本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，具體屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hummanamnion-derivedmesenchymalstemcells，hamscs)是從娩出的胎盤附屬物羊膜中分離而得，具有部分胚胎干細(xì)胞的特征，表達(dá)oct4、nanog、sox2等胚性標(biāo)志分子，可分化為三個胚層不同類型的細(xì)胞；且因來源豐富，原為廢棄物，倫理爭議小，羊膜中所含羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量級高，為再生醫(yī)學(xué)的一種新細(xì)胞資源。研究表明，采用經(jīng)典的體外誘導(dǎo)方案或移植到損傷的組織器官，hamscs不但可分化為心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞等，還具有免疫原性低、不表達(dá)cd80、cd86及hla-dr等共刺激分子的優(yōu)點，并可分泌多種活性因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促進(jìn)血管生成，改善微環(huán)境等作用，對肝腎損傷、心肌梗死、糖尿病及神經(jīng)元退行性疾病和多種自身免疫性疾病等都具有明顯治療作用，具有誘人的臨床應(yīng)用前景。目前國內(nèi)外報道了多種誘導(dǎo)hamscs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，諸如化學(xué)誘導(dǎo)法、細(xì)胞因子誘導(dǎo)法、細(xì)胞共培養(yǎng)法、中藥誘導(dǎo)法等。這些方法都需要加用生長因子誘導(dǎo)。因此，研究一種通過單分子誘導(dǎo)劑能高效率誘導(dǎo)hamscs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法，顯得尤為必要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，能夠在體外高效誘導(dǎo)hamscs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。
為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制；(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)；(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增；(5)hamscs表型檢測；(6)hamscs誘導(dǎo)分化。
前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制，具體為：取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和0.6ml～2mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液。
優(yōu)選地，前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和2mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液。
前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制，具體為：取hg-dmem加入淫羊藿次苷ⅱ母液或淫羊藿次苷ⅱ母液和dmso配制成1μmol/l～10μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，取100mlhg-dmem加入300μl淫羊藿次苷ⅱ母液配制成3μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)，具體為：按照專利號為2011100809686的發(fā)明專利所述方法進(jìn)行培養(yǎng)。本申請中分離和原代培養(yǎng)的方法，通過采用特定的酶消化濃度以及消化時間，使得hamscs的分離與原代培養(yǎng)效果最佳。
前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，具體為：待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％～90％，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％胰酶，蓋過細(xì)胞即可，消化2～3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，予加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)。
前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(5)hamscs表型檢測，具體為：取融合率80％以上的第3代和第4代hamscs，加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率。從而可以確認(rèn)該細(xì)胞為hamscs細(xì)胞。
前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(6)hamscs誘導(dǎo)分化，具體為：取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁50％～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，加入含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔60小時換液，誘導(dǎo)21天，即得。
為了確保本發(fā)明方法的科學(xué)、合理，發(fā)明人進(jìn)行了相應(yīng)的實驗研究和篩選，才得以確定本發(fā)明的技術(shù)方案。具體實驗內(nèi)容如下：圖1是本申請的誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法流程示意圖。按照圖1中步驟進(jìn)行相關(guān)實驗。
本申請中所用試劑和儀器為：淫羊藿次苷ii(純度99.1％)：上海澤朗醫(yī)藥技術(shù)有限公司，pbs磷酸鹽緩沖液：北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，l-dmem/f12：hyclone公司，h-dmem：hyclone公司，胎牛血清：hyclone公司，l-谷氨酰胺：gibco公司，dmso：北京索萊寶科技有限公司，抗gfap抗體：cellsignalingtechnology公司，抗map-2抗體(ab32454)：abcam公司，抗neun抗體(ab104225)：abcam公司，抗nse抗體(ab53025)：abcam公司，用于流式細(xì)胞抗體：bd公司，抗兔抗體(alexafluor488標(biāo)記)：cellsignalingtechnology公司，抗鼠抗體(alexafluor594標(biāo)記)：cellsignalingtechnology公司，-80℃冰箱：thermo公司，離心機(jī)：eppendorf公司，分析天平：sartorius公司，倒置相差顯微鏡：olympus公司，熒光顯微鏡：olympus公司。
一、實驗過程。
1、淫羊藿次苷ⅱ母液配制
(1)淫羊藿次苷ⅱ母液1：取淫羊藿次苷ⅱ0.001g和dmso2ml，混勻后在-20℃保存。
(2)淫羊藿次苷ⅱ母液2：取淫羊藿次苷ⅱ0.001g和dmso600μl，混勻后在-20℃保存。
2、誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制
取100mlhg-dmem加入300μl淫羊藿次苷ⅱ母液2，配制成10μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
取100mlhg-dmem加入300μl淫羊藿次苷ⅱ母液1，配制成3μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
取100mlhg-dmem加入30μl淫羊藿次苷ⅱ母液2和270μldmso，配制成1μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
3、hamscs的分離與原代培養(yǎng)
按照專利號2011100809686的發(fā)明專利所述方法進(jìn)行。具體為：無菌條件下從胎盤組織上機(jī)械分離羊膜，用d-pbs沖洗殘留血跡。無菌操作臺內(nèi)將新鮮羊膜放入到無菌方盤中，用載玻片輕輕刮除羊膜上殘留的血塊，將羊膜剪成1×1cm2大小的組織塊，放入50ml離心管中，按體積比1:1比例加入質(zhì)量濃度為0.05％的胰酶，37℃恒溫?fù)u床水浴消化40min，倒入200目細(xì)胞網(wǎng)過濾，棄去濾液。加入質(zhì)量濃度為0.05％的胰酶再次消化40min，倒入200目濾網(wǎng)過濾。將濾網(wǎng)上的殘留組織按體積比為1:1的比例加入含0.075mg/mldnasei的0.75mg/mlⅱ型膠原酶，37℃恒溫?fù)u床水浴消化90min，將消化好的組織倒入200目細(xì)胞網(wǎng)過濾。收集濾液，1500rpm離心10min，去上清，加入含血清的lg-dmem/f12培養(yǎng)基吹打混勻，種在t75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天更換培養(yǎng)基。
4、hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增
待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％-90％時，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％的胰酶(t75培養(yǎng)瓶加入6ml，t25培養(yǎng)瓶加入2ml)消化2-3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入15ml離心管中，于離心機(jī)中在1500rpm條件下離心10min，小心棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)中，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長與形態(tài)。
5、hamscs細(xì)胞表型檢測
取融合率80％左右的第3至第4代hamscs，按試劑盒說明書加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
6、hamscs誘導(dǎo)分化
取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％的胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁約50～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，分別加入含體積濃度為0.3％的dmso的1μmol/l、3μmol/l、10μmol/l的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基及含體積濃度為0.3％的dmso溶劑對照培養(yǎng)基1ml培養(yǎng)，隔60小時量換液，誘導(dǎo)21天。
7、hamscs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征與特有標(biāo)志鑒定
培養(yǎng)細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后21天進(jìn)行免疫熒光染色，檢查神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特有標(biāo)志物，鑒定步驟如下：(1)吸出板中誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入pbs小心清洗2次，每次3min。(2)予以質(zhì)量濃度為4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗玻片3次，每次3min。(3)體積濃度為0.4％的tritonx-100(pbs稀釋)室溫通透15min，pbs浸洗玻片3次，每次3min。(4)吸干pbs，滴加質(zhì)量濃度為3％的bsa于37℃溫箱封閉30min。(5)吸掉封閉液，不洗，其中一組滴加pbs稀釋的兔來源抗neun(1:1000)抗體、小鼠來源抗gfap(1:200)抗體，其他組分別加入兔來源抗map-2(1:1000)抗體、抗nse(1:800)抗體，放入濕盒，4℃冰箱孵育過夜。(6)第二天pbs浸洗爬片3次，每次3min，吸干爬片上多余液體后，避光滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育30min，pbs浸洗切片3次，每次3min。(7)滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)避光孵育5min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，pbs浸洗切片4次，每次3min洗去多余的dapi。(8)吸干爬片上的液體，用pbs稀釋的50％甘油封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
二、實驗結(jié)論
1、hamscs的形態(tài)學(xué)與表型檢測
圖2是hamscs的形態(tài)圖。如圖2所示。原代培養(yǎng)48h，可見大量梭形細(xì)胞貼壁生長和少量形態(tài)不規(guī)則細(xì)胞，5-7天傳代，培養(yǎng)至第3代hamscs形態(tài)呈現(xiàn)均一的梭型、漩渦樣排列生長，2～3天傳代一次。
流式細(xì)胞術(shù)分析hamscs免疫表型結(jié)果顯示，第3、4代hamscs均高表達(dá)cd44、cd73、cd105、cd90，不表達(dá)cd34、cd45、cd11b、cd19、hla-dr。如圖3所示。從而可以確認(rèn)該細(xì)胞為hamscs細(xì)胞。研究表明，hamscs在體外經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)后能保持間充質(zhì)干細(xì)胞的外顯和遺傳特性,并且未見染色體核型異常改變。本次申請中實驗需要細(xì)胞量較大，為避免不同樣本間差異，通過傳代提供足夠的細(xì)胞，因此本申請中選用傳至第4代hamscs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。
2、hamscs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征與特有標(biāo)志鑒定
細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：hamscs在分別加入1、3、10μmol/l的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)神經(jīng)元分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)第2天開始，倒置相差顯微鏡下可見，個別細(xì)胞的突觸樣結(jié)構(gòu)即已可見，隨著時間的延長，至第5天時，已可見80％左右細(xì)胞具有典型突觸樣結(jié)構(gòu)，呈神經(jīng)元細(xì)胞的典型分支結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的數(shù)量和結(jié)構(gòu)持續(xù)保持至第21天，85％的細(xì)胞形態(tài)成胞體扁平狀或碩型，多形性，有多個較長突起形成，甚至突起間交叉連接。最長可達(dá)28天，保持穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。圖4是誘導(dǎo)分化后21天的細(xì)胞形態(tài)圖。
細(xì)胞免疫熒光染色：培養(yǎng)至21天時，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)neun，胞漿表達(dá)nse，細(xì)胞突起map-2陽性，僅少數(shù)細(xì)胞(低于10-15％的)同時表達(dá)gfap。其中以3μmol/l淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基組表達(dá)最為明顯。如圖5～圖8所示。
本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明提供的一種誘導(dǎo)hamscs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，能夠在體外高效誘導(dǎo)hamscs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。本發(fā)明的方法無需加用生長因子誘導(dǎo)，僅應(yīng)用淫羊藿次苷ⅱ即可誘導(dǎo)hamscs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，是一種通過單分子誘導(dǎo)劑高效誘導(dǎo)hamscs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法。采用本發(fā)明方法，第5天至21天，即可使hamscs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)中保持神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較長時間。分化后的細(xì)胞具有典型的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)特征，大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)neun、nse、map-2等神經(jīng)細(xì)胞特有標(biāo)志物，表明淫羊藿次苷ⅱ可高效誘導(dǎo)hamscs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。本發(fā)明方法具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率高的特點。該方法的建立可為神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性疾病的細(xì)胞移植治療、神經(jīng)組織工程技術(shù)提供一種簡便、高效的誘導(dǎo)方法。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的本申請的誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法流程示意圖；
圖2是hamscs的形態(tài)圖(40×)；
圖3是流式細(xì)胞術(shù)分析hamscs免疫表型圖；
圖4是誘導(dǎo)分化后21天的細(xì)胞形態(tài)圖；
圖5是誘導(dǎo)分化后21天細(xì)胞neun表達(dá)免疫熒光圖(200×)；
圖6是誘導(dǎo)分化后21天細(xì)胞nse表達(dá)免疫熒光圖(200×)；
圖7是誘導(dǎo)分化后21天細(xì)胞map-2表達(dá)免疫熒光圖(200×)；
圖8是誘導(dǎo)分化后21天細(xì)胞gfap表達(dá)免疫熒光圖(200×)；
圖中附圖標(biāo)記的含義：圖2：a-原代培養(yǎng)hamscs，b-培養(yǎng)第三代hamscs；圖3：a-cd44，b-cd90，c-cd105，d-cd73，e-yin；圖4：a-原代hamscs細(xì)胞形態(tài)(40×)，b-傳至第3代hamscs的細(xì)胞形態(tài)(40×)，c-誘導(dǎo)分化21天細(xì)胞形態(tài)(100×)。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的介紹。
實施例1
一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：
(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和0.6mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液；
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：取hg-dmem加入淫羊藿次苷ⅱ母液配制成1μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)：按照專利號為2011100809686的發(fā)明專利所述方法進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增：充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，具體為：待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％～90％，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％胰酶，蓋過細(xì)胞即可，消化2～3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)；
(5)hamscs表型檢測：取融合率80％以上的第3代和第4代hamscs，加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率；
(6)hamscs誘導(dǎo)分化：取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁50％～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，加入含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔60小時換液，誘導(dǎo)21天，即得。
實施例2
一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：
(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和0.6mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液；
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：取hg-dmem加入淫羊藿次苷ⅱ母液和dmso配制成10μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)：按照專利號為2011100809686的發(fā)明專利所述方法進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增：充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，具體為：待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％～90％，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％胰酶，蓋過細(xì)胞即可，消化2～3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)；
(5)hamscs表型檢測：取融合率80％以上的第3代和第4代hamscs，加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率；
(6)hamscs誘導(dǎo)分化：取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁50％～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，加入含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔60小時換液，誘導(dǎo)21天，即得。
實施例3
一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：
(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和2mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液；
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：取100mlhg-dmem加入300μl淫羊藿次苷ⅱ母液配制成3μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)：按照專利號為2011100809686的發(fā)明專利所述方法進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增：充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，具體為：待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％～90％，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％胰酶，蓋過細(xì)胞即可，消化2～3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)；
(5)hamscs表型檢測：取融合率80％以上的第3代和第4代hamscs，加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率；
(6)hamscs誘導(dǎo)分化：取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁50％～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，加入含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔60小時換液，誘導(dǎo)21天，即得。
實施例4
一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：
(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和1.5mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液；
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：取hg-dmem加入淫羊藿次苷ⅱ母液配制成5μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)：按照專利號為2011100809686的發(fā)明專利所述方法進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增：充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，具體為：待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％～90％，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％胰酶，蓋過細(xì)胞即可，消化2～3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)；
(5)hamscs表型檢測：取融合率80％以上的第3代和第4代hamscs，加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率；
(6)hamscs誘導(dǎo)分化：取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁50％～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，加入含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔60小時換液，誘導(dǎo)21天，即得。
實施例5
一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：
(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和0.8mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液；
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：取hg-dmem加入淫羊藿次苷ⅱ母液和dmso配制成8μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)：按照專利號為2011100809686的發(fā)明專利所述方法進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增：充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，具體為：待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％～90％，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％胰酶，蓋過細(xì)胞即可，消化2～3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)；
(5)hamscs表型檢測：取融合率80％以上的第3代和第4代hamscs，加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率；
(6)hamscs誘導(dǎo)分化：取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁50％～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，加入含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔60小時換液，誘導(dǎo)21天，即得。
實施例6
一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：
(1)淫羊藿次苷ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷ⅱ和2mldmso，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷ⅱ母液；
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：取100mlhg-dmem加入300μl淫羊藿次苷ⅱ母液配制成3μmol/l含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)hamscs的分離與原代培養(yǎng)：按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行hamscs的分離與原代培養(yǎng)；
(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增：充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法中，步驟(4)hamscs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，具體為：待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％～90％，棄去培養(yǎng)基，用pbs清洗2次，加入質(zhì)量濃度為0.125％胰酶，蓋過細(xì)胞即可，消化2～3min，待貼壁細(xì)胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，用1ml移液槍輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)；
(5)hamscs表型檢測：取融合率80％以上的第3代和第4代hamscs，加入熒光標(biāo)記的抗人單抗cd44-pe、cd90-fitc、cd105-percp-cy5.5、cd73-apc、cd34-pe、cd45-pe、cd11b-pe、cd19-pe、dr-pe及相應(yīng)的同型對照，混勻，避光孵育，pbs洗滌后，加入4％多聚甲醛固定，bdcalliber流式細(xì)胞儀采集不少于1×105個細(xì)胞，cellquest軟件分析hamscs上述cd分子的百分率；
(6)hamscs誘導(dǎo)分化：取傳至第4代hamscs，pbs清洗2次，予以質(zhì)量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個/ml，傳代接種于植入tc處理細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，加入含血清lg-dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁50％～60％時，吸去lg-dmem/f12培養(yǎng)基，pbs洗2次，加入含體積濃度為0.3％的dmso的淫羊藿次苷ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔60小時換液，誘導(dǎo)21天，即得。