(yǎng)45d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，留底層混合物，再用導(dǎo)流棒沿培養(yǎng)瓶內(nèi)壁緩慢加入稀釋1000倍的BG11培養(yǎng)液至500 ml刻度處，再次置于溫度（T）6℃，光照強(qiáng)度5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下培養(yǎng)15 d。
步驟五：將步驟四培養(yǎng)15d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，底層混合物即為含高活性微囊藻休眠體的藻泥。
實施例三：制備本發(fā)明的高活性微囊藻休眠體藻泥包括如下步驟：
步驟一：濃度為3×107個/ ml魚害微囊藻細(xì)胞的原液轉(zhuǎn)接到經(jīng)滅菌的BG11培養(yǎng)液中，再置于溫度（T）25℃、光照強(qiáng)度50uEm-2s-1的人工氣候箱內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)至指數(shù)生長期，并記錄指數(shù)生長期藻細(xì)胞濃度，其中所述微囊藻原液與BG11培養(yǎng)液的體積比為1:20，所述BG11培養(yǎng)液的配方由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫提供。
步驟二：取精制石英粉用400目、孔徑d=0.038mm的分樣篩進(jìn)行篩濾，取孔徑d≤0.038mm的石英粉用蒸餾水洗滌3次后進(jìn)行1kg/cm2,121℃20min滅菌，冷卻待用。
步驟三：將滅菌石英粉100 ml與指數(shù)生長期藻液400ml移入到550 ml經(jīng)滅菌的植物組織培養(yǎng)瓶中，再將植物組織培養(yǎng)瓶置于溫度（T）4℃、光照強(qiáng)度1uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下培養(yǎng)45d，所述培養(yǎng)瓶的瓶蓋帶有透氣濾菌膜。
步驟四：將步驟三培養(yǎng)45d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，留底層混合物，再用導(dǎo)流棒沿培養(yǎng)瓶內(nèi)壁緩慢加入稀釋1000倍的BG11培養(yǎng)液至500 ml刻度處，再次置于溫度（T）4℃，光照強(qiáng)度1uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下培養(yǎng)15 d。
步驟五：將步驟四培養(yǎng)15d的植物組織培養(yǎng)瓶中上清液移去，底層混合物即為含高活性微囊藻休眠體的藻泥。
制得含高活性微囊藻休眠體的藻泥后，測定并記錄此時藻泥體積及微囊藻休眠體濃度并保存，其保存的條件是：長期置于溫度（T）4～6℃，光照強(qiáng)度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h條件下保存，且須用稀釋1000倍的BG11培養(yǎng)液保持藻泥濕潤，復(fù)蘇試驗時可根據(jù)需要取適當(dāng)體積的藻泥。
特別說明的是，本說明書中提到的BG11培養(yǎng)液的配方由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫提供。