一種生物羊膜及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物羊膜及其制備方法。該生物羊膜為三層，自上而下分別是緩釋層、羊膜層、膠原層。緩釋層是由膠原和生物活性因子組成，羊膜層由經(jīng)過脫細(xì)胞處理的羊膜組成,膠原層是膠原蛋白經(jīng)過冷凍干燥復(fù)合而成。該生物羊膜通過原料預(yù)處理、病毒滅活、脫細(xì)胞處理、制備膠原層、制備緩釋層、滅菌等步驟完成。本發(fā)明所制備的生物羊膜具有活性因子緩釋功效、去除上皮細(xì)胞抗原性低、產(chǎn)品操作方便、不易卷曲、與周圍組織黏附性好、不易滑動(dòng)等特點(diǎn)。同時(shí)，本發(fā)明的羊膜脫細(xì)胞處理工藝有效保留了羊膜中天然的致密膠原結(jié)構(gòu)，應(yīng)用在肌腱修復(fù)術(shù)后能夠充分發(fā)揮物理屏障作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明能有效起到預(yù)防發(fā)生組織粘連的作用。
【專利說明】一種生物羊膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料技術(shù)，具體涉及一種生物羊膜及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]組織粘連是結(jié)締組織纖維帶與相鄰的組織或器官結(jié)合在一起而形成的異常結(jié)構(gòu)，可引起各種術(shù)后并發(fā)癥:例如，肌腱修復(fù)術(shù)后粘連，嚴(yán)重的影響手術(shù)部位功能的恢復(fù)，甚至?xí)斐删植抗δ艿膯适А?br> [0003]羊膜，是人胎膜的內(nèi)層，包含人體中最厚的基底膜及無血管的間質(zhì)，羊膜免疫原性低，具有減輕炎性反應(yīng)、抑制纖維組織增生等作用，可作為一種理想的組織工程修復(fù)材料。
[0004]專利CN1369555A和CN102327640A分別使用胰蛋白酶、TBS-SDS (含有十二烷基硫酸鈉的TBS緩沖液)等試劑對(duì)羊膜進(jìn)行脫細(xì)胞，制備得到的羊膜材料比較薄、易卷曲、黏附性較差、使用時(shí)易滑動(dòng)脫落。為了克服上述缺點(diǎn)，專利CN100368534C采用交聯(lián)技術(shù)制備復(fù)合生物衍生羊膜以改善其可操作性，但處理時(shí)使用了氯仿、甲醇、戊二醛等多種有機(jī)試劑，處理強(qiáng)度大，經(jīng)過脫脂等多個(gè)步驟后對(duì)羊膜的天然結(jié)構(gòu)破壞很大，造成膠原束排列不規(guī)則，膠原纖維斷裂，同時(shí)大量的生物活性因子失活試劑殘留風(fēng)險(xiǎn)高，且。針對(duì)生物衍生羊膜的不足，專利CN1943796A公開了一種輻照交聯(lián)多孔網(wǎng)狀脫細(xì)胞羊膜水凝膠輔料的制作方法，提出了水凝膠敷料的概念，但采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)羊膜進(jìn)行脫細(xì)胞，極易破壞羊膜的天然結(jié)構(gòu)，造成膠原纖維斷裂、降低材料的力學(xué)性能，而且該專利中使用了高劑量的輻照交聯(lián)和輻照消毒步驟，輻照交聯(lián)過程中往往會(huì)伴隨著一些副反應(yīng)的發(fā)生降低產(chǎn)品的安全性，兩次輻照過程會(huì)大大破壞天然羊膜的空間膠原結(jié)構(gòu)。專利CN101040616A將羊膜與生長因子浸泡后制得藥物羊膜，但仍未改善單層羊膜較薄、易卷曲的操作缺點(diǎn)，而且浸泡后的生長因子僅僅附著在羊膜表面，緩釋性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有羊膜防粘連材料及制備工藝的不足，提供一種具有緩釋功能的生物羊膜及其制備方法。
[0006]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明所提出的生物羊膜，其特征在于，具有三層結(jié)構(gòu)，自上而下分別為緩釋層、羊膜層、膠原層。其中，緩釋層是由膠原蛋白和生物活性因子組成，較薄，約為0.5~
1.Ομπι;羊膜層為經(jīng)過脫細(xì)胞處理的羊膜，保留了羊膜天然的致密膠原結(jié)構(gòu)；膠原層是膠原蛋白組成，與緩釋層相比較厚，約為10.0~50.0 μ m。三者之間通過冷凍干燥復(fù)合而成。
[0008]本發(fā)明提出的緩釋生物羊膜的制備方法，其主要步驟如下:
[0009]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水或純化水清洗干凈；
[0010]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于75%乙醇溶液中I~3h，或浸泡于0.1%~0.5%過氧乙酸溶液中10~30min,再用純化水清洗3~5次；[0011]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中震蕩0.5~3h后，用純化水清洗干凈；再采用純化水室溫震蕩0.5~3h。重復(fù)I~5次，制備獲得羊膜層；
[0012]所述高滲溶液為1M~5M NaCl與0.01M~0.5M NaOH的混合溶液。
[0013]上述三個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)了羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)即羊膜層的制備，對(duì)羊膜進(jìn)行前處理后選用了滅活的步驟，保證產(chǎn)品的生物安全性。通過溶脹作用破壞基質(zhì)中的上皮細(xì)胞，達(dá)到去除細(xì)胞抗原性的目的。上述各步驟工藝中沒有采用酶、去污劑等破壞程度強(qiáng)烈的工藝，充分保留了羊膜細(xì)胞外基質(zhì)中天然的致密結(jié)構(gòu)。
[0014]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，-20°C下預(yù)凍2h后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥4~8h ;
[0015]本步驟將羊膜和膠原蛋白復(fù)合制成復(fù)合生物羊膜，通過冷凍復(fù)合膠原過程增加了產(chǎn)品的厚度，改善了單層羊膜較薄、易卷曲的缺點(diǎn)。
[0016]步驟五、緩釋層的制備:制備具有抑制炎癥、促進(jìn)傷口愈合的活性因子bFGF、EGF的一種或兩種因子任意濃度混合的膠原溶液，兩種活性因子的濃度范圍均為2000ng/ml~20000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速_20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥6~12h。冷凍過程使膠原形成具有一定空隙的空間結(jié)構(gòu)，而活性因子能夠附著在支架空隙中形成緩釋作用，最終制備得到生物羊膜。
[0017]肌腱斷裂術(shù)后粘連發(fā)生的主要因素是:外源性成纖維細(xì)胞由周圍組織向肌腱斷端生長，形成肌腱與周圍組織的粘連，同時(shí)炎癥反應(yīng)重亦會(huì)加重粘連程度。同類產(chǎn)品的作用機(jī)理大多表現(xiàn)為材料的物理屏障作用，隔離外源性愈合細(xì)胞向手術(shù)部位延伸，這對(duì)于預(yù)防術(shù)后粘連來說是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。研究表明bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、EGF (表皮細(xì)胞生長因子)均能夠參與并促進(jìn)肌腱的內(nèi)源性愈合過程，因此本步驟能夠使羊膜材料不僅具有物理屏障作用，隔絕成纖維細(xì)胞向手術(shù)部位生長，同時(shí)可通過緩釋生長因子刺激促進(jìn)肌腱的內(nèi)源性愈合修復(fù)過程。
[0018]步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0019]本發(fā)明之生物羊膜，制備方法簡單，原料來源廣泛，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。所制備的脫細(xì)胞羊膜處理強(qiáng)度低、脫細(xì)胞效果良好，能夠充分保留天然羊膜的致密膠原結(jié)構(gòu)。經(jīng)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明所制備的生物緩釋羊膜具有預(yù)防粘連、促進(jìn)組織愈合的作用。
[0020]本發(fā)明的生物緩釋羊膜具有三層結(jié)構(gòu)，由緩釋層、羊膜層、膠原層復(fù)合而成.以經(jīng)過脫細(xì)胞處理的羊膜為支架合理分布復(fù)合膠原及活性因子，其優(yōu)點(diǎn)在于，解決了現(xiàn)有單層羊膜產(chǎn)品薄、易卷曲、黏附性差、應(yīng)用后易脫落的缺點(diǎn)，去除細(xì)胞后產(chǎn)品免疫原性低，同時(shí)賦予生物羊膜藥物緩釋特性、主動(dòng)參與植入部位的愈合過程。本發(fā)明之制備方法，利用高低滲作用，去除羊膜中的細(xì)胞后制備羊膜層，同時(shí)完整保留羊膜中的天然膠原結(jié)構(gòu)，應(yīng)用在肌腱修復(fù)部位能夠充分發(fā)揮材 料的物理屏障作用，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)；復(fù)合膠原層顯著的增加了產(chǎn)品厚度和可操作性，同時(shí)膠原與周圍組織黏附性好，植入后不易產(chǎn)生滑動(dòng)；緩釋層中生物活性因子的加入則使得產(chǎn)品具有能夠主動(dòng)參與促進(jìn)植入部位愈合的優(yōu)點(diǎn)。
[0021]通過對(duì)不同羊膜脫細(xì)胞方法的組織學(xué)對(duì)比研究，結(jié)果表明本發(fā)明中羊膜脫細(xì)胞方法能夠有效防止溶劑對(duì)于羊膜膠原層的破壞，去除免疫原性物質(zhì)同時(shí)保留其天然的膠原致密結(jié)構(gòu)。運(yùn)用模擬生理緩沖液對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品的緩釋特性進(jìn)行驗(yàn)證，48h內(nèi)活性因子釋放量能夠達(dá)到總量的69.9±5.9%，具有緩慢釋放的特性。同時(shí)對(duì)雞趾深屈肌腱修復(fù)術(shù)后的防粘連有效性進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，本發(fā)明產(chǎn)品能夠在肌腱植入部位有效的發(fā)揮物理屏障及促進(jìn)愈合的作用，顯著的降低手術(shù)部位肌腱與周圍組織粘連的發(fā)生。
[0022]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1本發(fā)明制備的緩釋生物羊膜外觀圖
[0024]本圖顯示的為生物羊膜緩釋層表面。
[0025]圖2是采用胰酶、去污劑、和本發(fā)明脫細(xì)胞工藝對(duì)羊膜原料進(jìn)行脫細(xì)胞處理后的羊膜組織學(xué)對(duì)比照片，
[0026]圖中，A是采用胰酶進(jìn)行脫細(xì)胞處理的羊膜組織學(xué)照片，可以看出羊膜原料經(jīng)過胰酶脫細(xì)胞處理后不能完全去除上皮層的細(xì)胞，在材料邊緣或較厚的部位依然后有細(xì)胞殘留，同時(shí)經(jīng)過酶解后的羊膜膠原層結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)松散現(xiàn)象。B是采用而經(jīng)過去污劑EDTA進(jìn)行脫細(xì)胞處理的羊膜原料組織學(xué)照片，可以看出雖然EDTA能夠較為完整的去除上皮細(xì)胞層，但是與本發(fā)明工藝相比，羊膜的膠原層有明顯的分離和松散出現(xiàn)。C是本專利工藝處理的脫細(xì)胞羊膜組織學(xué)照片，可見通過溶液對(duì)于上皮細(xì)胞壁的溶脹作用去除胞內(nèi)基質(zhì)等可能的免疫原性物質(zhì)，同時(shí)能夠有效防止溶液對(duì)于羊膜膠原層的破壞，保留其天然的致密結(jié)構(gòu)。
[0027]圖3是在模擬生理緩沖液中體外檢測本發(fā)明制備的生物羊膜活性因子緩釋率時(shí)間圖
[0028]通過模擬生理緩沖液生物羊膜中活性因子的釋放情況，橫坐標(biāo)為緩釋時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為活性因子釋放率(％)。從圖中的釋放曲線圖中可以看出，前期24h之內(nèi)活性因子的累積釋放量約為48.6±3.3%，48h 釋放量能夠達(dá)到總量的69.9±5.9%，此后整個(gè)釋放過程趨于逐漸緩慢，96h之后釋放量能夠達(dá)到總量的82.4±4.1%。表明本發(fā)明所制備的生物羊膜中能夠緩慢釋放活性因子，同時(shí)與現(xiàn)有發(fā)明專利中使用浸泡的方式僅使活性因子保留在羊膜表面相比，本發(fā)明產(chǎn)品的緩慢釋放特性更加明顯和持久，從而有效的促進(jìn)植入部位的內(nèi)源性愈合過程。
[0029]圖4是將本專利發(fā)明制備的生物羊膜產(chǎn)品應(yīng)用于雞趾深屈肌腱修復(fù)后防粘連的有效性圖片
[0030]圖中A、C為空白對(duì)照組修復(fù)雞屈肌腱3W的大體外觀和組織學(xué)結(jié)果照片；圖中B、D為空白對(duì)照組修復(fù)雞屈肌腱8W的大體外觀和組織學(xué)照片結(jié)果；圖中E、G為生物羊膜組修復(fù)雞屈肌腱3W的大體外觀和組織學(xué)結(jié)果照片；圖中F、H為生物羊膜組修復(fù)雞屈肌腱8W的外觀和組織學(xué)照片。從圖中可以看出空白對(duì)照組在術(shù)后3W取材縫線部位即有明顯的粘連現(xiàn)象出現(xiàn)，肌腱與周圍組織粘連部位較多無法鈍性分離，肌腱滑動(dòng)部分受限；術(shù)后8W取材時(shí)粘連程度進(jìn)一步加深，向縫合處的近、遠(yuǎn)端蔓延，肌腱滑動(dòng)明顯受限。而生物羊膜組術(shù)后3W取材時(shí)手術(shù)部位縫線處有少量束帶狀粘連，肌腱滑動(dòng)輕微受限，術(shù)后8W取材時(shí)發(fā)現(xiàn)材料包裹部位與肌腱組織整合，肌腱可自由滑動(dòng)。大體外觀結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，生物羊膜組能夠有效的預(yù)防肌腱修復(fù)術(shù)后粘連的發(fā)生。
[0031]從圖之組織學(xué)圖片可以看出:空白對(duì)照組在3W取材時(shí)肌腱損傷部位有大量的修復(fù)細(xì)胞，這些修復(fù)細(xì)胞從腱內(nèi)和腱旁組織向損傷部位遷入，使得損傷肌腱和周圍組織整合到一起，無法區(qū)分肌腱與周圍組織的界限；空白對(duì)照組8W取材，肌腱損傷部位由于炎癥細(xì)胞和修復(fù)細(xì)胞的遷入使得肌腱與周圍組織部分粘連在一起，無法分離。而生物羊膜組3W取材時(shí)炎癥反應(yīng)比較輕，損傷肌腱周圍無增生，肌腱與周圍組織界限明顯，無粘連現(xiàn)象；生物羊膜組8W取材時(shí)損傷肌腱內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的修復(fù)細(xì)胞，肌腱內(nèi)源性愈合癥狀明顯表現(xiàn)，且肌腱與周圍組織界限明顯，無粘連發(fā)生。組織學(xué)圖片結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，生物羊膜組能夠有效的預(yù)防肌腱修復(fù)術(shù)后粘連的發(fā)生 。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1、
[0033]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，磷酸鹽緩沖液清洗；
[0034]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于75%乙醇溶液中2h，純化水清洗4次；
[0035]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中(高滲溶液為4M NaCl與0.05M NaOH的混合溶液)，室溫震蕩2.5h后，迅速純化水清洗，再采用純化水室溫震蕩2.5h ;重復(fù)I次，制備獲得羊膜層；
[0036]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，厚度約為ΙΟ.Ομπι，-20°C下預(yù)凍2h后冷凍干燥4h。
[0037]步驟五、緩釋層的制備:制備具有抑制炎癥、抑制成纖維細(xì)胞的活性因子bFGF、EGF兩種因子混合的膠原蛋白溶液，bFGF和EGF的濃度均為3000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速-20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥8h。
[0038]步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0039]本實(shí)施例制備的生物羊膜厚度約為20.0μπι，比單層羊膜厚度增加了約一倍，克服了單層羊膜比較薄、易卷曲的缺點(diǎn)，提高了產(chǎn)品可操作性；同時(shí)膠原蛋白與組織黏附效果好，材料植入后不易出現(xiàn)滑動(dòng)。此實(shí)施例制備的材料適用于較細(xì)的肌腱部位，應(yīng)用于肌腱修復(fù)術(shù)后，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該產(chǎn)品具有良好的防止肌腱與周圍組織粘連的效果(見附圖4)。
[0040]實(shí)施例2、
[0041]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，純化水清洗；
[0042]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于0.5%過氧乙酸溶液中IOmin,純化水清洗4次；
[0043]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中(高滲溶液為IM NaCl與0.1OM NaOH的混合溶液)室溫震蕩0.5h后，迅速純化水清洗，再采用純化水室溫震蕩0.5h ;重復(fù)5次，制備獲得羊膜層；
[0044]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，厚度約為40.0 μ m，-20°C下預(yù)凍2h后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥8h。
[0045]步驟五、緩釋層的制備:制備活性因子bFGF、EGF的混合膠原溶液，bFGF和EGF的濃度均為8000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速_20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥IOh。
[0046]步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0047]本實(shí)施例制備的生物羊膜厚度約為50.0 μ m，增加材料厚度后產(chǎn)品操作更加方便；經(jīng)過組織學(xué)檢測本實(shí)施例步驟三制備的羊膜脫細(xì)胞效果良好，與其它脫細(xì)胞方法相比能夠保留天然羊膜的致密膠原纖維結(jié)構(gòu)(見附圖2)，有利于充分發(fā)揮材料的物理屏障作用，同時(shí)去除細(xì)胞后材料具有較低的免疫原性，能夠有效預(yù)防術(shù)后粘連的發(fā)生。
[0048]實(shí)施例3、
[0049]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，生理鹽水清洗；
[0050]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于75%乙醇溶液中3h，純化水清洗5次；
[0051]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中(高滲溶液為3M NaCl與0.01M NaOH的混合溶液)室溫震蕩Ih后，迅速純化水清洗，再采用純化水室溫震蕩Ih ;重復(fù)4次，制備獲得羊膜層；
[0052]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，厚度約為30.0μπι，-20°C下預(yù)凍2h后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥8h。
[0053]步驟五、緩釋層的制備:制備活性因子bFGF、EGF的混合膠原溶液，bFGF和EGF的濃度分別為8000ng/ml和12000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速_20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥IOh。
[0054]步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0055]本實(shí)施例制備的生物羊膜厚度約為40.0 μ m,材料厚度適中，易于操作，適用于多種肌腱修復(fù)術(shù)后應(yīng)用；材料植入后不易滑動(dòng)脫落、產(chǎn)品免疫原性、其中所含的活性因子能夠主動(dòng)參與修復(fù)部位的愈合進(jìn)程，具有良好的預(yù)防組織粘連的效果。
[0056]實(shí)施例4、
[0057]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，純化水清洗；
[0058]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于0.1%過氧乙酸溶液中30min，純化水清洗4次；
[0059]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中(所述高滲溶液為5M NaCl與0.05M NaOH的混合溶液)室溫震蕩2.5h后，迅速純化水清洗，再采用純化水室溫震蕩2.5h ;重復(fù)I次，制備獲得羊膜層；
[0060]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，厚度約為20.0ym，-20°C下預(yù)凍2h后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥6h。
[0061]步驟五、緩釋層的制備:制備活性因子bFGF的膠原溶液，其濃度為20000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速_20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥6h。
[0062]步驟六、滅菌:將步驟五制備 得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0063]本實(shí)施例制備的生物羊膜厚度約為30.0 μ m，產(chǎn)品操作方便、植入后不易滑動(dòng)脫落、免疫原性低，可同時(shí)用于多種肌腱修復(fù)術(shù)、神經(jīng)修復(fù)術(shù)后，能有效促進(jìn)組織愈合，具有良好的預(yù)防粘連的效果。
[0064]實(shí)施例5、
[0065]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，磷酸鹽緩沖液清洗；
[0066]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于0.3%過氧乙酸溶液中20min,純化水清洗3次；
[0067]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中(所述高滲溶液為2.5M NaCl與0.1OM NaOH的混合溶液)室溫震蕩2h后，迅速純化水清洗，再采用純化水室溫震蕩2h ;重復(fù)2次，制備獲得羊膜層；
[0068]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，厚度約為30.0 μ m, -20°C下預(yù)凍2h后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥8h。
[0069]步驟五、緩釋層的制備:制備活性因子EGF的膠原溶液，其濃度為15000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活 性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速_20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥6h。最終制備得到生物緩釋羊膜。
[0070]步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0071]本實(shí)施例制備的生物羊膜厚度約為40.0 μ m，產(chǎn)品厚度適中、操作方便、植入后不易滑動(dòng)脫落、免疫原性低，其中的活性因子能夠主動(dòng)參與植入部位組織的愈合，可應(yīng)用肌腱、神經(jīng)等組織的防粘連及多種軟組織的修復(fù)。
[0072]實(shí)施例6、
[0073]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，純化水清洗；
[0074]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于75%乙醇溶液中l(wèi)h，純化水清洗3次；
[0075]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中(所述高滲溶液為5M NaCl與0.05M NaOH的混合溶液)室溫震蕩3h后，迅速純化水清洗，再采用純化水室溫震蕩3h ;制備獲得羊膜層；
[0076]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，厚度約為20.0ym，-20°C下預(yù)凍2h后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥6h。
[0077]步驟五、緩釋層的制備:制備活性因子EGF的膠原溶液，其濃度為10000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速_20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥6h。最終制備得到生物緩釋羊膜。
[0078]步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0079]本實(shí)施例制備的生物羊膜厚度約為30.0 μ m，產(chǎn)品厚度適中、操作方便、植入后不易滑動(dòng)脫落、免疫原性低，能夠促進(jìn)植入部位組織的愈合，可應(yīng)用肌腱、神經(jīng)等組織的防粘連及多種軟組織的修復(fù)。
[0080]實(shí)施例7、
[0081]步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，清洗干凈；
[0082]步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于75%乙醇溶液中2h，生理鹽水清洗4次；
[0083]步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中(所述高滲溶液為IM NaCl與0.1OM NaOH的混合溶液)室溫震蕩0.5h后，迅速純化水清洗，再采用純化水室溫震蕩0.5h ;重復(fù)3次，制備獲得羊膜層；
[0084]步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后上皮面(光滑面)朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，厚度約為ΙΟ.Ομπι，-20°C下預(yù)凍2h后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥4h。
[0085]步驟五、緩釋層的制備:制備活性因子bFGF的膠原溶液，其濃度為12000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速_20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥6h。最終制備得到生物緩釋羊膜。
[0086]步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
[0087]本實(shí)施例制備的生物羊膜厚度約為20.0 μ m，產(chǎn)品操作方便、植入后不易滑動(dòng)脫落、免疫原性低，可應(yīng)用肌腱、神經(jīng)等 組織的防粘連及多種軟組織的修復(fù)。
【權(quán)利要求】
1.一種生物羊膜，其特征在于:具有三層結(jié)構(gòu)，自上而下依次有緩釋層、羊膜層和膠原層，緩釋層是由膠原蛋白和生物活性因子組成；羊膜層為經(jīng)過脫細(xì)胞處理的羊膜；膠原層是膠原蛋白；三層之間通過冷凍干燥復(fù)合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物羊膜，其特征在于:緩釋層為0.5~1.0 μ m;羊膜層為10.0 ~50.0 μ m。
3.—種生物羊膜的制備方法，其特征在于，其方法步驟如下: 步驟一、原料預(yù)處理:將新鮮羊膜去除表面血污，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水或純化水清洗干凈； 步驟二、病毒滅活:將步驟一的羊膜，室溫25°C，浸泡于75%乙醇溶液中I~3h，或浸泡于0.1%~0.5%過氧乙酸溶液中10~30min,再用純化水清洗3~5次； 步驟三、脫細(xì)胞處理:將步驟二的羊膜，室溫25°C，置于高滲溶液中震蕩0.5~3h后，用純化水清洗干凈；再采用純化水震蕩0.5~3h。重復(fù)I~5次，獲得羊膜層； 所述高滲溶液為IM~5M NaCl與0.01M~0.5M NaOH的混合溶液； 步驟四、膠原層的制備:將步驟三制得的羊膜層清洗后的光滑面上皮面朝下置于尺寸與羊膜大小一致的容器底部，加入膠原蛋白溶液，-20°C下預(yù)凍2h后.放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥4~8h ; 步驟五、緩釋層的制備:制備具有抑制炎癥、促進(jìn)傷口愈合的活性因子bFGF、EGF的一種或兩種因子混合的膠原溶液，兩種活性因子的濃度范圍均為2000ng/ml~20000ng/ml，通過超聲霧化噴涂方式將活性溶液噴涂在羊膜的上皮面，迅速-20°C預(yù)凍2h后冷凍干燥6 ~12h。 步驟六、滅菌:將步驟五制備得到的生物羊膜經(jīng)過裁剪包裝后，進(jìn)行鈷60輻照滅菌。
【文檔編號(hào)】A61L31/04GK103520780SQ201310508091
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】李晶 申請(qǐng)人:陜西瑞盛生物科技有限公司