本發(fā)明涉及細胞分離培養(yǎng)領域，具體而言，涉及一種人羊膜上皮細胞、分離培養(yǎng)方法及用途。
背景技術：
：糖尿病是一種常見的由內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝障礙引起的慢性終身疾病，長期患病可導致神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的慢性損害。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展以及人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加，嚴重危害人們的健康，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。最新大樣本流行病學調查顯示，中國成人糖尿病患病率為11.6％，其中男性患病率為12.1％，女性患病率為11％，城市居民為14.3％，農(nóng)村居民為10.3％；調查結果還顯示糖尿病前期率為50.1％。目前主要是使用口服降糖藥及胰島素替代治療，不能根治，且存在很多不足。人羊膜來源干細胞包括人羊膜上皮細胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)、人羊膜間充質干細胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)。人羊膜干細胞可在體內(nèi)及體外向外胚層來源的神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質細胞，內(nèi)胚層來源的胰腺細胞、肝臟細胞以及中胚層來源的心肌樣細胞、肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞方向分化，并且具有無性集落形成能力和抗炎性。作為很多細胞的前體，羊膜干細胞又能抑制細胞免疫。不同的抗血管生成和抗炎癥的蛋白都在羊膜干細胞中表達，這也解釋了羊膜的抗血管生成和抗炎癥的作用。這些性質使得羊膜干細胞已在很多治療起到輔佐作用，而且大多數(shù)效果顯著。人羊膜干細胞在具有類似胚胎干細胞性質的同時，因其無致瘤性、低免疫排斥性、含量豐富、容易獲取、不引起倫理爭議，極有潛力成為臨床應用的干細胞來源之一。近年來，隨著干細胞技術的發(fā)展，羊膜干細胞移植已經(jīng)成為新的疾病治療的發(fā)展方向。在臨床應用上，羊膜干細胞在結膜損傷修復、重建眼表、防治瞼球粘連與視網(wǎng)膜移植等眼科臨床已開展了大量工作，而且在糖尿病難愈性皮膚潰瘍、燒傷等創(chuàng)面修復愈合方面也有積極的療效。而且，已經(jīng)有實驗證據(jù)證明羊膜干細胞能夠分化在一定條件下能夠分化為胰島細胞。同時，也有學者報道了人羊膜間充質干細胞治療糖尿病的病例，并取得了良好的效果。雖然現(xiàn)在在羊膜干細胞的應用研究上已經(jīng)取得了一定的成果，但實際上，對于羊膜上皮細胞的功能開發(fā)和利用還并不充分；同時，現(xiàn)有的羊膜上皮細胞的提取和細胞培養(yǎng)仍較為困難，不僅提取和培養(yǎng)的操作復雜而且成本較高，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化制備。因此，開發(fā)一種便捷高效且能夠產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；崛『团囵B(yǎng)羊膜上皮細胞的方法，并進一步對膜上皮細胞開發(fā)和利用就成了目前亟待解決的技術問題。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種人羊膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，所述方法中，通過將羊膜上皮細胞從胎盤上提取分離并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡易、便捷且規(guī)模化的得到羊膜上皮細胞，進而能夠解決現(xiàn)有技術無法產(chǎn)業(yè)化制備高純度羊膜上皮細胞的技術問題。本發(fā)明的第二目的在于提供一種人羊膜上皮細胞，所述人羊膜上皮細胞是由本發(fā)明方法提取純化并增殖培養(yǎng)得到的，具有能夠產(chǎn)業(yè)化制備，且培養(yǎng)得到的人羊膜上皮細胞純度高等優(yōu)點。本發(fā)明的第三個目的在于提供所述人羊膜上皮細胞的用途，本發(fā)明人羊膜上皮細胞能夠用于糖尿病等疾病的治療中，并能夠有效控制患者的血糖水平。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：一種人羊膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，所述方法包括如下步驟：(1)將羊膜從胎盤組織上剝離后清洗；(2)將清洗后的羊膜剪碎，并用胰酶消化處理；(3)將消化處理后得到的消化液過篩后，收集細胞濾液，并離心處理；(4)將離心處理得到的細胞用培養(yǎng)基懸浮后接種，并培養(yǎng)；(5)當培養(yǎng)的細胞匯合度達到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培養(yǎng)基終止消化，并傳代培養(yǎng)，即得人羊膜上皮細胞。本發(fā)明中，通過將羊膜上皮細胞從胎盤上提取分離并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡易、便捷且規(guī)?；牡玫窖蚰ど掀ぜ毎煌瑫r，本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的羊膜上皮細胞性狀穩(wěn)定，在多代培養(yǎng)后，仍然能夠保持穩(wěn)定的形狀?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(1)中所述剝離是在無菌條件下進行的?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(1)中所述剝離是采用機械的方法進行剝離?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶消化處理為在水浴條件下的消化處理?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(4)中所述培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基或低糖DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)選的，本發(fā)明中步驟(4)中所述培養(yǎng)基為低糖DMEM培養(yǎng)基?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(4)中所述培養(yǎng)為按照1×106細胞密度接種于10cm培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(4)中所述培養(yǎng)為在37℃的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)48h后更換培養(yǎng)液?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基或低糖DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)選的，本發(fā)明中步驟(4)中所述培養(yǎng)基為低糖DMEM培養(yǎng)基?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述傳代培養(yǎng)是按照1:3的比例進行傳代培養(yǎng)?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(1)中所述清洗是以含2～5％雙抗的HBSS緩沖溶液進行清洗；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(1)中所述清洗是以含3～4％雙抗的HBSS緩沖溶液進行清洗。本發(fā)明中，通過對所用清洗液的選擇和調整，并使用具有抑菌成分的清洗液，從而在能夠清楚除去羊膜上殘留的血跡的同時，還能夠對羊膜實現(xiàn)消毒抑菌的功效。可選的，本發(fā)明中，所述清洗為多次清洗，例如可以為2、3、4、5或更多次清洗。本發(fā)明中，所述HBSS緩沖溶液為平衡鹽溶液。。本發(fā)明中，所述含2～5％雙抗的HBSS緩沖溶液為含2～5％青霉素和鏈霉素的HBSS緩沖溶液?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶消化處理是在33～39℃條件下用胰酶消化處理20～40min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶消化處理是在35～37℃條件下用胰酶消化處理30～35min。本發(fā)明中，通過對消化處理溫度和時間的調整，從而能夠提高酶活性，并進一步提高酶解處理效率；同時還不會由于酶解時間過長所導致的處理效率過低以及對目標細胞組織的破壞可選的，本發(fā)明中，所述消化處理為消化處理2～4次；優(yōu)選的，本發(fā)明中，所述消化處理為消化處理3次。本發(fā)明中，通過對酶解消化處理次數(shù)的選擇和調整，從而可以實現(xiàn)充分的純化處理?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述過濾是以孔徑為200～400目的篩網(wǎng)進行過濾；優(yōu)選的，本發(fā)明中，驟(3)中所述過濾是以孔徑為300～350目的篩網(wǎng)進行過濾。本發(fā)明中，通過對過濾所用篩網(wǎng)孔徑的選擇和調整，從而能夠將未消化的組織充分過濾除去。可選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述離心是在轉速為1300～1600rpm的條件下離心5～15min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述離心是在轉速為1400～1500rpm的條件下離心8～10min。本發(fā)明中，通過對離心轉速以及離心時間的選擇和調整，從而可以在時間充分離心純化的同時，還不會由于處理時間過長所導致的純化處理效率過低?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述胰酶消化是在33～39℃條件下用胰酶消化處理3～10min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述胰酶消化是在35～37℃條件下用胰酶消化處理8～10min；更優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述胰酶消化是在37℃條件下用胰酶消化處理10min。同時，本發(fā)明還提供了一種人羊膜上皮細胞，所述人羊膜上皮細胞是由本發(fā)明方法分離培養(yǎng)得到的。本發(fā)明中，通過采用本發(fā)明方法提取純化并增殖培養(yǎng)得到的人羊膜上皮細胞，從而能夠產(chǎn)業(yè)化制備人羊膜上皮細胞，同時具有所培養(yǎng)得到的人羊膜上皮細胞純度高等優(yōu)點。進一步的，本發(fā)明還提供了所述人羊膜上皮細胞在制備治療疾病藥物中的應用。本發(fā)明中，所述人羊膜上皮細胞能夠用于糖尿病等疾病的治療中，并能夠有效控制控制患者的血糖水平?？蛇x的，本發(fā)明中，所述疾病為糖尿病。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明中，通過將羊膜上皮細胞從胎盤上提取分離并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，具有方法簡易、便捷且能夠規(guī)?；苽溲蚰ど掀ぜ毎葍?yōu)點；(2)本發(fā)明中，通過對酶解消化處理等步驟條件的選擇、調整以及優(yōu)化，從而進一步提高了本發(fā)明羊膜上皮細胞提取純化效率；(3)本發(fā)明中所述人羊膜上皮細胞能夠用于糖尿病等疾病的治療以及相應疾病治療藥物的制備中，并能夠有效控制控制患者的血糖水平。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1為培養(yǎng)48h后，在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖2為培養(yǎng)基中細胞匯合度達到80％-90％時，4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖3為P1代人羊膜上皮細胞在在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖4為P5代人羊膜上皮細胞在在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖5為細胞表面子在人羊膜上皮細胞上的表達分析檢測圖譜。圖6A為未經(jīng)誘導分化處理的P3代羊膜上皮細胞在4×顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)。圖6B為經(jīng)成脂誘導試劑誘導分化處理后P3代羊膜上皮細胞在4×顯微鏡下觀察到的細胞染色情況。圖6C為經(jīng)成骨誘導試劑誘導分化處理后P3代羊膜上皮細胞在4×顯微鏡下觀察到的細胞染色情況。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1(1)在無菌條件下，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，然后用含3％雙抗的HBSS緩沖溶液沖洗數(shù)次清除殘留血跡；(2)將沖洗后的羊膜組織剪碎后，加入胰酶，并在37℃水浴鍋內(nèi)消化處理3次，每次消化處理30min；(3)將消化處理后所得的消化液過300目篩網(wǎng)，以去掉未消化組織，并收集過濾后所得的細胞濾液；然后將細胞濾液在1500rpm條件下，離心處理10min；(4)將離心后所得沉淀細胞用低糖DMEM培養(yǎng)基重新懸浮，并按照1×106細胞密度接種于10cm培養(yǎng)皿內(nèi)；并將培養(yǎng)基放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在培養(yǎng)48小時后，得到圖1所示細胞形態(tài)的培養(yǎng)基，并更換為新的低糖DMEM培養(yǎng)基；(5)如圖2所示，當培養(yǎng)基中細胞匯合度達到80％-90％后，向培養(yǎng)基中加入胰酶，并在37℃條件下消化5min；然后再向加入低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，即得到圖3所示的P1代人羊膜上皮細胞；然后按1:3進行傳代培養(yǎng)，即得到傳代培養(yǎng)的人羊膜上皮細胞。本發(fā)明方法培養(yǎng)的人羊膜上皮細胞可穩(wěn)態(tài)傳代至如圖4所示的P5代。實驗例1流式細胞儀檢測收集實施例1步驟(3)中消化處理后，過濾離心得到的人羊膜上皮細胞，并收集約106個細胞；將收集得到的細胞用PBS緩沖溶液洗滌2次，并適當稀釋；然后在流式細胞儀上加樣檢測；檢測后，采用軟件分析CD73、CD90、CD44、CD45、CD105等5種細胞表面子在人羊膜上皮細胞上的表達，分析結果如圖5所示；進一步根據(jù)圖5所示分析結果進行積分計算，得出5種細胞表面子在各代的表達情況，結果如下：CD73表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0P1代757275.775.7P2代755799.875.6CD90表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0P1代496249.649.6P2代460292.746.0CD105表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0P1代706576.076.0P3代360.50.4CD45表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0P1代754275.475.4P3代00.00.0CD44表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0P1代450945.145.1P3代449799.745.0然后統(tǒng)計各標志物表達情況，結果如下表所示：細胞表面標志物羊膜上皮細胞CD7399.8％CD4499.7％CD1050.5％CD9092.7％CD450％檢測結果顯示，本發(fā)明人羊膜上皮細胞高表達了CD73、CD44以及CD90，基本不表達CD105以及CD45。實驗例2成脂及成骨分化的實驗研究干細胞具有自我復制及多項分化的潛能。到目前為止人們已經(jīng)陸續(xù)從臍帶，胎盤，骨髓，脂肪，皮膚，毛囊等組織提取分離出間充質干細胞。分離方法主要有種植法和酶消化法兩種。不同的方法和實驗程序對提取的干細胞的質量和純度有很大差異。所以干細胞的分化實驗是世界上普遍認可的干細胞鑒定標準。具體檢測方法如下：a、將實施例1步驟(5)中P3代羊膜上皮細胞以1x105ml-1的密度接種于12孔板，待其融合度達到70％-80％后，加入成脂誘導液，并有對照孔。每周換液兩次，誘導14-18天后，進行油紅O染色鑒定脂滴形成，顯微鏡下觀察并拍照見圖6B。b、將實施例1步驟(5)中P3代羊膜上皮細胞以1x105ml-1的密度接種于12孔板，待其融合度達到70％-80％加入成骨誘導液，并有對照孔。每周換液兩次，誘導21-25天后，進行茜素紅染色鑒定骨結節(jié)形成，顯微鏡下觀察并拍照見圖6C。圖6A為陰性對照，經(jīng)對照檢測發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明羊膜上皮細胞具有良好的成脂、成骨能力。實驗例3糖尿病治療效果實驗T1DM模型大鼠18只，隨機分為兩組，其中6只大鼠接受胰島素治療，記為胰島素治療組；6只大鼠接受人羊膜上皮細胞治療，記為人羊膜上皮細胞治療組；6只不接受任何治療，記為對照組。同時隨機選取6只正常大鼠作為正常對照組，記為正常組。其中，胰島素治療組為在每日大鼠進食前1h腹部注射3U胰島素；人羊膜上皮細胞治療組為將大鼠禁食12h后麻醉，并舌下靜脈注射P3代人羊膜上皮細胞(1×106)懸液300μL/只；對照組不做任何治療。然后，每周對各組大鼠定時取血檢測血糖，至第6周，并統(tǒng)計和計算各組小鼠血糖平均值，結果如下表所示：由上述實驗結果可知，本發(fā)明羊膜上皮細胞能夠有效控制血糖含量，并能夠使得大鼠血糖水平接近正常范圍值。進一步的，臨床試驗表明，本發(fā)明羊膜上皮細胞對人體由于糖尿病引發(fā)的高血糖也有很好的控制作用，經(jīng)注射本發(fā)明羊膜上皮細胞懸浮液后，75％的糖尿病患者的血糖能夠恢復至較正常水平；且體內(nèi)胰島素水平明顯有所升高。本發(fā)明中，通過將羊膜上皮細胞從胎盤上提取分離并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，能夠簡易、便捷且能夠規(guī)模化制備羊膜上皮細胞；同時，本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的羊膜上皮細胞能夠用于治療糖尿病，并能夠有效控制糖尿病患者的血糖水平。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當前第1頁1 2 3